Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2020, T. 37, № 5, стр. 396-400

ВВЕДЕНИЕ

Многочисленные экспериментальные данные в настоящее время указывают на то, что нормальное функционирование митохондрий эукариот, включая высшие растения, в значительной степени зависит от физических контактов этих органелл с другими клеточными органеллами, в особенности с мембранами эндоплазматического ретикулума (ЭР), пероксисомами и вакуолями [1–6]. Участки контактов разных типов органелл, получившие название “мембранных контактных сайтов” (МКС), в последние годы интенсивно изучаются [7]. Так, в исследованиях на клетках человека установлен факт значительного содержания в составе МКС стеринов, что позволяет отнести их к так называемым “рафтовым структурам” или “рафтам” [2]. Рафтами принято называть небольшие (10–200 нм), высоко динамичные, обогащенные стеринами и сфинголипидами мембранные домены, принимающие участие, в зависимости от типа контактирующих органелл, в регуляции функций мембранных каналов, импорте липидов, доставке белков из аппарата Гольджи в плазматическую мембрану, внутриклеточной передаче Ca²⁺-сигналов, эндоцитозе и некоторых других процессах [8]. Если в отношении липидного состава рафтов мембран разного происхождения значительных различий не обнаружено, то белковый состав рафтов, определяющий их функциональную роль, зависит от типа органелл, из мембран которых рафты были выделены [9].

Общепризнано, что одним из важных условий нормального функционирования митохондрий растений является наличие у них мембранных систем транспорта макромолекул (белков, тРНК и ДНК) [10, 11]. Предполагается, что природная способность митохондрий растений к импорту ДНК [11, 12] может иметь прямое отношение к горизонтальному переносу генов в эти органеллы, происходящему со значительно более высокой частотой, чем в ядерный и хлоропластный геномы. Однако в целом, в отличие от импорта белков и тРНК, детальных сведений о биологической роли и мембранном механизме импорта ДНК в митохондрии растений пока не существует.

Ранее нами было обнаружено стимулирующее влияние мембран ЭР на импорт ДНК в изолированные митохондрии растений [13]. Целью данной работы было изучить влияние вакуолярной мембраны и выделенных из нее рафтов на активность импорта ДНК в митохондрии картофеля (Solanum tuberosum).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение митохондрий из клубней картофеля (Solanum tuberosum) осуществляли, как описано в работе [14]. Содержание белка определяли по методу Бредфорда [15]. В качестве субстрата импорта в митохондрии использовали фрагмент ДНК размером 717 п.н., включающий в себя последовательность гена GFP. Для получения митопластов наружную мембрану митохондрий разрушали с помощью осмотического шока: осадок митохондрий ресуспендировали в 1 мл 5 мМ фосфата калия, pH 7.5, инкубировали на льду 5 мин, затем осаждали и промывали в буфере, содержащем 0.3 М сахарозу.

Импорт ДНК в митохондрии проводили согласно описанному ранее протоколу [16]. Инкубацию митохондрий (200 мкг белка в одной пробе) с ДНК проводили в стандартных условиях (25°С при постоянном мягком покачивании) в течение 40 мин в 20 мкл буфера импорта (0.4 М сахарозы, 40 мМ фосфата калия, рН 7.0). Для инкубации с митохондриями рафты и фракцию вакуолярных мембран добавляли в количестве 5 мкг. После инкубации митохондрии дважды отмывали от избытка ДНК в среде инкубации, затем ресуспендировали в исходном объеме буфера импорта и добавляли ДНКазу I (1 ед. акт./проба) (Thermo Scientific) и хлорид магния до конечной концентрации 10 мМ. ДНКазную обработку проводили в течение 20 мин при 25°С, отмывали от ДНКазы центрифугированием и проводили экстракцию нуклеиновых кислот. Для выделения тотальной ДНК из митохондрий использовали метод термообработки изолированных митохондрий, как описано в [16]. Анализ активности импорта ДНК в митохондрии проводили с использованием метода мультиплексной количественной ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) и программного обеспечения CFX 96 (BioRad). Активность импорта, определяемая как количество чужеродной ДНК, поглощенной митохондриями за фиксированный период времени, оценивали в условных единицах, полученных нормированием в каждом образце показателей уровней амплификации гена GFP (GenBank: U73901.1) и митохондриального гена СOX2 (GenBank: DQ185064.1) (табл. 1).

Вакуолярные мембраны получали из находящихся на стадии покоя корнеплодов столовой свеклы (Веta vulgaris L.) методом [17]. Чистоту мембранных фракций оценивали при помощи таких специфических ингибиторов H⁺-АТP-аз F-, P- и V-типа, как азид натрия, ванадат натрия и бафиломицин. Рафты выделяли по методу [18]. Материал, полученный после высокоскоростного центрифугирования, делили на зоны. В экспериментах использовали везикулы вакуолярной мембраны и зону, которая, как нами ранее установлено [18], содержала рафты.

