Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2021, T. 38, № 6, стр. 427-433

Инсулин способствует нормализации ионного гомеостаза и состояния митохондрий после механической травмы культуры нейронов мозга

И. А. Красильникова a*, И. А. Помыткин b, В. Г. Пинелис a, А. М. Сурин ac

a Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей Минздрава России
119296 Москва, Россия

b Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России
119991 Москва, Россия

c Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии
125315 Москва, Россия

* E-mail: Irinakrsl81@gmail.com

Поступила в редакцию 11.04.2021
После доработки 31.05.2021
Принята к публикации 31.05.2021

Полный текст (PDF)

Аннотация

Механическое повреждение первичной нейрональной культуры служит удобной in vitro моделью для изучения молекулярно-клеточных механизмов, задействованных в распространении очага повреждения при механической травме мозга. В данной работе исследованы изменения внутриклеточной концентрации Ca2+ ([Ca2+]i), Na+ ([Na+]i) и митохондриального потенциала (ΔΨm) в ответ на механическое повреждение первичной культуры корковых нейронов крысы. Быстрое (в течение 1–2 с) нанесение повреждения нейрональной сети в форме полосы ~3 × 0.1 мм вызывало скачкообразный рост [Ca2+]i, [Na+]i и резкое падение ΔΨm. В ~78% клеток, отреагировавших на травму культуры, происходило плавное восстановление указанных параметров до базального уровня. В остальных 22% возникала вторая фаза подъема [Ca2+]i (отсроченная кальциевая дисрегуляция, ОКД), синхронная с сильным падением ΔΨm. В таких клетках [Na+]i оставалась на уровне высокого плато. Добавление инсулина (100 нМ) за 5 мин до нанесения механического повреждения уменьшало долю нейронов, имевших ОКД и устойчивое повышение [Na+]i. Таким образом, наличие инсулина способствует нормализации Ca2+- и Na+-гомеостаза и функционирования митохондрий, нарушенных при моделировании механической травмы мозга in vitro.

Ключевые слова: механическое повреждение мозга in vitro, глутаматная эксайтотоксичность, отсроченная кальциевая дисрегуляция, инсулин

ВВЕДЕНИЕ

Травматическое повреждение мозга является серьезной клинической проблемой, приводящей к смерти, развитию длительной потере трудоспособности и инвалидизации. Моделирование травматического повреждения мозга in vitro успешно используют для выяснения каскада молекулярных механизмов, приводящих к вторичному повреждению мозга, а также для поиска веществ, обладающих нейропротекторными свойствами [13]. Одним из лидирующих факторов гибели нейронов является чрезмерное повышение внутриклеточной концентрации свободного Ca2+ ([Ca2+]i), приводящее к кальциевой перегрузке митохондрий и нарушению их функционального состояния [46].

Ранее было показано, что источником повышения [Ca2+]i при нанесении нейрональной культуре механической травмы служит внеклеточный Ca2+ [7, 8]. Было обнаружено, что MK801, ингибирующий ионотропные глутаматные каналы NMDA-типа, предотвращал повышение [Ca2+]i в 99% нейронов [9]. Это свидетельствует о том, что основным путем поступления Ca2+ в нейроны служат ионные каналы NMDA-рецепторов. Недавно нами показано, что инсулин защищает первичные культуры нейроны от эксайтотоксического действия глутамата (Glu) [10]. Целью данной работы было выявить, способен ли инсулин оказывать нейропротекторное действие в тех случаях, когда изменение внутриклеточного ионного гомеостаза и нарушение функций митохондрий вызвано не экзогенным Glu, а эндогенным, выделяющимся в условиях, моделирующих механическую травму мозга in vitro.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено на первичных культурах кортикальных нейронов крыс Вистар в возрасте 1–2 дня (возраст клеток в культуре 10–12 дней), приготовленных как описано в работе [10]. Травму нейрональной сети производили иглой, установленной в механическом манипуляторе, позволяющем наносить горизонтальную царапину длиной 2–3 мм и шириной 80–100 мкм в течение 1–2 с. Регистрацию флуоресцентных сигналов Ca2+- и Na+-индикаторов и потенциал-чувствительного митохондриального зонда производили с интервалом между кадрами 3 с до, во время и после нанесения повреждения в пределах 150 мкм от границы царапины. Измерения выполнены с помощью системы анализа изображения на основе инвертированного флуоресцентного микроскопа Olympus IX-71. Для одновременных измерений [Ca2+]i и митохондриального потенциала (ΔΨm) использовали флуоресцентные зонды: Fura-FF (4 мкМ, 60 мин, возбуждение 340 ± 8 и 380 ± 8 нм, испускание 525 ± 15 нм) и потенциал-чувствительный зонд Rhodamine 123 (Rh123, 2.5 мкг/мл, 15 мин, возбуждение 485 ± ± 8 нм, испускание 525 ± 15 нм) соответственно. Для одновременных измерений внутриклеточной концентрации Na+ ([Na+]i) и Ca2+ использовали флуоресцентные зонды: SBFI (8 мкМ, 60 мин, длины волн возбуждения и регистрации те же, что для Fura-FF) и Rhod-2 (1 мкМ, 60 мин, возбуждение 565 ± 8 нм, испускание 610 ± 15 нм) соответственно.

