Биотехнология, 2022, T. 38, № 2, стр. 26-36

Особенности downstream процесса при производстве вакцин для профилактики пневмококковой инфекции

В. П. Трухин 1, А. Э. Евтушенко 1, Е. Л. Салимова 1, А. Д. Конон 1*

1 ФГУП “Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток” ФМБА России
198320 Красное Село, Санкт-Петербург, Россия

* E-mail: kononspbniivs@yandex.ru

Поступила в редакцию 25.02.2022
После доработки 10.03.2022
Принята к публикации 12.03.2022

Полный текст (PDF)

Аннотация

В обзоре рассмотрены особенности получения поливалентных вакцин для профилактики инфекции, вызываемой Streptococcus pneumoniae. Проведен литературный анализ применяемых методов для очистки капсульных полисахаридов, включая фракционное осаждение, ионообменную хроматографию, гель-фильтрацию, аффинную хроматографию, ультрафильтрацию. Показано, что полисахариды некоторых серотипов, в силу их химико-физических особенностей, требуют альтернативных способов выделения. Для конъюгированных вакцин рассмотрены наиболее часто используемые белки-носители (столбнячный анатоксин, CRM197 – нетоксичный вариант дифтерийного токсина) и способы их конъюгации с полисахаридами. Подробно рассмотрено восстановительное аминирование ‒ как один из основных способов конъюгации, применяемый при производстве вакцин для профилактики пневмококковых инфекций. Приведены способов очистки полисахарид-белковых конъюгатов. Проанализированная информация будет использована при разработке полного цикла отечественной 16-валентной полисахаридной конъюгированной вакцины для профилактики пневмококковой инфекции.

Ключевые слова: конъюгированные вакцины, Streptococcus pneumoniae, капсульные полисахариды, полисахарид-белковые конъюгаты, хроматографическая очистка, тангенциальная фильтрация

Пневмококковые заболевания, вызываемые Streptococcus pneumoniae, являются одной из наиболее частых причин смертности от инфекционных болезней. Частоту случаев возникновения этих заболеваний можно снизить за счет вакцинопрофилактики. Однако на сегодняшний день в России отсутствует отечественное производство вакцин для профилактики пневмококковой инфекции. Представленный обзор направлен на систематизацию и обобщение современной информации по особенностям производства данных вакцин с целью помощи исследователям, работающим в сфере здравоохранения.

Streptococcus pneumoniae – грамположительная бактерия, которая может вызывать инфекции как у иммунокомпетентных пациентов, так и пациентов с ослабленным иммунитетом. Бактериемия, вызванная S. pneumoniae, известна как инвазивная пневмококковая инфекция. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения, острые респираторные инфекции – одна из главных причин госпитализации и смерти среди детей в возрасте до 5 лет. По приблизительным оценкам пневмония, вызванная S. pneumoniae, становится причиной 300 000 смертей в год среди детей по всему миру. Важно отметить, что возникновение устойчивости S. pneumoniae к пенициллину и другим классам антибиотиков стало основной проблемой общественного здравоохранения [1]. Из-за пониженной восприимчивости S. pneumoniae к часто используемым антибиотикам следует рассматривать альтернативные методы лечения и профилактики заболеваний, вызываемых этой бактерией. Основное внимание должно быть уделено усилению программ вакцинации. В настоящее время на рынке доступно несколько типов пневмококковых вакцин: пневмококковые конъюгированные вакцины (PCV7, PCV10, PCV13) и пневмококковая полисахаридная вакцина (PPV23), где цифра в названии означает число серотипов, входящих в состав вакцины. Препараты PCV15 (Официальный сайт правительства США, Управление по контролю за продуктами и лекарствами (FDA): https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/vaccines/vaxneuvance) и PCV20 (Официальный сайт правительства США, FDA: https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/vaccines/prevnar-20) были одобрены летом 2021 года FDA, успешно пройдя 3 фазу клинических испытаний. В вакцинах PCV7, PCV10, PCV13, PCV15 и PCV20 активными действующими веществами являются полисахарид-белковые конъюгаты (ПБК), а в PPV23 – только полисахариды [2]. Основные серотипы и белки-носители представленных вакцин приведены в табл. 1.

Таблица 1.  

Основные вакцины для профилактики пневмококковой инфекции Table 1.  Main vaccines for the prevention of pneumococcal disease

Название вакцины Белок-носитель Полисахариды серотипов в составе вакцины
PCV7 CRM197 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F
PCV10 Белок D; CRM197; cтолбнячный анатоксин 1, 5, 4, 6B,7F, 9V, 14, 18C, 19F, 23F
PCV13 CRM197 1, 3, 4, 5, 6A, 6B,7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F
PCV15 CRM197 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 33F
PCV20 CRM197 1, 3, 4, 5, 6A, 6B,7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 33F
PPV23 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F, 33F

Такое множество серотипов, включенных в состав вакцин, объясняется тем, что S. pneumoniae обладает разнообразием серотипов, из них по меньшей мере 20 относятся к патогенным [3]. Известно более 90 различных серотипов, среди которых наибольшее распространение получили 19F (28.3%), 6B (14.5%), 23F (13.1%), 6A (7.1%), 19A (6.9%), 3 (6.7%), 14 (3.6%) и 9V (1.7%) [4].

СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ КАПСУЛЬНОГО ПОЛИСАХАРИДА

В основе эффективности применения вакцин для профилактики пневмококковых инфекций лежит их валентность. Как было отмечено выше, S. pneumoniae имеет большое разнообразие серотипов, которые подразделяются на основании химических особенностей капсульного полисахарида (КПС). Это критически важно при производстве вакцины, так как вакцина, призванная выработать иммунитет от одного серотипа, оказывается неэффективной в случае, когда инфекция вызвана другим серотипом [5]. Главным антигеном бактерии является пневмококковая капсула, которая состоит из полисахарида. Ее основная функция заключается в защите патогенных бактерий от взаимодействия с клетками иммунной системы хозяина. Капсула состоит из полимера с высокой молекулярной массой и представляет собой повторяющиеся звенья олигосахаридов, ковалентно связанные с клеточной стенкой [6].

Исследования структуры антигена показали, что в большинстве серотипов капсула имеет отрицательный заряд, который объясняется наличием кислотных остатков глюкуроновой (в серотипах 1, 2, 3, 5, 8, 9N, 9V, 22F) или фосфорной кислоты (в серотипах 6A, 6B, 11A, 15F, 18C, 19F, 19A, 20 и 23F) [5]. Капсула быстро синтезируется во время логарифмической фазы роста по аналогичному для большинства видов Streptococcus механизму. Считается, что у S. pneumoniae биосинтез происходит за счет образования повторяющихся углеводных звеньев, прикрепленных к липиду-носителю, который синтезируется на внутриклеточной стороне мембраны. Затем измененный липид-носитель экспортируется на поверхность, где повторяющиеся звенья олигосахаридов окончательно полимеризуются [7]. В какой-то момент во время полимеризации капсула ковалентно связывается с клеточной стенкой, предположительно за счет образования гликозидной связи через глюкозу на конце молекулы КПС и остатков N-ацетилглюкозамина пептидогликана [8]. По такому механизму образуется КПС для всех серотипов, кроме серотипов 3 и 37, в которых биосинтез КПС не зависит от липидного носителя [9]. Молекула КПС S. pneumoniae представляет собой повторяющиеся олигосахаридные звенья, имеющие в своем составе от 2 до 7 углеводных остатков. На рис. 1, в качестве примера, приведено сравнение строения КПС 3 и 14 серотипов.

Рис. 1.

Структура КПС S. pneumoniae 3 (слева) и 14 (справа) серотипов [5]. Fig. 1. Structures of capsule polysaccharides of the 3 (left) and 14 (right) serotypes of S. pneumoniae [5].

Из рис. 1 видно, что в структуре КПС серотипа 3 есть ионогенные группы, а КПС 14 серотипа имеет разветвленное строение и заряженные группы отсутствуют. Такие структурные особенности КПС, как длина цепи, число заряженных групп, плотность заряда вдоль цепи, наличие боковой цепи, имеют решающее значение при выборе способа и условий очистки [10]. В табл. 2 приведены структурные особенности КПС S. pneumoniae наиболее распространенных серотипов.

Таблица 2.

Основные структурные особенности КПС наиболее распространенных серотипов S. pneumoniae* Table 2.  Main structural features of S. pneumoniae capsule polysaccharides of the most common serotypes*

№ п/п Серотип Число углеводных остатков в олигосахариде Число углеводных остатков в боковой цепи Число заряженных групп
1 1 3 3
2 2 6 2 1
3 3 2 1
4 4 4 1
5 5 5 2 1
6 6A 3 1
7 6B 3 1
8 7F 7 3
9 8 4 1
10 9V 5 1
11 9N 5 1
12 10A 6 2 1
13 11A 4 1
14 12F 6 3 1
15 14 4 1
16 15B 5 2 1
17 17F 6 1 1
18 18C 5 1 1
19 19A 3 1
20 19F 3 1
21 20 6 1 1
22 22F 6 1 1
23 23F 4 1 1
24 33F 6 1

* Примечание: Таблица составлена на основании данных из работы [5]. *Note: The table was compiled on the basis of data from [5].

Как видно из данных, представленных в табл. 2, только КПС трех серотипов: 7F, 14 и 33F ‒ имеют неионогенную природу и 11 серотипов: 1, 3, 4, 6A, 6B, 8, 9V, 9N, 11A, 19A и 19F – линейное строение.

ОЧИСТКА КАПСУЛЬНОГО ПОЛИСАХАРИДА

Очистка КПС – сложный и многостадийный процесс, лежащий в основе производства вакцины, где необходимо минимизировать потери продукта, с одной стороны, а с другой – наиболее полно удалить примеси. Высокая чистота, предъявляемая к полисахариду, связана с тем, что антигены бактериальной клетки (липополисахарид, нуклеиновые кислоты, белки) могут придавать конечному продукту пирогенность.

