Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2020, T. 37, № 6, стр. 426-433

ВВЕДЕНИЕ

Влияние L-аргинина, доноров NO и ингибиторов Ca²⁺-зависимой изоформы митохондриальной NO-синтазы (mtNOS) на кальциевую емкость митохондрий (CRC), индукцию митохондриальной поры (MPTP), высвобождение цитохрома C (CytC) изучается более 25 лет. Полученные за этот период результаты исследований противоречивы. Так, еще в 1999 году было показано, что активация mtNOS Ca²⁺ и L-аргинином вызывает высвобождение CytC, в то время как ингибирование mtNOS уменьшает выход CytC, повышает митохондриальный потенциал (ΔΨ_m) и CRC [1]. Позже было обнаружено, что NO вызывает концентрационно-зависимые эффекты [2]. Было показано, что очень низкие или высокие концентрации NO-доноров способствуют набуханию митохондрий, высвобождению CytC и открытию MPTP, индуцированному избытком ионов кальция. И наоборот, промежуточные концентрации доноров NO обеспечивают защитные эффекты, уменьшая набухание митохондрий и вероятность открытия поры. Защитные и неблагоприятные воздействия доноров NO объясняли возможным действием S-нитрозотиолов и пероксинитрита, соответственно [1, 2].

Неоднозначные эффекты доноров NO на открытие MPTP также наблюдались в экспериментах, выполненных на клетках. Было показано, что малые концентрации доноров NO уменьшают накопление митохондриального Cа²⁺, а высокие концентрации, наоборот, способствуют выходу Cа²⁺ и открытию MPTP [3]. В этих экспериментах добавленный L-аргинин ингибировал поглощение Ca²⁺ митохондриями и предотвращал открытие MPTP [2, 4]. Авторы предположили, что внутримитохондриальный NO может быть вовлечен в отрицательную обратную связь, предотвращающую открытие MPTP за счет ингибирования транспорта Ca²⁺ [3]. Согласно другой точке зрения, уменьшение поглощения Ca²⁺ может быть обусловлено деполяризацией митохондрий, вызываемой NO [5].

Представленные выше противоречивые эффекты доноров NO и L-аргинина на ΔΨ_m и контроль MPTP не могут быть объяснены действием механизмов, основанных только на редокс-регуляции митохондриальных процессов S-нитрозилированием [6, 7] и S-глутатионированием [8–11] различных белков. Потенциальные механизмы защиты могут включать внутримитохондриальные сигнальные цепи, учитывающие взаимодействие кальция и NO и другие, пока неизвестные обратные связи. Недавно Seya и соавторы обнаружили, что митохондриальная фракция сердца обладает активностью cGMP-зависимой протеинкиназы G (PKG) [12]. Продукция cGMP митохондриальной гуанилатциклазой (GC) также была продемонстрирована этой группой [13]. Было показано, что SNAP и 8-Bromo-cGMP способствуют кальций-зависимому высвобождению CytC из митохондрий сердца, вовлекая потенциал-зависимый анионный канал (VDAC) в качестве конечной мишени сигнального пути. Наблюдаемые эффекты предотвращались применением ингибиторов NOS, GC, PKG и VDAC. Гидролиз cGMP митохондриальной фосфодиэстеразой циклических нуклеотидов PDE2A также был продемонстрирован в митохондриях мозга и печени в независимых экспериментах [14]. Эти данные указывают на то, что митохондрии содержат все элементы автономной Ca²⁺-зависимой сигнальной системы: Ca²⁺ → mtNOS → NO → → GC → cGMP → PKG (mtNOS/GC/PKG-SS), которая может участвовать в регуляции митохондриального дыхания [15] и MPTP.

