Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2021, T. 38, № 3, стр. 225-229

Ex vivo мониторинг стимул-зависимой секреции ATP вкусовыми клетками

А. А. Хохлов a, О. А. Рогачевская a*

a Институт биофизики клетки РАН, ФИЦ ПНЦБИ РАН
142290 Пущино, Россия

* E-mail: o.rogachevskaja@gmail.com

Поступила в редакцию 02.12.2020
После доработки 28.12.2020
Принята к публикации 12.01.2021

Полный текст (PDF)

Аннотация

Распознавание вкусовых молекул обеспечивается специализированными рецепторами, функционирующими на рецептирующей апикальной мембране вкусовых клеток, обращенной во вкусовую пору. Вкусовая трансдукция завершается кодированием сенсорной информации в форме стимул-зависимого выброса афферентного нейротрансмиттера, стимулирующего вкусовой нерв. Основным нейромедиатором периферической вкусовой системы является ATP. Синаптическая передача во вкусовых клетках типа II основана не на каноническим Са2+-зависимом экзоцитозном механизме секреции, а обеспечивается Са2+-независимым выбросом ATP через ATP-проницаемые ионные каналы базолатеральной мембраны. Этот процесс изучался на уровне одиночных клеток типа II, и был выявлен ряд закономерностей секреции ATP. Между тем, при исследовании стимул-зависимости выброса ATP на уровне одиночных клеток или изолированных вкусовых почек практически невозможно стимулировать только апикальную мембрану клеток. Поэтому в таких экспериментах существует вероятность неспецифических эффектов вкусовых соединений. Для исследования секреции ATP вкусовыми клетками в условиях физиологически адекватной стимуляции нами разработан экспериментальный подход, основанный на использовании экспериментальной камеры, представляющей собой модификацию камеры Уссинга. Камера состояла из двух перфузируемых отсеков, между которыми зажимался и плотно изолировался фрагмент языкового эпителия, содержащий желобоватый вкусовой сосочек. Вкусовые стимулы подавались через верхний отсек, в который была обращена наружная часть эпителия. Базальная часть вкусовых почек была обращена в нижний отсек, заполняемый люциферин-люциферазной смесью для детекции выброса ATP. Данный подход впервые позволил в режиме реального времени наблюдать выброс ATP вкусовыми клетками в ответ на стимуляцию вкусовыми веществами, доступными только для апикальной мембраны.

Ключевые слова: вкусовой рецепторный эпителий, секреция ATP, люциферин-люциферазный метод

ВВЕДЕНИЕ

Вкусовые рецепторные клетки типа II являются основными хемосенсорными клетками вкусовой почки, специализирующимися в распознавании горького, сладкого и аминокислот. Эти клетки экспрессируют гептаспиральные вкусовые рецепторы (G-protein coupled receptor, GPCR), формирующие два подсемейств T1R и T2R. Эти рецепторы и сопряженные сигнальные системы функционируют на апикальной мембране, которая экспонирована во вкусовую пору и выполняет функцию рецепции вкусового стимула. Согласно современным представлениям [1], трансдукция вкусового сигнала во вкусовых клетках типа II включает следующие основные внутриклеточные события. При связывании молекул вкусовых веществ вкусовые GPCR сопрягаются G-белком с фосфолипазой PLCβ2, которая катализирует гидролиз фосфолипида PIP2, производя два вторичных медиатора: растворимый IP3 и липидный DAG. Далее IP3 стимулирует выброс депонированного Са2+ при участии IP3-рецептора (тип III). Стимул-зависимое повышение внутриклеточного Са2+ обеспечивает активацию Са2+-зависимых катионных каналов TRPM5 базолатеральной мембраны и генерацию деполяризующего рецепторного потенциала. Последний стимулирует потенциал-зависимые Na+-каналы, инициируя генерацию серии потенциалов действия и выброс афферентного нейромедиатора ATP [14].