Для достижения высокой степени чистоты полисахаридов, используемых в медицине и производстве лекарственных препаратов, были разработаны новые методы очистки на основе фракционного осаждения, ионообменной хроматографии, гель-фильтрации и аффинной хроматографии. Очистка полисахаридов включает несколько стадий, некоторые из них являются общими для различных серотипов. Классический способ очистки КПС, используемый при производстве вакцин, состоит из несколько этапов: осаждение этанолом и катионным детергентом с последующим центрифугированием, а также удаление белковой фракции с применением фенола [6]. Однако в ряде исследований, связанных с очисткой КПС, показано, что проведение диафильтрации и сочетание различных типов хроматографии позволяют отказаться от использования токсичных реагентов.

R. Zanardo и соавт. [11] разработали метод, который включает следующие этапы: 1) разделение клеток тангенциальной фильтрацией с дальнейшим концентрированием фильтрата при помощи тангенциальной ультрафильтрации (50 кДа), 2) диафильтрация в присутствии додецилсульфата натрия с использованием мембраны с порогом отсечения 30 кДа, 3) осаждение 5%-ной трихлоруксусной кислотой, 4) осаждение 20 и 60%-ным этанолом, 5) анионообменная хроматография. В ходе хроматографической очистки примеси сорбировались на материале колонки (Q-Sepharose ‒ сильный анионообменник), а КПС неионогенной природы свободно элюировался. Была достигнута относительная чистота 439 мг КПС/мг нуклеиновых кислот и 146 мг КПС/мг белков.

N. Suárez и соавт. [12] для очистки S. pneumo-niae 14 серотипа предложили исключить использование органических растворителей за счет включения в процесс аффинной хроматографии. Так, после клеточного лизиса дезоксихолатом натрия и центрифугирования супернатант концентрировали с помощью ультрафильтрации, диализовали и лиофилизировали. Полученный образец суспендировали в натрий-фосфатном буфере, центрифугировали, супернатант наносили на хроматографическую колонку, содержащую агарозу с соевым лецитином, который имеет сродство к D-галактозе и N-ацетил-D-глюкозамину КПС. Сорбированный КПС элюировали 0.1 М раствором D-галактозы в фосфатном буфере, затем подвергали диализу против дистиллированной воды и лиофильно высушивали.

В работе S. Jung и др. [13] описан метод очистки КПС серотипа 19A. Исследователи, опираясь на существующие патенты очистки полисахаридов, разработали упрощенный способ, который включал следующие стадии: доведение pH клеточного лизата до 4.5, фракционирование 50–80%-ным этанолом и диафильтрацию КПС. Выход целевого продукта составил 31.2 ± 3.11 мг из 1 л культуры. Как уже было сказано ранее, методы очистки могут отличаться друг от друга в зависимости от свойств полисахарида.

Так, Frank & Soikia [14] запатентовали способ очистки без использования этанола; он подходит для получения полисахарида следующих серотипов: 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F и 23F. Способ очистки включает ряд стадий, среди которых: клеточный лизис, осветление, концентрирование, осаждение, промывание осажденных гранул полисахарида буфером, сбор гранул, растворение полисахарида в физиологическом буфере, осветление раствора, добавление йодида калия, осветление раствора полисахарида и его лиофилизация. Для штаммов 7F, 14 и 33F предложена иная процедура очистки, в которую входят следующие этапы: клеточный лизис, осветление, концентрирование, осаждение примесей белка и нуклеиновой кислоты из концентрированного раствора полисахарида цетилтриметиламмонием бромидом (ЦТАБ), осветление раствора, рециркуляция раствора полисахарида через анионообменную колонку, промывка колонки 4‒5 объемами фосфатного буфера, добавление 0.5%-ного йодида калия к раствору полисахарида для осаждения ЦТАБ, осветление раствора полисахарида с помощью ультрафильтрации и его лиофилизация. Анионообменная хроматография применяется для серотипов, которые не осаждаются ЦТАБ (7F, 14, 33F).

В другом патенте, Y. Yuan и соавт. [15], предложен метод упрощенной очистки полисахаридов, который может быть применен для некоторых серотипов (1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F) и включает в себя ряд стадий. Это наработка бактериальных клеток определенного штамма; получение клеточного лизата, его осветление с помощью центрифугирования или фильтрации и диафильтрация; закисление ретентата до pH < 4.5 и инкубация подкисленного раствора при комнатной температуре (для серотипа 19А при температуре 4°С) в течение времени, которое достаточно для осаждения белков и нуклеиновых кислот; фильтрация или центрифугирование ретентата для получения осветленного раствора полисахарида, фильтрование через мембрану с активированным углем и, наконец, диафильтрация с получением концентрированного очищенного раствора полисахарида. Заключительной стадией была стерилизующая фильтрация. Авторы указывают на необходимость контролировать значения pH на стадиях очистки. Так, они рекомендуют на стадии осаждения белка и нуклеиновых кислот снижать pH до примерно 3.5, а на стадии, предшествующей стерилизующей фильтрации, удерживать pH в пределах 5.5–7.5. Подобным способом можно добиться удаления 98% примесных белков.