В данной работе были проведены эксперименты на изолированных митохондриях печени крысы, в которых анализировалось влияние агонистов и ингибиторов mtNOS/GC/PKG-SS на диссипацию ΔΨ_m и индукцию МРТР, вызываемые избытком Ca²⁺ или пальмитоилкарнитина (PC). Предварительные результаты были опубликованы ранее [16].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Все процедуры на животных выполнялись в соответствии с директивой ЕС 86/609/EEC и были одобрены комитетом по этике Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН. Самцов крыс линии Вистар (6–8 недель) содержали в одинаковых условиях в кондиционированных и проветриваемых помещениях при температуре 20–22°C (свет/темнота = 12 ч/12 ч). Эксперименты проводили при 26°C. Митохондрии печени выделяли с использованием стандартных методик дифференциального центрифугирования в среде, содержащей 300 мМ сахарозы, 1 мМ EGTA и 10 мМ Трис-HCl (pH 7.4). Митохондриальные препараты дважды промывали средой выделения, не содержащей EGTA, ресуспендировали в среде того же состава и хранили на льду. Инкубационная среда для митохондрий содержала: 125 мМ KCl, 3 мМ KH₂PO₄, 10 мМ HEPES (pH 7.4), 1 мМ MgCl₂. Содержание митохондриального белка определяли методом Лоури с бычьим сывороточным альбумином в качестве стандарта. Разность электрических потенциалов (ΔΨ_m) на внутренней мембране митохондрий определяли по распределению липофильного катиона тетрафенилфосфония (ТРР⁺), концентрацию которого во внешней среде [ТРР⁺]_out регистрировали с помощью ТРР⁺-селективного электрода. Измерение концентрации кальция в среде производили с использованием Ca²⁺-селективного электрода (Nico, Москва, Россия). Все эксперименты проводили в закрытой или открытой кювете объемом 1 мл, содержащей 1.0 мг мит. белка, при постоянном перемешивании. В качестве субстратов дыхания использовали L-глутамат (10 мМ) и пируват (1 мМ) для поддержания полного оборота цикла Кребса и сохранения субстратного фосфорилирования в цикле. В некоторых экспериментах дыхание митохондрий поддерживалось окислением сукцината (5 мМ) в присутствии ротенона (1–2 мкМ) или пирувата (1 мМ) и L-малата (5 мМ). Все эксперименты выполнялись в присутствии 10 ед. гексокиназы, 10 мМ глюкозы и 1 мМ MgCl₂. Последующие добавки 0.75 мМ ADP обеспечивали высокую стационарную скорость дыхания (VO_2SS), которая была близка к максимальной скорости дыхания, наблюдающейся в Состоянии 3 (VO_2SS = 80–85% от VO_2max (V₃)). Часть экспериментов была выполнена при низкой скорости дыхания митохондрий, в отсутствие гексокиназы и ADP в среде (Состояние 4, V₄). Скорость набухания митохондрий (V_SW = Δ o.d./мин) определялась в открытой кювете объемом 2 мл при 0.35 мг. мит. белка на 1 мл с использованием спектрофотометра Ocean Optics USB4000. Открытие MPTP регистрировали как: выход кальция из митохондрий в инкубационную среду; диссипацию митохондриального потенциала ΔΨ_m; набухание митохондрий. Индукция MPTP достигалась путем последовательных добавок в инкубационную среду 20 мкМ Ca²⁺ (CaCl₂) или 20 мкМ PC. Критические концентрации Ca²⁺ или PC, необходимые для индукции поры, представляют митохондриальную кальциевую буферную емкость (CRC) и пороговую концентрацию PC (PC*). Величины этих параметров характеризуют чувствительность комплекса МРТР к действию различных модуляторов поры. Влияние mtNOS/PKG-SS на открытие MPTP оценивали путем определения значений CRC, PC* и V_SW, соответственно. Активацию mtNOS-SS обеспечивали введением в среду инкубации L-аргинина, NO доноров или Ca²⁺. 7-NI, ODQ и KT5823 были использованы для ингибирования mtNOS, GC и PKG соответственно. В работе использованы реактивы фирмы “Sigma” (США). Статистический анализ экспериментальных данных проводился с использованием t-критерия с использованием SigmaPlot 11. Данные представлены как среднее значение ± S.E.M. n = 4–6 независимых экспериментов. За уровень значимости было принято p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Индукция МРТР избытком кальция и защитные эффекты L-аргинина. На рис. 1а показано, что при последовательных добавках 20 мкМ Ca²⁺ в контроле CRC составляет 100 мкМ (нижняя кривая). Преинкубация митохондрий с 300 мкМ L-аргинина приводит к увеличению CRC до 180 мкМ. Введение в среду инкубации ингибитора NOS 7NI (100 мкМ) уменьшает величину CRC до 80 мкМ, при достижении которой происходит диссипация ΔΨ_m (рост ТРР⁺ в среде, верхняя кривая). Преинкубация митохондрий с селективным ингибитором iNOS 1400W (50–100 нМ) не влияла на величину CRC, что свидетельствует об отсутствии iNOS в митохондриях в исследуемых условиях.