Внутриклеточный Ca2+ выступает в роли вторичного посредника при передаче сенсорного сигнала и в других сенсорных клетках. Так, в нейронах вомероназального органа GPCR феромонов сопряжены с PLСβ2 (или PLCβ4), и в процессе трансдукции происходит IP3-зависимый выброс депонированного Са2+, ключевым является DAG-зависимый вход наружного Са2+ через DAG-активируемые катионные каналы TRPC2 [5]. Хотя в данном случае именно фосфоинозитидный каскад обеспечивает сопряжение рецепторов феромонов с клеточным ответом, как и во вкусовых клетках, считается, что во вкусовой трансдукции Са2+-сигнализация обеспечивается за счет выброса депонированного Са2+ при пренебрежимо малом вкладе входа наружного Са2+ [1, 4]. Поскольку выделение индивидуальных вкусовых клеток сопряжено с достаточно жесткими ферментативными и механическими воздействиями, можно думать, что сохранение функциональности апикальной мембраны, включая функциональность Ca2+-проницаемых ионных каналов, не идентифицированных до настоящего времени, представляет собой одну из проблем физиологии вкусовых клеток. С этой точки зрения представляется целесообразным выполнять исследования вкусовой трансдукции с использованием не только препаратов диссоциированных вкусовых почек, но и более интегральных препаратов, в которых рецептирующая мембрана и ассоциированные молекулярные структуры более сохранны и функциональны.

Один из таких препаратов был описан в работе [2], в которой для исследования секреции АТР использовалась камера Уссинга [6] для анализа секреции АТР фрагментами языкового эпителия, содержащих либо желобоватый, либо листовидный вкусовой сосочек. Базолатеральная сторона эпителия располагалась в резервуаре с буферным раствором, который после стимуляции собирался, смешивался с люциферин-люциферазым реагентом и анализировался на люминометре. Эта методика позволила статистически продемонстрировать рост выброса ATP фрагментами эпителия со вкусовыми почками в ответ на однократную стимуляцию смесью горьких веществ по сравнению с фрагментами без вкусовой ткани [2]. Тем не менее, такой подход фактически лишен внутреннего контроля по схеме контроль-воздействие-контроль. В данной работе мы модифицировали описанный выше подход и устранили указанный недостаток, обеспечив мониторинг секреции ATP в режиме реального времени.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение вкусового эпителия языка мыши, содержащего желобоватый вкусовой сосочек, проводилось по стандартной методике [3]. Смесь ферментов (1.1 мг/мл коллагеназы Б, 1.2 мг/мл диспазы II, 0.2 мг/мл эластазы (Worthington, США), 0.5 мг/мл ингибитора трипсина (Sigma–Aldrich, США) в растворе, содержащем (мМ): 130 NaCl, 10 KCl, 1 СаCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES, 10 глюкозы (pH 7.8), инъецировалась под эпителий изолированного языка. Затем язык инкубировался 35 мин в бескальциевом растворе, содержащем (мМ): 120 NaCl, 20 KCl, 0.7 СаCl2, 1.1 MgCl2, 1 EGTA, 1 EDTA, 10 HEPES, 10 глюкозы (pH 7.4). После инкубации эпителий подрезался и отделялся от мышечной ткани. Участок эпителия языка с желобоватым сосочком помещался в физиологический раствор, содержащий (мМ): 135 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, 10 глюкозы (pH 7.4), и затем крепился в камере Уссинга так, чтобы апикальная часть эпителия была обращена в верхний отсек камеры.

Мониторинг выброса ATP вкусовыми клетками осуществлялся в модифицированной камере Уссинга [6], которая состояла из двух перфузируемых отсеков, между которыми зажимался и плотно изолировался фрагмент языкового эпителия, содержащего желобоватый вкусовой сосочек. Раствор для перфузии апикальной стороны эпителия содержал (мМ): 50 NaCl, 20 KCl, 4 CaCl2, 0.5 MgCl2, 5 HEPES (pH 7.6) [8]. Нижняя ячейка заполнялась физиологическим раствором, содержащим 10 мкМ калиевой соли люциферина и 0.1 мкг/л рекомбинантной люциферазы (Sigma–Aldrich, США). Хемилюминесценция люциферин-люциферазной смеси регистрировалась микрофотометром Model 814 (PTI, США), работающим в режиме счета фотонов и подключенным к компьютеру через интерфейсный модуль BrightBox (PTI, США). Фотоответы регистрировались и анализировались с помощью программного обеспечения Felix32 (PTI, США). Полученные данные обрабатывались в программе SigmaPlot 11 (Systat Software, США).

