Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2021, T. 38, № 6, стр. 474-477

ВВЕДЕНИЕ

Адреналин и норадреналин представляют собой катехоламины и функционируют как гормоны и нейромедиаторы, модулирующие активность различных органов и тканей, включая сердечно-сосудистую систему, почки, печень и мозг. Самые разнообразные клетки, от нейронов и кардиомиоцитов до мезенхимных стромальных клеток, экспрессируют гены, кодирующие адренорецепторы. Последние принадлежат к суперсемейству гептаспиральных рецепторов, сигнальная функция которых во многом обеспечивается взаимодействием с G-белками (G-protein coupled receptors). Идентифицировано девять генов, кодирующих адренорецепторы, которые на основе структурных и функциональных свойств отнесены к трем группам: α₁ (α_1A, α_1B, α_1D), α₂ (α_2A, α_2B, α_2C) и β (β₁, β₂, β₃) [1]. Традиционно считалось, что α₁-адренорецепторы преимущественно сопряжены с G_q/11-белком, стимулирующим фосфолипазу С (PLC), α₂-адренорецепторы – с G_i/0-белком, ингибирующим активность аденилатциклазы (AC), а β-адренорецепторы связываются с G_s-белком, активирующим аденилатциклазу. Между тем данные, накопленные к настоящему моменту, свидетельствуют о том, что варианты сопряжения адренергических рецепторов с внутриклеточными сигнальными каскадами куда более разнообразны [2, 3]. Так, например, показано, что активация β-адренорецепторов может приводить к мобилизации внутриклеточного Са²⁺ по cAMP-независимому пути [4].

В наших исследованиях адренергической системы мезенхимных стромальных клеток (МСК), выделенных из жировой ткани человека, было показано, что норадреналин инициирует Ca²⁺-сигнализацию в МСК. Интересной особенностью этих Са²⁺-сигналов было то, что в малых концентрациях норадреналин не вызывал детектируемого увеличения уровня внутриклеточного Са²⁺, но начиная с пороговой дозы инициировал Са²⁺-ответы, величина которых фактически не зависела от концентрации агониста [5]. Иными словами, клетки генерировали Са²⁺-ответы на норадреналин по принципу “всё или ничего”; такой характер ответа ставит вопрос о том, как в МСК кодируется информация о величине приходящего стимула для формирования адекватной реакции на него. Было также неясно, насколько универсален данный тип клеточных ответов на агонисты. В данной работе мы установили, что клетки HEK 293 также отвечают на норадреналин мобилизацией Са²⁺ в цитозоле, при этом Са²⁺-ответы генерируются по принципу “всё или ничего” (рис. 1а, верхняя кривая, 1б). Таким образом, данный тип Са²⁺-ответа может быть достаточно универсальным, и в этом случае вопрос о кодировании интенсивности адренергических стимулов уже не сводился к анализу физиологических процессов в МСК. Возможно, клетки экспрессируют такой набор адренорецепторов, что норадреналин способен запускать в их цитозоле параллельные процессы, один из которых – мобилизация Са²⁺, а другой – например, генерация сАМР, каждый из которых нацелен на решение специфических задач клеточной физиологии. Нам представлялось интересным выяснить, вовлекает ли адренергическая сигнализация в клетках параллельные процессы, например Са²⁺-сигнализацию и сАМР-сигнализацию.

Рис. 1.