Рис. 1.

Диссипация ΔΨ_m и индукция МРТР ионами Ca²⁺. Защитный эффект L-аргинина (300 мкМ) и его устранение ингибиторами белков системы mtNOS/GC/PKG-SS: 7NI (а, 100 мкМ), ODQ (б, 100 мкМ) и KT5823 (в, 1.5 мкМ, KT), соответственно. Представлены репрезентативные эксперименты. Митохондрии инкубировали в открытой камере объемом 1 мл. Среда инкубации (см. Материалы и методы) включала 1 мМ пирувата, 10 мМ L-глутамата и гексокиназу. Добавки Ca²⁺ и PC (по 20 мкМ), а также ADP показаны стрелками.

Защитный эффект L-аргинина также устраняется ингибиторами GC (100 мкМ ODQ, рис. 1б, верхняя кривая) и PKG (1.5 мкМ KT5823, рис. 1в, верхние кривые). Из рис. 1в видно, что уменьшение ΔΨ_m (верхняя кривая) сопряжено с выбросом Ca²⁺ из митохондрий (нижние кривые). Видно также, что преинкубация митохондрий с KT5823, селективным ингибитором PKG, уменьшает CRC от 180 до 120 мкм.

Эти данные свидетельствуют о том, что защитный эффект L-аргинина, направленный на уменьшение вероятности индукции поры избытком Ca²⁺, может быть обусловлен функционированием mtNOS/GC/PKG-SS, эффектором которой является PKG. Можно предположить, что наблюдаемый защитный эффект L-аргинина связан с фосфорилированием структурных элементов комплекса белков МРТР с участием PKG.

Влияние скорости дыхания митохондрий на PC-индуцированное открытие MPTP и защитный эффект SNAP. Известно, что скорость продукции NO mtNOS экспоненциально зависит от величины ΔΨ_m и максимальна в Состоянии 4 [17, 18]. Кроме того, хорошо известно, что вероятность открытия поры различными агентами сильно уменьшается при наличии аденилатов, гексокиназы и Mg²⁺ в среде инкубации [19, 20]. Последнее может быть связано со стабилизацией конформации элементов макрокомплекса МРТР, включая транслокатор аденилатов, ATP-синтазу и др. В наших условиях, в присутствии избытка гексокиназы и глюкозы в среде, добавка 0.75 мМ ADP увеличивает скорость дыхания митохондрий от VO₂ = 20–24 нг-атом О/мин/мг (V4, Состояние 4, ADP = 0) до стационарных значений VO_2SS = 70–77 нг-атом О/мин/мг (VO₂ = 80–90% от скорости дыхания в Состоянии 3). Результаты, представленные на рис. 2, показывают, что в митохондриях, находящихся в состоянии активного дыхании (VO_2SS), критические величины PC* в контроле и в присутствии SNAP выше, чем в Состоянии 4 (V4). Сравнение верхних кривых, представленных на рис. 2, показывает, что в митохондриях, находящихся в Состоянии 4 (верхняя линия на рис. 2а), 40 мкм PC вызывает диссипацию ΔΨ_m, тогда как в состоянии с высокой скоростью дыхания (верхняя линия на рис. 2б), критическая концентрация PC* превышает 60 мкМ. В присутствии 20 мкМ SNAP в Состоянии 4 величина PC* увеличивается до 80 мкМ, в то время как при высокой скорости дыхания (VO_2SS) величина PC* составляет 100 мкМ и выше (нижние линии на рис. 2а, 2б).