Все измерения выполнены в буферном растворе следующего состава (мМ): 130 NaCl, 5.4 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 5 глюкозы, 20 HEPES, pH 7.4. Добавление инсулина (100 нМ, свиной, Sigma-Aldrich, США) производили за 5 мин до нанесения травмы, и далее он присутствовал в растворе в течение всей процедуры измерений, за исключением периодов действия протонофора FCCP (1 мкМ) и калибровки сигналов Ca2+-индикатора в конце экспериментов. Для калибровки максимального сигнала Fura-FF и Rhod-2 добавляли Ca2+-ионофор иономицин (Iono, 2 мкМ, в присутствии 5 мМ Ca2+), что приводило к насыщению индикатора ионами Ca2+.

Изменения [Ca2+]i, измеренные с помощью Fura-FF, представлены как изменения отношения F340/F380 и нормированы относительно исходного состояния в покоящихся клетках до нанесения травмы (F340/F380 = 0) и после калибровки максимального сигнала (F340/F380 = 1). Изменения [Ca2+]i, измеренные с помощью Rhod-2, представлены как изменения отношения F/Fo, где F и Fo соответственно текущее значение интенсивности флуоресценции и исходное в покоящихся клетках в начале эксперимента. Отношение F/Fo принято за 0 в покоящихся клетках и за 1 после калибровки максимального сигнала Rhod-2 с помощью иономицина. Изменения [Na+]i представлены как изменения отношения F340/F380 индикатора SBFI и нормированы относительно исходного значения в покоящихся клетках (F340/F380 = 1).

Флуоресцентные индикаторы приобретены в ThermoFisher (США), остальные реагенты в Sigma-Aldrich.

Статистическая обработка данных производилась с помощью программы GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., США), непарный t-тест. Статистически значимыми считали различия при уровне вероятности p < 0.05. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, n – общее количество клеток во всех экспериментах.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Механическое повреждение первичной культуры кортикальных нейронов крысы приводит к быстрому увеличению [Ca2+]i и синхронному падению ΔΨm. Типичные изображения изменений [Ca2+]i и ΔΨm до и после механического повреждения (нанесения царапины) представлены на рис. 1.

Рис. 1.

Типичные флуоресцентные изображения первичной культуры кортикальных нейронов крысы, нагруженных Fura-FF (a, б) и Rhodamine123 (в, г) до нанесения царапины (а, в) и спустя 60 с после ее нанесения (б, г). Более теплый цвет флуоресцентных изображений Fura-FF соответствует увеличению [Ca2+]i в соме клеток; более теплый цвет флуоресцентных изображений Rh123 соответствует снижению ΔΨm в соме и нейритах. Масштабный отрезок соответствует 100 мкм.

В 77.7 ± 9.1% клеток (n = 264, 4 эксперимента) эти изменения имели быстрый транзиторный характер с возвращением [Ca2+]i и ΔΨm к низкому значению. В остальных 22.3% происходило двухфазное увеличение [Ca2+]i с развитием устойчивого плато и митохондриальной деполяризацей (рис. 2а, 2б). Большая часть клеток (63 ± 7%), развивших двухфазный Сa2+-ответ на травму, локализовалась в пределах 50 мкм от границы царапины. Подобные изменения [Ca2+]i и ΔΨm наблюдаются при эксайтотоксическом действии экзогенного Glu на первичные нейрональные культуры мозга и получили название отсроченной кальциевой дисрегуляции (ОКД) [46]. В настоящем экспериментальном протоколе Glu не добавляли, однако этот нейромедиатор мог выделиться из клеток, разрушенных в результате нанесения механического повреждения. Это предположение подтверждается тем, что доля клеток, ответивших быстрым подъемом [Ca2+]i на механическое повреждение многократно снижается в присутствии МК-801, что указывает на доминирующую роль ионотропных Glu-активируемых каналов NMDA-типа в реакции нейронов на повреждение [9]. Интересно, что в отличие от стандартных протоколов при изучении глутаматной эксайтотоксичности, использующих экзогенный Glu в безмагниевом буфере в присутствии глицина [4, 5, 10], при нанесении механической травмы ОКД развивалась не только без введения глицина, являющегося ко-агонистом NMDA-рецепторов, но и без удаления Mg2+. Возможно, при механическом повреждении культуры выделяется не только эндогенный Glu, но и глицин, а также происходит быстрая деполяризация плазматической мембраны, снимающая потенциал-зависимую магниевую блокаду.