Эксперименты проводились при комнатной температуре (23–25°C). Соли, HEPES и вкусовые стимулы приобретались у фирмы Sigma–Aldrich.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Эксперименты проводились с использованием экспериментальной камеры, представляющей собой модификацию камеры Уссинга [6], которая широко использовалась, например, для измерения транспорта ионов, питательных веществ и лекарств через эпителиальные ткани [7], а также для анализа выброса гормонов тканями двенадцатиперстной кишки [8]. Разработанная нами камера монтировалась на микрофотометре и состояла из двух независимо перфузируемых отсеков, между которыми плотно фиксировался эпителий. Наружная часть эпителия, а значит и апикальные участки мембран вкусовых клеток, была экспонирована в верхний отсек камеры. Перед началом регистрации в течение 30–40 мин производилась непрерывная перфузия обоих отсеков камеры апикальным и физиологическим растворами соответственно, для восстановления ткани после механических воздействий, связанных с закреплением ее между отсеками. После периода релаксации препарата, нижний отсек заполнялся люциферин-люциферазной смесью, что, как правило, позволяло наблюдать стабильную базальную хемилюминесценцию низкого уровня, видимо, вызванную спонтанным окислением люциферина. Конструкция камеры и система перфузии обеспечивала минимальное гидростатическое давление на эпителий и позволяла в процессе регистрации производить быструю, без гидравлического удара, смену раствора в верхнем отсеке над апикальной стороной эпителия. Это обеспечивало отсутствие артефактов, связанных с механическими возмущениями эпителия, которые могли вызывать выброс ATP из эпителиальной ткани, и позволяло выполнять серию аппликаций на одном препарате. Для предотвращения паразитной засветки во время экспериментов камера с фотометром располагались в светонепроницаемом боксе, установленном в затемненном помещении. В начале каждой регистрации герметичность камеры с закрепленным эпителием и целостность последнего проверялись краткой (15–20 с) подачей раствора 100 нМ ATP в верхний отсек камеры. При наличии повреждений или неплотной фиксации эпителия в камере это приводило к быстрому проникновению ATP в нижний отсек и вызывало большой по амплитуде хемилюминесцентный сигнал. В таких случаях эксперимент останавливался, и в камере монтировался новый вкусовой эпителий.

Поскольку в желобоватом вкусовом сосочке доминируют горько-чувствующие вкусовые клетки, в описываемых экспериментах использовались вещества, вызывающие горький вкус, в частности – гидрохлорид хинина (10 мМ) и октаацетат сахарозы (1 мМ). Стимуляция эпителия проводилась путем кратковременной (30–50 с) смены контрольного раствора в верхнем отсеке камеры на раствор, содержащий горькое соединение в требуемой дозе. Аппликация вкусовых стимулов приводила к выбросу ATP эпителием и генерации хемилюминесцентного сигнала в нижнем отсеке камеры (рис. 1а, 1б). Интервал времени между подачей вкусового стимула и максимумом хемилюминесцентного ответа люциферин-люциферазной смеси составил 30–100 с. После восстановления базового уровня хемилюминесценции производилась смена смеси люциферин-люциферазы в нижнем отсеке камеры (стрелки на рис. 1а, 1б), чтобы при последующих регистрациях избежать падения амплитуды ответов вследствие снижения концентрации активных реагентов люциферин-люциферазной смеси.

Рис. 1.

Регистрация хемилюминесцентного сигнала люциферин-люциферазной смеси в нижнем отсеке камеры. а, б – On-line регистрация сигнала, обусловленного выбросом ATP вкусовым эпителием при кратковременной аппликации на апикальную поверхность эпителия 1 мМ октаацетат сахарозы (СОА) (а) и 10 мМ гидрохлорида хинина (б). Время и продолжительность аппликаций указаны линиями над экспериментальной кривой, моменты замены смеси люциферин-люциферазы в нижнем отсеке камеры указаны стрелками под экспериментальной кривой. в – Регистрация хемилюминесцентного сигнала при подаче раствора люциферин-люциферазы с известными концентрациями ATP; время и продолжительность подач раствора люциферин-люциферазы в нижний отсек камеры указаны линиями над экспериментальной кривой. г – Калибровочная диаграмма, отражающая средние пиковые значения уровня хемилюминесценции в нижнем отсеке.