Ca²⁺- и cAMP-ответы одиночных клеток HEK 293 на стимуляцию норадреналином в различных концентрациях. а – Репрезентативная регистрация Ca²⁺- и cAMP-ответов одиночной клетки HEK 293 на норадреналин (Нор) в различных концентрациях (n = 226). Моменты и продолжительность аппликаций норадреналина обозначены горизонтальными линиями выше экспериментальной кривой. Изменение внутриклеточного Ca²⁺ характеризовали относительной флуоресценцией GEM-GECO1 ΔF/F₀, где ΔF = F₀ – F, изменение внутриклеточного cAMP характеризовали относительной флуоресценцией Pink Flamindo ΔF/F₀, где ΔF = F – F₀, F и F₀ – текущая интенсивность эмиссии индикатора и его эмиссии в начале регистрации соответственно. б – Дозозависимость Ca²⁺-ответов клеток HEK 293, характеризующихся одинаковым порогом чувствительности к норадреналину 3 мкМ (n = 14–20). Каждый ответ был нормирован на ответ, вызванный в соответствующей клетке норадреналином в концентрации 10 мкМ. Экспериментальная зависимость (точки) аппроксимирована функцией Хевисайда cо скачком в точке 3 мкМ (непрерывная линия). Экспериментальные данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. в – Дозозависимость cAMP-ответов на норадреналин клеток HEK 293 (n = 201). Каждый ответ был нормирован на ответ, вызванный в данной клетке 10 мкМ норадреналина. Экспериментальная зависимость (точки) аппроксимирована уравнением Хилла: R = A^h/($A_{{0.5}}^{h}$ + A^h), где R – нормированный клеточный ответ, A – концентрация норадреналина, A_0.5 – концентрация полуэффекта, h – коэффициент Хилла. Непрерывная линия получена при h = 2 и A_0.5 = 2.5 мкМ. Экспериментальные данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Мониторинг cAMP в живой клетке в режиме реального времени возможен только с помощью генетически кодируемых сенсоров, поскольку синтетических флуоресцентных cAMP-зондов на сегодняшний день не разработано. Поэтому для исследования внутриклеточных cAMP- и Ca²⁺-сигналов мы использовали генетически кодируемые сенсоры внутриклеточного cAMP Pink Flamindo [6] и цитозольного Са²⁺ GEM-GECO1 [7]. Эти молекулярные сенсоры были гетерологически экспрессированы в клетках линии HEK 293. Клетки культивировали в среде DMEM (Gibco), содержащей 4.5 г/л глюкозы, 10% эмбриональной бычьей сыворотки (HyClone), 100 мг/мл гентамицина (Sigma), 2 мМ глутамина (Sigma) во влажной атмосфере c 5% содержанием CO₂ в воздухе при 37̊°C. Клетки трансфицировали плазмидными векторами Pink Flamindo и CMV-GEM-GECO1 (оба Addgene) с целью индукции экспрессии Pink Flamindo и GEM-GECO1. Для трансфекции использовали набор для липофекции Lipofectamine 3000 (Invitrogen) по оптимизированному согласно рекомендациям производителя протоколу. В физиологических экспериментах использовали клетки через 24–48 ч после трансфекции. Для мониторинга внутриклеточных cAMP и Са²⁺ клетки прикрепляли ко дну фотометрической камеры с помощью адгезивного материала Cell Tak (Corning) и инкубировали при комнатной температуре 30 мин. Внеклеточный раствор содержал (мМ): NaCl – 130, KCl – 5, CaCl₂ – 2, MgCl₂ – 1, HEPES – 10, глюкозу – 10. Фотометрические эксперименты проводили с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 135 (Zeiss), оборудованного объективом Plan NeoFluar 20×/0.75 и цифровой EMCCD камерой LucaR (Andor Technology). Флуоресценцию Pink Flamindo и GEM-GECO1 возбуждали поочередно на длинах волн 480 ± 10 нм и 572 ± 17.5 нм, эмиссию регистрировали в области 520 ± 20 нм и 634 ± ± 34 нм соответственно. Изменение концентрации cAMP и Са²⁺ в цитоплазме оценивали по относительному изменению интенсивности флуоресценции Pink Flamindo и GEM-GECO1 соответственно. Количественный фотометрический анализ изображений осуществляли с использованием программы NIS Elements (Nikon). Полученные экспериментальные данные обрабатывали с помощью программы Sigma Plot 12.5 (Systat Software).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В общей сложности было проанализировано 226 клеток, для которых была характерна флуоресценция, индуцированная экспрессией одновременно обоих флуоресцентных белков – Pink Flamindo и GEM-GECO1. Оказалось, что стимуляция таких клеток норадреналином в различных дозах инициировала увеличение концентраций cAMP и/или Ca²⁺ в их цитозоле. Так, 152 клетки (67%) генерировали исключительно cAMP-ответы, 25 клеток (11%) генерировали только Ca²⁺-ответы, а в 49 клетках (22%) наблюдалось увеличение уровня обоих вторичных медиаторов в ответ на норадреналин (рис. 1а). Таким образом, значительное большинство (89%) клеток HEK 293, чувствительных к норадреналину, генерировали cAMP-ответы, тогда как агонист-зависимая мобилизация внутриклеточного Ca²⁺ наблюдалась лишь в 33% субпопуляции. Такая функциональная гетерогенность клеток HEK 293, видимо, отражает их молекулярную гетерогенность в том отношении, что индивидуальная клетка характеризуется специфическим паттерном экспрессии генов адренорецепторов и/или специфическими механизмами их сопряжения с внутриклеточными сигнальными каскадами. С этих позиций можно объяснить количественное противоречие, состоящее в том, что адренорецепторы экспрессируются в большинстве МСК [8], в то время как норадреналин мобилизует Ca²⁺ лишь в небольшой (5–15%) популяции этих клеток [5].