Рис. 2.

Изменения [Ca2+]i и ΔΨm в первичной культуре кортикальных нейронов крысы, подвергнутой механическому повреждению с разрывом нейрональной сети в буферном растворе без (а и б) и с добавлением инсулина (Ins, 100 нМ) (в и г). В каждой группе представлено по 50 кривых, соответствующих сигналам индивидуальных нейронов. Пиковые значения [Ca2+]i (пик [Ca2+]i), отмечаемые в первые 120 с после нанесения царапины (д), и % клеток, в которых развилась отсроченная кальциевая дисрегуляция (ОКД) (е).

Добавление инсулина (100 нМ) за 5 мин до нанесения травмы само по себе не влияло на сигнал Fura-FF, однако приводило к достоверному снижению доли нейронов, имевших ОКД в результате повреждения культуры с 22.3 ± 9.1% до 10.3 ± 4.2% (p = 0.02, n = 306, 4 эксперимента) (рис. 2е). Доля нейронов, показавших синхронное с ОКД сильное падение ΔΨm, также уменьшалась (рис. 2б, 2г). Инсулин достоверно уменьшал пиковые значения [Ca2+]i с 0.24 ± 0.01 до 0.17 ± 0.00, наблюдаемые в первые 2 мин после нанесения травмы (p < 0.0001, за 1 принята максимальная [Ca2+]i, достигаемая при добавлении иономицина) (рис. 2д).

Добавление протонофора FCCP в конце эксперимента вызывало больший подъем флуоресценции Rh123 в тех культурах, которые содержали в буфере инсулин. Это свидетельствует о том, что в присутствии инсулина митохондрии удержали большее количество Rh123 в матриксе при механическом повреждении культуры и, соответственно, высвободили больше зонда в цитозоль при деполяризации с помощью FCCP (рис. 2г). Очевидно, митохондрии нейронов имели в присутствии инсулина более высокий ΔΨm, позволивший удержать большее количество Rh123.

Для развития ОКД при действии экзогенного Glu требуется не только активация NMDA-рецепторов, но и реверсия Na+/Ca2+-обменника [11]. Мы проверили, насколько ингибирование реверсивной моды Na+/Ca2+-обменника с помощью KB-R7943 важно для развития ОКД и сильного падения ΔΨm. Оказалось, что при механической травме нейрональной культуры и действии Glu, выделившегося в результате повреждения клеток, KB-R7943 (10 мкМ) не вызвал достоверного уменьшения доли клеток, имевших ОКД (n = 167 в группе клеток, подвергшихся механическому повреждению; n = 158 в группе клеток предобработанных K-BR7943 и подвергшихся механическому повреждению, 3 эксперимента, p > 0.05) (рис. 3).

Рис. 3.

Изменения [Ca2+]i и ΔΨm в первичной культуре кортикальных нейронов крысы, подвергнутой механическому повреждению с разрывом нейрональной сети в буферном растворе без (а и б) и с добавлением KB-R7943 (10 мкМ) (в и г). В каждой группе представлено по 50 кривых, соответствующих сигналам индивидуальных нейронов.

Известно, что NMDA-каналы обладают высокой проводимостью не только для Ca2+, но и для Na+ [4], поэтому мы проверили, происходят ли изменения [Na+]i в нейронах в ответ на механическое повреждение культуры. Действительно, в ответ на царапину изменения [Ca2+]i шли параллельно с изменениями [Na+]i (рис. 4). Добавление инсулина приводило к уменьшению доли нейронов, которые в ответ на травму развивали устойчивое повышение [Na+]i c 19.7 ± 2.3% (n = 211, 4 эксперимента) до 9.9 ± 2.4% (n = 204, 4 эксперимента, p < 0.0012). Это наблюдение согласуется с результатами измерения [Ca2+]i (рис. 2). Так же как и в случае измерений [Ca2+]i, инсулин достоверно уменьшал пиковые значения [Na+]i с 1.77 ± ± 0.03 до 1.45 ± 0.03, наблюдаемые в первые 2 мин после нанесения повреждения (p < 0.001, за 1 принято стартовое значение [Na+]i).