Рис. 2.

Влияние скорости дыхания митохондрий на диссипацию ΔΨ_m избытком PC и на защитный эффект SNAP. Представлены репрезентативные эксперименты. Инкубационная среда включала 10 мМ L-глутамата и 1 мМ пирувата, а также гексокиназу и глюкозу. Эксперименты, представленные на панели а, проведены в отсутствие ADP в среде (Состояние 4). На панели б высокая скорость дыхания (VO₂ = 80–90% от скорости дыхания в Состоянии 3) обеспечивалась добавками 0.75 мМ ADP. На панелях а и б черные (верхние) линии соответствуют контрольным экспериментам ([SNAP] = 0), а серые линии – опытам, в которых инкубационная среда содержала 20 мкМ SNAP. Добавки Ca²⁺ и PC (по 20 мкМ), а также ADP показаны стрелками.

Диссипация ΔΨ_m, ингибирование дыхания и набухание митохондрий, вызываемые PC. Защитный эффект циклоспорина А. Преинкубация митохондрий с пируватом, L-глутаматом и низкими концентрациями PC (20 мкМ) повышает ΔΨ_m и увеличивает стационарную скорость митохондриального дыхания на 35–40% по сравнению со значениями, достигнаемыми при дыхании митохондрий в присутствии пирувата и L-глутамата (VO_2SS = 85–88 нг-атом О/мин/мг). Напротив, высокие дозы PC (выше 50 мкМ) вызывают быструю диссипацию ΔΨ_m увеличение [TPP⁺] и прогрессирующее угнетение дыхания. Этот процесс развивается вскоре после добавки ADP (рис. 3а, черные линии). Преинкубация митохондрий с CsA предотвращает падение ΔΨ_m, несмотря на сильное подавление дыхания (рис. 3а, серые линии). Помимо диссипации ΔΨ_m и подавления дыхания, PC вызывает набухание митохондрий. Как показано на рис. 3б, низкие концентрации PC (20 мкМ) вызывают набухание митохондрий, которое характеризуется скоростью набухания V_SW = 0.26 Δ o.d./мин (черная кривая). Преинкубация митохондрий с CsA (2 мкМ) предотвращает этот эффект. Вторая добавка 20 мкМ PC приводит к быстрому митохондриальному набуханию, характеризующемуся V_SW = 2.4 Δ o.d./мин (черная кривая). Однако в этом случае CsA обеспечивает ограниченный защитный эффект, уменьшая V_SW в четыре раза до 0.57 Δ o.d./мин и не оказывая влияния на амплитуду набухания (серая кривая). Таким образом, наряду с кальцием PC является важным агентом, вызывающим индукцию MPTP.

Рис. 3.

Избыток PC вызывает диссипацию ΔΨ_m и подавление дыхания (а), а также набухание митохондрий (б). Присутствие циклоспорина A (CsA, 1.5 мкМ) в среде препятствует диссипации ΔΨ_m, набуханию митохондрий и индукции поры (б). Представлены репрезентативные эксперименты. а – Влияние избытка PC (50 мкМ) и CsA (1.5 мкМ) на митохондриальное дыхание (линии O₂) и ΔΨ_m (линии TPP⁺). Инкубационная среда включала 10 мМ L-глутамата и 1 мМ пирувата. Митохондрии инкубировали с PC (черные линии) или с PC и CsA (1.5 мкМ, серые линии). Все остальные условия как на рис. 1. б – Набухание митохондрий, вызываемое добавлением PC в отсутствие (нижние черные линии) и в присутствии CsA (2 мкМ, верхние серые линии) в среде. Максимальные значения скорости набухания (V_SW, выраженные в изменениях ед. оптической плотности/мин; V_SW = Δ o.d./мин) указаны на рисунке. 0.75 мМ ADP добавляли за 1 мин до первого введения PC. Инкубационная среда включала 5 мМ сукцината и 2 мкМ ротенона. Все остальные условия как на рис. 1.