В работе V.M. Gonçalves [10] предложен способ очистки КПС серотипов 6B и 22F с применением ферментативной обработки. Удаление клеточной массы проводили с помощью тангенциальной микрофильтрации с использованием мембран с диаметром пор 0.22 мкм. Фильтраты концентрировали в 10 раз по объему методом тангенциальной ультрафильтрации на мембранах с порогом отсечения 100 и 30 кДа соответственно. Затем полученные концентраты обрабатывали водным раствором этанола (25% для 6B и 28% для 22F); при этом выпадал осадок, который отделяли центрифугированием при 17 696 g в течение 60 мин и удаляли, а надосадочную жидкость собирали, снова обрабатывали водным раствором этанола (50% для 6B и 60% для 22F) и отделяли выпавший осадок центрифугированием в режиме, указанном выше. Осадок суспендировали в воде и нерастворившуюся фракцию отделяли центрифугированием при 17 696 g в течение 60 мин. Первое и второе осаждение этанолом проводили в течение 12 ч при 4°C. Кислотность растворов КПС доводили до pH 7 буфером, содержащим 50 мМ Трис-HCl, 2 мМ MgCl2 и 20 мМ NaCl, и вносили фермент бензонуклеазу из расчета 1 единица активности (е.а.)/мг нуклеиновых кислот, инкубировали в течение 4 ч при 37°C и перемешивании со скоростью 100 об/мин. Затем последовательно, с 2-часовым интервалом, добавляли протеазы: проназу, трипсин и наргазу ‒ в соотношении 1 е.а./мг белка; полученную смесь инкубировали 12 ч при 37°С и перемешивании (100 об/мин). После ферментативной обработки добавляли дезоксихолат натрия и ЭДТА до конечной концентрации 0.3% и 2 мМ соответственно и инкубировали в течение 1 ч. Примеси с низкой молекулярной массой, образующиеся в результате ферментативных реакций и обработки детергентом, удаляли с помощью тангенциальной ультрафильтрации с порогом отсечения 100 кДа для КПС 6B или 30 кДа для КПС 23F. Очищенный КПС подвергали стерилизующей фильтрации через мембрану с диаметром пор 0.2 мкм и лиофильно высушивали. Применение ферментативной обработки для удаления ДНК, РНК и белков позволяет достичь высокой чистоты КПС, удовлетворяющей требованиям ВОЗ (содержание белков и нуклеиновых кислот в конечном продукте КПС должно быть менее 2%), хотя эта процедура сильно повышает стоимость процесса очистки.

C. Lee и соавт. [16] предложили универсальный метод очистки, который может быть применен к 15 серотипам: 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 11A, 14, 18C, 19A, 19F, 22F и 23F. После культивирования S. pneumoniae к культуральной жидкости добавляли 10%-ный раствор дезоксихолата натрия (до конечной концентрации 0.1%) для лизирования клеток с последующим центрифугированием. Супернатант собирали и закисляли до pH ≤ 5.0 уксусной кислотой для осаждения примесей, таких как растворимые белки, рК которых лежит в этом интервале. Супернатант пропускали через фильтр с диаметром пор 0.2 мкм и подвергали ультрафильтрации и диафильтрации против чистой воды (10-кратный объем по отношению к супернатанту) с использованием мембран с порогом отсечения 50 кДа (для серотипов 4, 5 и 14) или 100 кДа (для серотипов 1, 2, 3, 6A, 6B, 7F, 9V, 11A, 18C, 19A, 19F, 22F и 23A). К раствору КПС добавляли 10%-ный раствор ЦТАБ до конечной концентрации 2%. Отрицательно заряженные КПС серотипов 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 9V, 11A, 18C, 19A, 19F, 22F и 23A осаждались с некоторыми отрицательно заряженными примесями, включая нуклеиновые кислоты. В случае КПС серотипов 7F и 14, не имеющих заряда, осаждались только примеси, а КПС оставался в растворе. Таким образом, после центрифугирования раствора, обработанного ЦТАБ, для отрицательно заряженных КПС собирали осадок, а для нейтральных КПС ‒ супернатант. К осажденному КПС добавляли 1 M раствор NaCl, а в супернатант КПС ‒ концентрированный раствор NaCl до конечной концентрации 1 M. Затем к полученным растворам КПС добавляли этанол в 1 М NaCl (осаждение 1 этанолом) до конечной концентрации 75% ‒ для высаживания КПС. Выпавший осадок отделяли центрифугированием, растворяли в воде, обрабатывали 6%-ным ацетатом натрия и 0.5%-ным дезоксихолатом натрия, доводили pH до 6.4, используя 8 М уксусную кислоту. К этому раствору добавляли этанол до конечной концентрации 20% (1, 3, 4, 5, 19A и 19F) или 33% (6A, 6B, 7F, 9V, 11A, 14, 18C, 22F и 23A) ‒ для осаждения примесей. После центрифугирования супернатант собирали и смешивали с 6%-ным ацетатом натрия и добавляли этанол (осаждение 2 этанолом) до конечной концентрации 75%. Выпавший осадок КПС отделяли центрифугированием, растворяли в воде и проводили колоночную хроматографию на гидроксиапатите для удаления остаточных примесей, которые связываются с материалом колонки.

Резюмируя вышесказанное, можно прийти к заключению, что для эффективной очистки и выделения КПС используют методы центрифугирования, тангенциальной фильтрации, осаждения и хроматографии; причем для достижения высокого выхода целевого продукта последовательность и кратность применения методов может варьировать. Кроме того, выбор метода и условий его проведения сильно зависит от структуры КПС. Наиболее ярко это проявляется для КПС серотипов 7F, 14 и 33F ‒ они не несут заряда, поэтому для них используют другие стратегии очистки. Таким образом, общая схема downstream процесса получения очищенного КПС выглядит так, как представлено на рис. 2.

