Биология моря, 2020, T. 46, № 5, стр. 357-360

В дальневосточных морях России неприкрепленная к субстрату красная водоросль Ahnfeltia tobuchiensis (Kanno et Matsubara, 1932) Makienko, 1970 (рис. 1) формирует обширные пласты толщиной от 0.1 до 1 м на илистом или илисто-песчаном грунте, которые могут занимать несколько десятков квадратных километров поверхности дна. Этот вид является важным компонентом морских экосистем из-за его вклада в очистку прибрежных вод, подверженных антропогенному загрязнению. К тому же A. tobuchiensis имеет значительную экономическую ценность как промышленный источник агара. Данный полисахарид нашел широкое применение в микробиологии и различных отраслях пищевой промышленности.

Рис. 1.

Внешний вид Ahnfeltia tobuchiensis. a – переплетенные талломы, б – разветвленная структура.

Хорошо известно, что бактерии колонизируют поверхность макроводорослей и в большинстве случаев эпифитные бактериальные сообщества весьма видоспецифичны (Goecke et al., 2010). Многие штаммы бактерий, выделенные из разных водорослей, способны разлагать продуцируемые водорослями-хозяевами полисахариды − альгинаты, целлюлозу и др. Считается, что бактерии участвуют в процессе распада водорослей благодаря ферментным системам, разлагающим полисахариды клеточной стенки до моно- и олигосахаридов. Сравнительное изучение таксономического положения штаммов с высокой степенью гидролитической активности необходимо для проведения направленного скрининга ферментов, представляющих интерес для медицины и биотехнологии.

Цели настоящей работы − изучение разнообразия активности O-гликозидгидролаз и других углевод-деградирующих ферментов в бактериях, выделенных из микробного сообщества красной водоросли A. tobuchiensis, а также анализ распространения активности этих ферментов среди бактериальных продуцентов с разным таксономическим статусом.

Штаммы бактерий выделяли методом прямого высева из таллома красной водоросли A. tobuchiensis (рис. 1б), собранного со стороны Охотского моря вблизи о-ва Итуруп (Курильские острова) во время экспедиции на НИС “Академик Опарин”. Бактерии, изолированные в данном эксперименте, идентифицировали на основе стандартных фенотипических, хемотаксономических и генотипических характеристик, как описано ранее (Nedashkovskaya et al., 2007). Принадлежность к роду и виду определяли по последовательности нуклеотидов в гене 16S рРНК, а также по комбинации физиологических и биохимических характеристик штаммов (Бакунина и др., 2012).

Бактерии культивировали, получали бактериальные гомогенаты и экстракты, а также определяли концентрации белка и активность ферментов по стандартным методикам (Bakunina et al., 2013). В качестве субстратов для гликозидаз использовали хромогенные гликозиды (“Sigma-Aldrich”, США). За единицу стандартной активности (U) гликозидазы принимали такое количество фермента в 1 мл экстракта, под действием которого образуется 1 мкмоль п-НФ за 1 мин в условиях эксперимента. Удельную активность рассчитывали как отношение стандартных единиц на 1 мг белка.

Активность полисахарид-гидролаз (EC 3.2.1.-) и альгинат-лиаз (4.2.2.-) определяли по нарастанию восстанавливающих сахаров, как описано ранее (Bakunina et al., 2013). Количество восстанавливающих сахаров рассчитывали по оптической плотности растворов при 750 нм с помощью метода Шомоги−Нельсона. Калибровочные кривые строили для модельных растворов D-глюкозы (“Merck”, США) или L-фукозы (для фукоиданазы). За одну единицу стандартной активности фермента принимали такое его количество в 1 мл экстракта, под действием которого высвобождается 1 мкмоль восстанавливающих сахаров за 1 мин.

В качестве субстратов для α- и β-галактозидазы, α- и β-глюкозидазы, α-N-ацетилгалактозаминидазы, α-фукозидазы, α-маннозидазы, α-ксилозидазы и β-N-ацетилглюкозаминидазы использовали п-нитрофенил-α- и β-D-галактопиранозиды, п-нитрофенил-α- и β-D-глюкопиранозиды, п-нитрофенил-α-N-ацетилгалактозаминид, п-нитрофенил-α-L-фукопиранозид, п-нитрофенил-α-D-маннопиранозид, п-нитрофенил-α-D-ксилопиранозид и п-нитрофенил-β-N-D-ацетилглюкозаминид соответственно.