Используемые фракции перед экспериментами промывали буферным раствором, содержащим 300 мM сахарозу, 10 мM фосфат калия, 1 мM EDTA, 5 мM глицин (pH 7.5) и осаждали центрифугированием при 100 000 g.

Статистическую обработку результатов проводили с применением программы SigmaPlot 12.5. Полученные данные представлены в виде среднего арифметического ± стандартное отклонение. Для доказательства наличия значимых различий между средними проводили анализ с использованием t-критерия Стьюдента. Различия между экспериментальными данными считали статистически значимыми при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Нами установлено, что добавление рафтовых структур тонопласта в систему митохондриального импорта ДНК приводило к существенному (в 8 раз) увеличению активности импорта ДНК в эти органеллы по сравнению с эффектом вакуолярной мембраны, из которой они были выделены (рис. 1). Мы полагаем, что при добавлении рафтов к митохондриальной суспензии создаются условия в некоторой степени аналогичные условиям in vivo, при которых формируются МКС между митохондриями и вакуолями. Одним из вероятных последствий, происходящих при этих структурных изменениях наружной и внутренней митохондриальных мембран, может быть активация работы мембранных каналов, обеспечивающих перенос молекул ДНК в эти органеллы. Ранее экспериментально продемонстрировано существование МКС между митохондриями и вакуолями [6]. Из полученных в данной работе результатов следует, что ключевую роль в формировании контактных сайтов между митохондриями и тонопластом играют, по-видимому, компоненты наружной мембраны митохондрий, поскольку присутствие рафтов в среде инкубации оказывало активирующий эффект только на импорт ДНК в митохондрии, но не в митопласты (митохондрии, лишенные наружной мембраны) (рис. 1).

Рис. 1.

Влияние рафтов тонопласта и вакуолярной мембраны на активность импорта ДНК в митохондрии (а) и митопласты (б). Условные обозначения: митохондрии – контроль; митохондрии + Р-тон – митохондрии + рафты тонопласта; тон – митохондрии + тонопласт; митопласты + Р-тон – митопласты + рафты тонопласта. *p < 0.05, M± SD, n = 3.

Важно отметить, что существует определенное сходство в механизмах импорта стеринов и ДНК в митохондрии, состоящее в участии в этих процессах таких переносчиков, как порин (VDAC) наружной митохондриальной мембраны и адениннуклетидтранслоказа (ANT) внутренней митохондриальной мембраны [12, 19, 20]. В случае импорта стеринов установлено, что в состав транспортного комплекса помимо VDAC и ANT входит периферический бензодиазепиновый рецептор (PBR), именуемый в последнее время транслокаторным белком TSPO [20, 21]. Ранее уже высказывалась гипотеза о важной роли PBR/TSPO в импорте ДНК в митохондрии животных [22]. В связи с этим нельзя исключать, что такие компоненты рафтов, как стерины могут выступать в качестве активатора субстратного типа при работе транспортосомного комплекса PBR/TSPO-VDAC-ANТ в данном случае в отношении импорта ДНК в митохондрии.

Ранее показано, что предшественник β-субъединицы ATP-синтазы принимает участие в переносе ДНК через наружную мембрану митохондрий [11]. В составе многочисленных белков рафтов тонопласта содержится также и β-субъединица ATP-синтазы [23]. Таким образом, данный белок мог также служить одним из факторов, вызывающих эффект активации импорта ДНК в митохондрии.

Примечательно, что добавление к митохондриям собственно вакуолярной мембраны не оказывало какого-либо влияния на импорт ДНК (рис. 1а). Это можно объяснить тем, что тонопласт и его рафты мы вносили в систему митохондриального импорта ДНК in organello в равных по содержанию белка количествах. Однако очевидно, что в рафтах тонопласта липиды и белки, оказывающие влияние на мембранный механизм импорта ДНК, содержатся в существенно бóльшем количестве, чем в тонопласте.

Таким образом, в настоящей работе впервые установлено, что в системе in organello добавление рафтов тонопласта вызывает значительное возрастание активности импорта ДНК в митохондрии Solanum tuberosum. Обнаруженный эффект, по-видимому, связан с активирующим влиянием структурных компонентов рафтов на работу транспортных систем митохондрий, которые задействованы в импорте ДНК. Важно подчеркнуть, что в случае добавления рафтов к митохондриям, лишенным наружной мембраны, активации импорта ДНК в органеллы не наблюдалось (рис. 1б), что указывает на необходимость наружной мембраны для проявления обнаруженного эффекта. Выяснение молекулярной природы активации митохондриального импорта ДНК в присутствии рафтов требует проведения дополнительных исследований.

Работа выполнена с частичным использованием средств грантов МК-6666.2020.11, РФФИ № 18-04-00603 и 19-04-00013 на оборудовании ЦКП “Биоаналитика” Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (г. Иркутск).