Рис. 2.

Общая схема очистки КПС. Fig. 2. General scheme of capsule polysaccharide purification.

ОЧИСТКА ПОЛИСАХАРИД-БЕЛКОВЫХ КОНЪЮГАТОВ

Низкая иммуногенность полисахаридных вакцин при использовании для детей младше 2 лет привела к развитию направления конъюгированных вакцин, в которых активным действующим веществом является КПС, ковалентно связанный с белком [17, 18]. Иммуногенность такого рода вакцин определяется белком-носителем, методом конъюгации, соотношением КПС к белку-носителю, длиной цепи полисахарида [19]. Длина цепи полисахарида может быть уменьшена до одного или нескольких олигосахаридных остатков. Это, в свою очередь, повышает контроль над протеканием реакции конъюгации с белком-носителем и позволяет количественно определять число олигосахаридных остатков, вошедших в состав ПБК. Кроме того, благодаря достижениям в области химии углеводов, становится возможным получение олигосахаридов синтетическим путем, причем с высокой степенью чистоты [20].

А. Pawlowski с совт. [21] исследовали влияние молекулярной массы КПС серотипов 14 и 23 F на иммуногенность ПБК. В обоих случаях полисахариды были конъюгированы со столбнячным анатоксином (СА). Молекулярную массу КПС (6‒30 кДа и 40–150 кДа) регулировали в процессе ультразвуковой обработки; оценку иммуногенности проводили на лабораторных животных (кроликах, мышах). Авторы установили, что для ПБК на основе КПС серотипа 14 иммунный ответ усиливался при увеличении молекулярной массы последнего, в то время как для ПБК серотипа 23F влияния молекулярной массы КПС на иммуногенность не наблюдали.

J. Soubal и др. [22] предложили регулировать молекулярную массу КПС серотипа 6B путем кислотного гидролиза, проводить активацию окислением, а конъюгацию с СА ‒ восстановительным аминированием. Авторы получили полисахариды разных молекулярных масс: 1–10, 10–30 и 30–100 кДа ‒ и с разными уровнями окисления. Установлено, что для КПС серотипа 6B молекулярная масса ниже 10 кДа и степень окисления выше 24% звеньев приводила к потере иммуногенности.

Соотношение КПС к белку-носителю ‒ критически важный параметр, от которого зависит эффективность конъюгированной вакцины. В случае избыточного количества белка-носителя в составе ПБК иммунный ответ может снизиться. Эта проблема вызвана тем, что сформированный к белкам-носителям иммунитет подавляет формирование Т-зависимого иммунитета к КПС. Антитела вырабатываются не только на целевой антиген, то есть КПС, но и на носитель. При повторном использовании того же носителя, даже с другим целевым антигеном, предсуществующие антитела к носителю будут нейтрализовать весь комплекс, а значит иммунный ответ к КПС будет снижен. Таким образом, необходимо тщательно подбирать белок-носитель для формирования иммунитета к конкретному антигену [23]. Белковый компонент ПБК вызывает более сильный и продолжительный иммунный ответ, чем неконъюгированный полисахарид [24]. В дополнение стоит отметить, что эффективность конъюгированной вакцины сильно варьирует. Среди коммерческих вакцин против S. pneumoniae часто представлены конъюгаты с такими белками, как СА или CRM197. Однако в конъюгированных вакцинах применяют лишь несколько белков-носителей, наиболее изученных в настоящее время: дифтерийный анатоксин (ДА), СА, CRM197, гемофильный белок D и белковый комплекс внешней мембраны менингококка серогруппы B. ДА (58 кДа), СА (150 кДа) и CRM197 (58 кДа) происходят из бактериальных токсинов, детоксифицированных химическим или генетическим путем. Первоначально ДА и СА были выбраны в качестве носителей для конъюгированных вакцин против Haemophilus influenzae типа b из-за их безопасности, установленной за десятилетия вакцинации против столбняка и дифтерии.

CRM197 представляет собой нетоксичный вариант дифтерийного токсина и отличается от оригинала одной заменой ‒ глицина на глутаминовую кислоту в позиции 52. Эту мутацию получают с использованием технологии сайт-направленного мутагенеза, благодаря чему в молекуле CRM197 сохранены все остальные аминокислотные остатки, в том числе лизин, аминогруппы которого важны для реакции конъюгации. Это неоспоримое преимущество CRM197 перед анатоксинами. Кроме того, CRM197 представляет собой Т-клеточный эпитоп, который может трансформировать независимый от Т-клеток полисахаридспецифичный иммунный ответ в Т-хелперный [25], что позволяет считать его перспективным адъювантом нового поколения для использования в вакцинных и терапевтических препаратах. Имеются также данные [25] о том, что при использовании в качестве носителя для различных полисахаридов CRM197 подавление иммунного ответа на целевой иммуноген при последующем применении слабее, чем в случае СА. В настоящее время CRM197 можно выделить из супернатанта культур Corynebacterium diphtheriae C7(β197)tox(‒) или получить по технологии рекомбинантной ДНК в гетерологичных организмах. CRM197 широко используют в качестве носителя в лицензированных поливалентных менингококковых и пневмококковых конъюгированных вакцинах, конъюгированной вакцине против Haemophilus influenzae типа b, а также в вакцинах, находящихся в разработке. Белковый комплекс внешней мембраны менингококка серогруппы B также использовали в конъюгированной вакцине против Haemophilus influenzae типа b и в первом поколении пневмококковой конъюгированной вакцины.