Рис. 4.

Изменения [Na+]i и [Ca2+]i в первичной культуре кортикальных нейронов крысы, подвергнутой механическому повреждению с разрывом нейрональной сети в буферном растворе без (а и б) и с добавлением инсулина (Ins, 100 нМ) (в и г), в каждой группе представлено по 50 кривых, соответствующих сигналам индивидуальных нейронов. Сопоставление [Na+]i и [Ca2+]i сигналов в ответ на травму в двух представительных нейронах (д и е).

ОБСУЖДЕНИЕ

Развитие ОКД является “точкой невозврата” при глутаматной нейротоксичности, и гибель таких нейронов в первичной культуре предопределена [12, 13]. Снижение доли клеток, имеющих [Ca2+]i-плато в in vitro модели травматического повреждения мозга, должно положительно сказываться на выживании нейронов вблизи травмированной зоны. Инсулин понижал амплитуду скачка [Ca2+]i (рис. 2д) и [Na+]i (рис. 4) в момент нанесения царапины, что свидетельствует о способности этого гормона снижать поступление Ca2+ и Na+ в клетку при механическом повреждении нейрональной сети in vitro. Снижение поступления Ca2+ в цитозоль из буфера уменьшает вероятность развития ОКД [14] и хорошо согласуется с результатами настоящего исследования (рис. 2е). С другой стороны, показано, что в гетерологических системах (в ооците лягушки) инсулин способен увеличивать экспрессию NMDA-рецепторов [15]. Однако электрофизиологические исследования на мозге крыс продемонстрировали, что эффект инсулина может быть разнонаправленным в зависимости от того, какие рецепторы вовлечены в нейротрансмиссию дополнительно к ионотропным рецепторам глутамата [16]. Кроме того, снижение в присутствии инсулина доли клеток, в которых повреждение вызывало длительное повышение [Na+]i, указывает на то, что инсулин способствовал более эффективной работе Na+/K+-ATP-азы (рис. 4). Это подтверждается тем, что в присутствии инсулина митохондрии нейронов имели более высокий ΔΨm, чем контрольные культуры без добавки гормона (рис. 2б, 2г), и хорошо согласуется с современными представлениями о более эффективной работе митохондрий по энергообеспечению нейронов в присутствии инсулина [17].

Мы не обнаружили реверсии Na+/Ca2+-обменника при механическом повреждении (рис. 3). Вероятно, снижение градиента концентрации Na+ между буфером и цитозолем и падение трансмембранного потенциала плазмалеммы не достигали уровня, необходимого для реверсии Na+/Ca2+-обменника, которое реализуется при нейротоксическом воздействии глутамата [4, 5, 12, 13].

В заключение отметим, что обработка нейронов инсулином способствует нормализации Ca2+- и Na+-гомеостаза и функции митохондрий, нарушенных в результате разрыва нейрональной сети. Можно надеяться, что положительное действие инсулина проявляется не только на двумерной модели травмы мозга, механическом повреждении первичной нейрональной культуры, но также in vivo.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией данной статьи.

Источники финансирования. Исследование поддержано грантами РФФИ 17-00-00106 и гос. заданием НИР № 0520-2019-0029 и АААА-А19-119012590191-3.

Соответствие принципам этики. Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Список литературы

  1. Kumaria A. 2017. In vitro models as a platform to investigate traumatic brain injury. Altern. Lab. Anim. 45 (4), 201–211. https://doi.org/10.1177/026119291704500405

  2. Morrison B., Elkin B.S., Dollé J.-P., Yarmush M.L. 2011. In vitro models of traumatic brain injury. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13 (1), 91–126. https://doi.org/10.1146/annurev-bioeng-071910-124706

  3. Lööv C., Shevchenko G., Geeyarpuram Nadadhur A., Clausen F., Hillered L., Wetterhall M., Erlandsson A. 2013. Identification of injury specific proteins in a cell culture model of traumatic brain injury. PLoS One. 8 (2), e55983. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0055983