Кальций и активные формы кислорода (АФК) обычно считаются ключевыми медиаторами, участвующими в индукции MPTP и гибели клеток [20, 21]. Однако ишемия/реперфузия и некоторые другие патологические процессы, помимо роста Cа²⁺ и АФК, характеризуются накоплением длинноцепочечных жирных кислот [22, 23] и их карнитиновых производных [23], которые окисляются в митохондриях в виде ацил-КоА. Хорошо известно, что длинноцепочечные ацил-КоА (С14 и выше) ингибируют различные NAD(P)H-зависимые дегидрогеназы [24]. Наши предварительные результаты показали, что PC индуцирует CsA-зависимую диссипацию ΔΨ_m в митохондриях печени [16]. Поэтому в настоящем исследовании для изучения влияния mtNOS/GC/PKG-SS на MPTP в качестве параметров “чувствительности” поры к токсинам были использованы величины CRC и PC*, определяемые при нагрузке митохондрий кальцием и PC.

Влияние модуляции активности mtNOS/GC/ PKG-SS на PC*. Чтобы оценить статистическую достоверность полученных результатов, были определены средние величины PC* в сериях из четырех–шести экспериментов. Рассчитанные средние значения PC* представлены на рис. 4 в виде столбиков. Первый серый столбик соответствует контрольным экспериментам. Влияние SNAP и L-аргинина, а также ингибиторов 7-NI (100 мкМ), ODQ (100 мкМ), KT5823 (1.5 мкМ) и 1400W (100 нМ) на средние величины PC* показано на рис. 4. Видно, что увеличение концентрации SNAP до 100 мкМ (2 и 3 столбики) увеличивает критическое значение PC* до 109.2 ± 8.1 мкМ, что на 28% выше величины PC* в контроле (84.3 ± ± 7.8 мкМ (1 столбик). Сходный защитный эффект вызывает преинкубация митохондрий с 20 мкМ L-аргинина (6 столбик).

Рис. 4.

Влияние модуляции активности mtNOS/GC/PKG-SS на величину PC*. Столбики представляют средние значения величин PC* ± S.E.M, полученные в 4–6 экспериментах при последовательных добавках 20 мкМ PC, подобно тому, как это показано на рис. 1 для Са²⁺. Инкубационная среда такая же, как и на рис. 1. 20 мкМ Ca²⁺ добавляли через 1 мин после активации дыхания 0.75 мМ ADP, затем митохондрии нагружали PC. Концентрации SNAP, L-аргинина (Arg), 7-NI, ODQ, KT5823 (KT) и 1400W приведены в мкМ. n = 4 (столбики 1–3), n = 6 (столбики 4–9). Линии над столбиками показывают сравниваемые пары величин PC*. * p < 0.05.

Видно, что ингибиторы mtNOS/GC/PKG-SS 7-NI, ODQ и KT5823 устраняют защитные эффекты L-аргинина и SNAP, уменьшая критические (пороговые) концентрации PC*, необходимые для индукции поры (рис. 4, столбики 4, 5 и 7, 8), до величин ниже контрольных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, основываясь на результатах, полученных с помощью ингибиторного анализа, можно предполагать участие митохондриальной mtNOS/GC/PKG-SS в регуляции МРТР. Следует отметить, что mtNOS/GC/PKG-SS нельзя рассматривать как избыточный элемент в многоуровневом контроле окислительного фосфорилирования и индукции MPTP. Будучи зависимой от кальция, эта сигнальная система может участвовать в функционировании нескольких петель обратной связи, две из которых направлены на активацию митохондриального дыхания и на уменьшение вероятности индукции MPTP. В этом случае митохондриальная PKG, наряду с цитозольной PKG1, может рассматриваться как конечный эффектор защиты, участвующий в контроле MPTP.

Вклад авторов: ВВД координировал проект и написал рукопись. НИФ и ЕВГ провели эксперименты, проанализировали и обсудили данные. НИФ приняла участие в доработке статьи.

Финансирование. Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 14-04-01695 ВД).

Благодарности. Авторы благодарят М.А. Симонову, М.Х. Галимову и А.И. Сергеева за техническую поддержку.

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.