Белок D, с молекулярной массой 40 кДа, выделяют с поверхности клеточной стенки нетипируемого (бескапсульного) штамма Haemophilus influenzae [26].

Следует заметить, что при производстве наиболее распространенных белков-носителей, СА и CRM197, приходится сталкиваться с некоторыми трудностями. Так, в случае СА необходим высокий уровень контроля качества продукции, ввиду возможной неполной детоксикации исходного материала, а также получение лицензии на проведение работ с микроорганизмами II группы патогенности. Что касается CRM197, то для его культивирования требуются сложные условия, при этом после процедуры очистки выход целевого продукта очень низкий ‒ особенно в случае получения нативного нерекомбинантного белка.

В связи с этим в настоящее время идет активный поиск новых ‒ более простых в производстве ‒ белков-носителей. Например, R. Yu и др. [27] сравнили иммуногенность двух наиболее известных белков-носителей: СА и CRM197 ‒ с нативным C-фрагментом столбнячного токсина. Это хорошо изученный белок, обладающий низкой аллергенностью и токсичностью, способный индуцировать иммунный ответ. По результатам исследования иммуногенности ПБК 14 и 23F серотипов с С-фрагментом в качестве носителя установлено, что такие препараты индуцируют стойкий, специфичный к полисахариду иммунный ответ на уровне, сопоставимом с СА и CRM197. Еще одним перспективным белком-носителем можно считать пневмококковый белок А. Этот важный фактор вирулентности пневмококков выделяют с поверхности клеточной стенки микроорганизма [28].

Основными способами конъюгации при получении ПБК являются реакции восстановительного аминирования, амидирования и этерификации. В настоящее время при производстве вакцин для профилактики пневмококковых инфекций используют восстановительное аминирование. Для этого проводят окисление КПС периодатом натрия (NaIO4) в нейтральной или слабощелочной среде, вносят белок-носитель и восстанавливают образующиеся основания Шиффа цианборгидридом натрия (NaBH3CN) или триацетоксиборгидридом натрия (NaBH(OAc)3). Однако недостатками этого способа является, во-первых, низкий выход реакции конъюгации и, как следствие, высокое содержание непрореагировавшего КПС и, во-вторых, присутствие восстанавливающих агентов, использовать которые приходится в большом избытке. В итоге эти недостатки усложняют процесс выделения и очистки ПБК.

В качестве перспективных способов получения конъюгатов рассматривают применение 1-циано-4-диметиламинопиридиния тетрафторбората для активации гидроксильных групп КПС с образованием реакционноспособных цианатных эфиров и метода активированных эфиров для образования амидной связи между активированным полисахаридом и аминогруппой белка; причем в этом случае удается достичь высокого выхода ПБК [29]. C. Perciani и соавт. [28] сравнили стратегии конъюгации с использованием хлорида 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния в качестве связующей молекулы (линкера) между активированными гидроксильными группами полисахарида и карбоксильными группами белка ‒ для образования между ними амидной связи ‒ и восстановительного аминирования, традиционно используемого при производстве конъюгированных вакцин. Показано, что первый способ получения более эффективен при связывании КПС серотипа 6B пневмококковым белком А, выделенным с поверхности клеточной стенки – 55% исходного КПС находилось в составе ПБК. Для того же ПБК, полученного путем восстановительного аминирования, это значение составляло 24%; при этом иммуногенность обоих вариантов ПБК была сопоставима.

Сложность процедуры очистки ПБК состоит в том, что полученные конъюгаты, как правило, имеют очень высокую молекулярную массу (порядка 500–1000 кДа) и могут обладать сшитой структурой. Также затрудняет задачу схожая структура ПБК и исходного КПС, из-за чего требуется тщательный подбор условий их разделения. Кроме того, необходимо полностью удалить низкомолекулярные примеси, остающиеся после реакции конъюгации. При производстве вакцин для очистки ПБК принято использовать гель-фильтрацию. Описаны различные методологии, которые могут быть применены для финальной очистки ПБК. Это гель-фильтрация [30, 31], гидрофобная хроматография [30, 31], ионообменная хроматография [30], обращенно-фазовая хроматография [32] и ультрафильтрация [3133]. Несмотря на то, что гель-фильтрация широко используется для анализа качества продукта [31], низкое разрешение и низкая связывающая способность (емкость) хроматографического носителя ‒ из-за большого размера полисахаридов и ПБК ‒ усложняют применение этой технологии в крупномасштабном производстве.