Для количественной оценки эффективной концентрации ATP, выделенного эпителием при стимуляции, после завершения каждого эксперимента проводились калибровочные измерения. Для этого поочередно осуществлялась отмывка нижнего отсека физиологическим раствором с последующим заполнением раствором люциферин-люциферазы с известной концентрацией ATP (рис. 1в). По пиковым значениям уровня хемилюминесценции строилась калибровочная диаграмма как функция средней концентрации ATP в нижнем отсеке (рис. 1г). Согласно полученным при калибровочных измерениях результатам при данных условиях регистрации и составе люциферин-люциферазной смеси, минимальная регистрируемая средняя концентрация ATP составила приблизительно 0.1 нМ. Основываясь на калибровке (рис. 1г), эффективная концентрация ATP, достигавшаяся в нижнем отсеке камеры за счет секреции нуклеотида желобоватым сосочком в ответ на трехкратную вкусовую стимуляцию 10 мМ гидрохлорида хинина (рис. 1а) составила около 24, 14 и 3 нМ; и в случае 1 мМ октаацетата сахарозы (рис. 1б) – 15, 8, 3 нМ.

Разработанная нами методика мониторинга выброса ATP вкусовым эпителием путем регистрации хемилюминесценции в режиме реального времени с помощью модифицированной циркуляционной камеры Уссинга обеспечила достаточно высокую чувствительность регистрации, соответствующую эффективной концентрации ATP порядка 0.1 нМ (при соотношении сигнал/шум равном 1), и позволила регистрировать серию выбросов ATP одним препаратом, стимулируемым последовательной аппликацией кратковременных горьких стимулов. Методика позволяла сохранять жизнеспособность вкусовой ткани и ее способность отвечать на горькие вещества в течение длительного (до 2 ч) эксперимента, хотя при этом наблюдалось постепенное снижение (рандаун) амплитуды ответов (рис. 1а, 1б), возможно, из-за истощения запаса ATP в клетках и/или снижения эффективности каскада трансдукции и механизма секреции. В дальнейшем данная методика может быть использована для анализа физиологических эффектов различных соединений, включая вкусовые вещества и модуляторы активности вкусовых GPCR.

Работа выполнена при поддержке РФФИ № 20-04-01035 (рук. О.А. Рогачевская).

Список литературы

  1. Taruno A., Nomura K., Kusakizako T., Ma Z., Nureki O., Foskett J.K. 2021. Taste transduction and channel synapses in taste buds. Pflügers Arch. – Eur. J. Physiol. 473, 3–13.

  2. Finger T.E., Danilova V., Barrows J., Bartel D.L., Vigers A.J., Stone L., Hellekant G., Kinnamon S.C. 2005. ATP signaling is crucial for communication from taste buds to gustatory nerves. Science. 310 (5753), 1495–1499.

  3. Romanov R.A., Rogachevskaja O.A., Bystrova M.F., Jiang P., Margolskee R.F., Kolesnikov S.S. 2007. Afferent neurotransmission mediated by hemichannels in mammalian taste cells. EMBO J. 26 (3), 657–667.

  4. Romanov R.A., Lasher R.S., High B., Savidge L.E., Lawson A., Rogachevskaja O.A., Zhao H., Rogachevsky V.V., Bystrova M.F., Churbanov G.D., Adameyko I., Harkany T., Yang R., Grahame J.K., Marambaud P., Kinnamon J.C., Kolesnikov S.S., Finger T.E. 2018. Chemical synapses without synaptic vesicles: Purinergic neurotransmission through a CALHM1 channel-mitochondrial signaling complex. Sci. Signal. 11 (529), pii: eaao1815.

  5. Zufall F., Ukhanov K., Lucas P., Leinders-Zufall T. 2005. Neurobiology of TRPC2: From gene to behavior. Pflügers Archiv. 451 (1), 61–71.

  6. Ussing H.H., Zerahn K. 1951. Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin. Acta. Physiol. Scand. 23, 110–127.

  7. He L., Yin Y., Li T., Huang R., Xie M., Wu Z., Wu G. 2013. Use of the Ussing chamber technique to study nutrient transport by epithelial tissues. Front. Biosci. (Landmark Ed). 18, 1266–1274.

  8. Geraedts M.C., Troost F.J., De Ridder R.J., Bodelier A.G., Masclee A.A., Saris W.H. 2012. Validation of Ussing chamber technology to study satiety hormone release from human duodenal specimens. Obesity. 20 (3), 678–682.

  9. Shannon I.L., Suddick, R.P., Dowd Jr.F.J. 1974. Saliva: Composition and secretion. Monographs in oral science. Basel: Karger, 2, p. 1–2.

Дополнительные материалы отсутствуют.