Генерация Ca²⁺-ответов на норадреналин клетками HEK 293 подчинялась принципу “всё или ничего”, т.е. при стимуляции агонистом в подпороговых концентрациях ответы не детектировались, тогда как амплитуда ответов на агонист в любых концентрациях, превышающих пороговую, была практически одинаковой (рис. 1а, верхняя кривая, 1б). Пороговая концентрация норадреналина варьировалась от клетки к клетке и лежала в пределах 1–5 мкМ. Описанный тип дозозависимости Ca²⁺-ответов на агонисты был обнаружен в МСК в наших предыдущих исследованиях [5, 9, 10]. Результаты этих работ свидетельствовали о том, что ключевым механизмом, обеспечивающим инвариантность формы Са²⁺-сигналов, индуцированных агонистами в различных дозах, является Са²⁺-индуцированный выброс депонированного Са²⁺ (Сa²⁺-induced Сa²⁺ release, CICR). По-видимому, универсальность величины и формы Ca²⁺-ответов на норадреналин в клетках HEK 293 (рис. 1а, верхняя кривая) также обеспечивает CICR. Отметим, что дозозависимость cAMP-ответов клеток HEK 293 носила совершенно иной характер: пороговая концентрация норадреналина лежала в области 1–3 мкМ, а амплитуда сАМР-ответов росла пропорционально концентрации агониста (рис. 1а, нижняя кривая, 1в).

Таким образом, использование генетически кодируемых сенсоров Ca²⁺ и cAMP позволило продемонстрировать, что норадреналин способен инициировать в клетках HEK 293 сложный паттерн внутриклеточных событий, стимулируя как минимум мобилизацию Са²⁺ и генерацию cAMP. Поскольку Ca²⁺-ответы, инициированные короткими аппликациями норадреналина, были инвариантны по форме при разных дозах агониста, то кодирование информации об интенсивности стимула могло осуществляться на уровне cAMP-сигналов, амплитуда которых зависела от концентрации норадреналина (рис. 1). Скорее всего, клетки, которые генерируют Са²⁺-сигналы в ответ на агонисты по принципу “всё или ничего”, например МСК, могут использовать сходную стратегию кодирования внешних стимулов, генерируя не только Са²⁺-сигналы, но и сигналы другой природы, например, в форме импульсов cAMP, градуально зависящих от силы стимуляции.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источники финансирования. Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 19-75-10 068.

Соответствие принципам этики. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.