N. Suarez и др. [30] проанализировали эффективность очистки конъюгата КПС 14 серотипа с бычьим сывороточным альбумином (БСА) от избытка свободных реагентов с помощью различных хроматографических процедур: гель-фильтрации на сефарозе CL-6B, ионообменной хроматографии с последующей гель-фильтрацией и, наконец, хроматографии гидрофобного взаимодействия с использованием Sephadex LH-20. Когда реакционную смесь наносили на колонку с сефарозой CL-6B и изократически элюировали 0.1 М раствором формиата аммония (pH 6.0), наблюдали два пика: первый, на 230 минуте (tR1), содержал смесь свободного КПС и ПБК, а второй, на 430 минуте (tR2), соответствовал свободному БСА. При использовании ионообменной хроматографии свободный КПС не задерживался на колонке благодаря отсутствию заряженных групп в его структуре. ПБК и свободный БСА адсорбировались на колонке и выходили в градиенте NaCl (0.25–0.5 М) двумя пиками. В связи с тем, что наличие углеводов было выявлено в обеих фракциях, авторы посчитали процедуру неэффективной для очистки конъюгата от избытка белка-носителя. Они объединили эти две фракции, лиофилизовали, растворили в буфере и нанесли на колонку CL-6B. В этом случае пик tR1 (230 мин) содержал только конъюгат, тогда как пик tR2 (430 мин) соответствовал свободному БСА. В другом эксперименте исходную смесь наносили на колонку, заполненную Sephadex LH-20, используя дистиллированную воду в качестве элюента. Получено три раздельных пика: первый содержал свободный КПС, второй – очищенный конъюгат, третий – свободный БСА.

Y. He и соавт. [32] смогли добиться хорошего разделения ПБК и свободного полисахарида, используя обращено-фазовый сорбент с большим размером пор и градиентную систему с подвижной фазой A, состоящей из 0.2%-ного водного раствора трифторуксусной кислоты, и подвижной фазой B, состоящей из 0.15%-ной трифторуксусной кислоты в изопропаноле. Мембранная фильтрация также представляет интерес для очистки ПБК, поскольку не требует использования дополнительных растворителей [33]. Несмотря на большие размеры, ПБК беспрепятственно проходят через мембрану. Экстракция и осаждение относятся к методам очистки с высокой пропускной способностью, хотя не всегда удается достичь хорошего разрешения между конъюгатом и свободным полисахаридом. Кроме того, к перспективным технологиям относится ультрафильтрация ‒ она эффективна как для концентрирования различных промежуточных продуктов, так и для очистки ПБК от непрореагировавшего полисахарида.

Учитывая вышеизложенное, мы составили общую схему получения ПБК, представленную на рис. 3.

Рис. 3.

Общая схема получения ПБК. Fig. 3. General scheme of the production of polysaccharide-protein conjugates.

Быстрый рост устойчивости пневмококка к антибиотикам, ограниченный охват серотипов, а также высокая стоимость доступных в настоящее время полисахаридных вакцин ‒ все эти факторы стимулируют поиск новых вакцин-кандидатов, которые обеспечат защиту от широкого спектра серотипов пневмококка. В связи с тем, что полисахаридные вакцины проявляют низкую иммуногенность, необходимо тщательно подходить к подбору белков-носителей. Помимо традиционно принятых белков-носителей сейчас активно исследуют возможность их замены на более простые в производстве белки (например, пневмококковый белок А поверхности клеточной стенки) или рекомбинантные белки (например, CRM197).

Определение подходящих бактериальных серотипов, условий очистки и выделения КПС, получения ПБК, оптимизация выхода продукта ‒ ключевые этапы при создании вакцин для профилактики пневмококковой инфекции. Очистка КПС относится к наиболее трудоемким стадиям downstream-процесса. Основное внимание исследователей сосредоточено на выполнении требований ВОЗ по показателю чистота КПС (менее 2% остаточных белков и нуклеиновых кислот), а для этого необходимо работать над уменьшением числа стадий очистки и повышением их селективности. Эта задача осложняется тем, что разработать универсальную методику очистки для КПС всех серотипов S. pneumoniae невозможно ‒ из-за их различающейся структуры в зависимости от серотипа.

Этот обзор будет положен в основу разработки отечественной 16-валентной полисахаридной конъюгированной вакцины для профилактики пневмококковой инфекции, производство которой будет размещено на площадях ФГУП СПбНИИВС ФМБА России (Санкт-Петербург). Планируемое производство в полной мере сможет обеспечить потребность страны в такой вакцине.

Список литературы

  1. Cherazard R., Epstein M., Doan T.L., et al. Antimicrobial resistant Streptococcus pneumoniae: prevalence, mechanisms, and clinical implications. Am. J. Ther., 2017, 24(3), e361–e369. https://doi.org/10.1097/MJT.0000000000000551

  2. Wangirapan A., Ayuthaya S.I.N., Katip W., et al. Serotypes and vaccine coverage of Streptococcus pneumoniae colonization in the nasopharynx of Thai children in congested areas in Chiang Mai. Pathogens, 2020, 9(12), 988. https://doi.org/10.3390/pathogens9120988

  3. Hocknell R.E., Cleary D.W., Srifeungfung S., Clarke S.C. Serotype distribution of disease-causing Streptococcus pneumoniae in Thailand: a systematic review. Vaccine, 2019, 37(24), 3159–3166. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2019.04.085