  4. Khodorov B. 2004. Glutamate-induced deregulation of calcium homeostasis and mitochondrial dysfunction in mammalian central neurones. Prog. Biophys. Mol. Biol. 86 (2), 279–351. https://doi.org/10.1016/j.pbiomolbio.2003.10.002

  5. Duchen M.R. 2012. Mitochondria, calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 464 (1), 111–121. https://doi.org/10.1007/s00424-012-1112-0

  6. Ludtmann M.H.R., Abramov A.Y. 2018. Mitochondrial calcium imbalance in Parkinson’s disease. Neurosci. Lett. 663, 86–90. https://doi.org/10.1016/j.neulet.2017.08.044

  7. Mukhin A.G., Ivanova S.A., Allen J.W., Faden A.I. 1998. Mechanical injury to neuronal/glial cultures in microplates: Role of NMDA receptors and pH in secondary neuronal cell death. J. Neurosci. Res. 51 (6), 748–758. https://doi.org/10.1002/(SICI)1097-4547(19980315)51:6< 748::AID-JNR8>3.0.CO;2-B

  8. Mukhin A.G. Ivanova S.A., Knoblach S.M., Faden A.I. 1997. New in vitro model of traumatic neuronal injury: Evaluation of secondary injury and glutamate receptor-mediated neurotoxicity. J. Neurotrauma. 14 (9), 651–663. https://doi.org/10.1089/neu.1997.14.651

  9. Красильникова И.А., Бакаева З.В., Пинелис В.Г., Лисина О.Ю., Сурин А.М. 2018. Изменения концентрации внутриклеточного кальция и митохондриального потенциала в клетках первичной культуры коры головного мозга крысы при острой механической травме. Патогенез. 16 (3), 124–128.

  10. Krasil’nikova I., Surin A., Sorokina E., Fisenko A., Boyarkin D., Balyasin M., Demchenko A., Pomytkin I., Pinelis V. 2019. Insulin protects cortical neurons against glutamate excitotoxicity. Front. Neurosci. 13, 1027. https://doi.org/10.3389/fnins.2019.01027

  11. Brittain M.K., Brustovetsky T., Sheets P.L., Brittain J.M., Khanna R., Cummins T.R., Brustovetsky N. 2012. Delayed calcium dysregulation in neurons requires both the NMDA receptor and the reverse Na+/Ca2+-exchanger. Neurobiol. Dis. 46 (1), 109–117. https://doi.org/10.1016/j.nbd.2011.12.051

  12. Сурин А.М., Красильникова И.А., Пинелис В.Г., Ходоров Б.И. 2014. Исследование взаимосвязи между индуцированной глутаматом отсроченной Са2+-дизрегуляцией, митохондриальной деполяризацией и последующей гибелью нейронов. Патогенез. 12 (4), 40–46.

  13. Nicholls D. 2005. Mitochondrial dysfunction and glutamate excitotoxicity studied in primary neuronal cultures. Curr. Mol. Med. 4 (2), 149–177. https://doi.org/10.2174/1566524043479239

  14. Вабниц А.В., Сенилова Я.Е., Колесникова Е.В., Сурин А.М., Пинелис В.Г., Ходоров Б.И. 2006. Отсроченная Са2+ дисрегуляция в молодых нейронах мозжечка при гиперстимуляции глутаматных рецепторов. Роль NMDA-каналов. Биол. мембраны. 23 (4), 311–319.

  15. Skeberdis V.A., Lan J.Y., Zheng X., Zukin R.S., Bennett M.V.L. 2001. Insulin promotes rapid delivery of N-methyl-D-aspartate receptors to the cell surface by exocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (6), 3561–3566. https://doi.org/10.1073/pnas.051634698

  16. Fetterly T.L., Oginsky M.F., Nieto A.M., Alonso-Caraballo Y., Santana-Rodriguez Z., Ferrario C.R. 2021. Insulin bidirectionally alters NAc glutamatergic transmission: Interactions between insulin receptor activation, endogenous opioids, and glutamate release. J. Neurosci. 41 (11), 2360–2372. https://doi.org/10.1523/jneurosci.3216-18.2021

  17. Pomytkin I., Pinelis V. 2021. Insulin receptors and intracellular Ca2+ form a double-negative regulatory feedback loop controlling insulin sensitivity. F1000Research. 9, 598. https://doi.org/10.12688/f1000research.24558.2

Дополнительные материалы отсутствуют.