Для детектирования активности ферментов, разлагающих полисахариды, в качестве субстратов использовали декстран, водорастворимый агар, амилозу, карбоксиметилцеллюлозу и полигулуроновую кислоту, полученные от “Sigma-Aldrich” (США). Фукоидан из Fucus evanescens (α-1,3; 1,4-L-фукансульфат) (Урванцева и др., 2004), пустулан из лишайника Umbilicaria rossica (β-1,6-D-глюкан) (Звягинцева и др., 1986), ламинаран из Laminaria cichorioides (β-1,3;1,6-D-глюкан) (Zvyagintseva et al., 2003), а также полиманнуроновую кислоту из Alaria fistulosa (см.: Zvyagintseva et al., 2005) выделяли и очищали в лаборатории.

С поверхности красной водоросли A. tobuchiensis были выделены 284 чистые культуры бактерий. Детально были изучены профили O-гликозидгидролаз и полисахарид-лиаз 92 штаммов гетеротрофных бактерий. Сравнительный филогенетический анализ последовательностей 16S рРНК показал, что полученные бактерии-продуценты характеризовались богатым видовым разнообразием и относились к 69 филотипам четырех филумов, среди которых доминировали Bacteroidetes (45 штаммов – 48.9%) и Proteobacteria (39 штаммов – 42.4%); представителей Actinobacteria (7 штаммов – 7.6%) и Firmicutes (1 штамм – 1.1%) было значительно меньше. Следует отметить, что при полифазном анализе таксономической структуры данного сообщества было установлено точное таксономическое положение двух новых для науки штаммов флавобактерий, которые обладали гликозидгидролазной активностью. Им были присвоены валидные названия Flavobacterium ahnfeltiae sp. nov. и Polaribacter staleyi sp. nov. (см.: Nedashkovskaya et al., 2014, 2018).

В результате скрининга были отобраны штаммы, показавшие наиболее высокую активность полисахарид-гидролаз и гликозидаз (22 и 16 соответственно). Продуценты полисахарид-гидролаз включали представителей 14 родов, среди которых наиболее часто встречались Polaribacter, Winogradskyella и Zobellia филума Bacteroidetes. Высокая активность гликозидаз отмечена у 16 штаммов, принадлежащих к 9 родам; преобладали представители Amylibacter филума Proteobacteria, Salinibacterium филума Actinobacteria и Zobellia филума Bacteroidetes.

Анализ распределения активности полисахарид-гидролаз и полисахарид-лиаз среди представителей четырех филумов микробного сообщества показал, что все сырые экстракты штаммов проявляли активность α-амилазы и α-глюкозидазы (рис. 2а, 2б: колонка 2 соответственно), которые участвуют в деградации крахмала – резервного полисахарида A. tobuchiensis. Активность полиманнуронат-лиаз, ламинариназ и полигулуронат-лиаз (рис. 2а: колонки 3, 4 и 5 соответственно), типичная для обитателей морской среды, также отмечена во всех экстрактах бактерий. Наиболее распространенными среди изолятов микробного сообщества A. tobuchiensis оказались β-N-ацетилглюкозаминидазы (рис. 2б: колонка 2). Эти гликозидазы часто детектировались у обитателей морской среды (Иванова и др., 1998; Бакунина и др., 2012; Балабанова и др., 2018). Они участвуют во многих важных физиологических процессах и входят в состав хитинлитического комплекса микроорганизмов. Редко встречались продуценты α-N-ацетилгалактозаминидазы (рис. 2б: колонка 9), а также фукоиданазы и каррагиназы, субстраты для которых (фукоидан и каррагинан) A. tobuchiensis не синтезируются.

Рис. 2.

Распределение активности полисахарид-гидролаз и полисахарид-лиаз среди представителей четырех филумов микробного сообщества (а), а также профили гликозидазной активности бактерий (б). (а): 2 – α-амилаза, 3 – полиманнуронат-лиаза, 4 – ламинариназа, 5 – полигулуронат-лиаза, 6 – фукоиданаза, 7 – декстраназа, 8 – каррагинаназа, 9 – пустуланаза, 10 – целлюлаза, 11 – агараза; (б): 2 – β-N-ацетилглюкозаминидаза, 3 – α-глюкозидаза, 4 – β-галактозидаза, 5 – β-глюкозидаза, 6 – α-галактозидаза, 7 – α-ксилозидаза, 8 – α-маннозидаза, 9 – α-фукозидаза, 10 – α-N-ацетилгалактозаминидаза; 1 – общее количество изученных штаммов.

Таким образом, впервые получены сведения о полисахарид-деградирующей активности культивируемых бактерий микробного сообщества красной водоросли A. tobuchiensis, которые характеризуются высоким метаболическим потенциалом, позволяющим бактериям определять жизненную стратегию и играть важную роль во взаимоотношениях с организмом-хозяином.