  4. Алябьева Н.М., Блинова Т.А., Пономаренко О.А. и др. Молекулярное типирование Streptococcus pneumoniae методом мультиплексной полимеразной цепной реакции с учетом распространенности серотипов в Российской Федерации. Вопросы современной педиатрии, 2013, 12(6), 30–34. https://doi.org/10.15690/vsp.v12i6.871

  5. Geno K.A., Gilbert G.L., Song J.Y., et al. Pneumococcal capsules and their types: past, present, and future. Clin. Microbiol. Rev., 2015, 28(3), 871–899. https://doi.org/10.1128/CMR.00024-15

  6. Morais V., Dee V., Suárez N. Purification of capsular polysaccharides of Streptococcus pneumoniae: traditional and new methods. Front. Bioeng. Biotechnol., 2018, 145. https://doi.org/10.3389/fbioe.2018.00145

  7. Yother J. Capsules of Streptococcus pneumoniae and other bacteria: paradigms for polysaccharide biosynthesis and regulation. Ann. Rev. Microbiol., 2011, 65, 563–581. https://doi.org/10.1146/annurev.micro.62.081307.162944

  8. Larson T.R., Yother J. Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide is linked to peptidoglycan via a direct glycosidic bond to β-D-N-acetylglucosamine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2017, 114(22), 5695–5700. https://doi.org/10.1073/pnas.1620431114

  9. Cartee R.T., Forsee W.T., Schutzbach J.S., Yother J. Mechanism of type 3 capsular polysaccharide synthesis in Streptococcus pneumoniae. J. Biol. Chem., 2000, 275(6), 3907–3914. https://doi.org/10.1074/jbc.275.6.3907

  10. Gonçalves V.M., Takagi M., Carmo, T.S. Simple and efficient method of bacterial polysaccharides purification for vaccines production using hydrolytic enzymes and tangential flow ultrafiltration. In: Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology. Ed. A. Méndez-Vilas. Badajoz: FORMATEX, 2007, 1, 450–457.

  11. Zanardo R.T., Ferri A.L.S., Figueiredo D.B., et al. Development of a new process for purification of capsular polysaccharide from Streptococcus pneumoniae serotype 14. Brazilian J. Chem. Eng., 2016, 33(3), 435–443. https://doi.org/10.1590/0104-6632.20160333s20150140

  12. Suárez N., Fraguas L.F., Texeira E., et al. Production of capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae type 14 and its purification by affinity chromatography. Appl. Environ. Microbiol., 2001, 67(2), 969–971. https://doi.org/10.1128/AEM.67.2.969-971.2001

  13. Jung S.J., Seo E.S., Yun S.I., et al. Purification of capsular polysaccharide produced by Streptococcus pneumoniae serotype 19A. J. Microbiol. Biotechnol., 2011, 21(7), 734–738. https://doi.org/10.4014/jmb.1010.10043

  14. Frank A., Soikia M. Alcohol-free pneumococcal polysaccharide purification process. Patent No. 5,714,354 (USA), C12P19/04 (IPC), Publ. 02/03/1995.

  15. Yuan Y., Ruppen M., Sun, W.-Q., et al. Shortened purification process for the production of capsular Streptococcus pneumoniae polysaccharides. Patent WO2008118752A3, C08B 37/00, Publ. 11/20/2008.

  16. Lee C., Chun H.J., Park M., et al. Quality improvement of capsular polysaccharide in Streptococcus pneumoniae by purification process optimization. Front. Bioeng. Biotechnol., 2020, 8, 39. https://doi.org/10.3389/fbioe.2020.00039

  17. Song J.Y., Moseley M.A., Burton R.L., Nahm M.H. Pneumococcal vaccine and opsonic pneumococcal antibody. J. Infect. Chemother., 2013, 19(3), 412–425. https://doi.org/10.1007/s10156-013-0601-1

  18. Black S., Shinefield H.R., Fireman B., et al. Efficacy, safety and immunogenicity of heptavalent pneumococcal conjugate vaccine in children. Pediatr. Infect. Dis. J., 2000, 19(3), 187–195.

  19. Poolman J.T., Peeters C.C., van den Dobbelsteen G.P. The history of pneumococcal conjugate vaccine deve-lopment: dose selection. Expert Rev. Vaccines, 2013, 12(12), 1379–1394. https://doi.org/10.1586/14760584.2013.852475

  20. Генинг М.Л., Курбатова Е.А., Нифантьев Н.Э. Синтетические аналоги капсулярных полисахаридов Streptococcus pneumoniae и иммуногенная активность гликоконъюгатов. Биоорган. химия, 2021, 47(1), 3–28. https://doi.org/10.31857/S0132342321010073

  21. Pawlowski A., Källenius G., Svenson S.B. Preparation of pneumococcal capsular polysaccharide-protein conjugate vaccines utilizing new fragmentation and conjugation technologies. Vaccine, 2000, 18(18), 1873–1885. https://doi.org/10.1016/S0264-410X(99)00336-9

  22. Soubal J.P., Peña L., Santana D., et al. Procedure for the conjugation of the Streptococcus pneumoniae serotype 6B capsular polysaccharide to the tetanus toxoid. Biotecnol. Apl., 2013, 30(3), 199‒215. https://www.medigraphic.com/pdfs/biotecapl/ba-2013/ba133f.pdf

  23. Dagan R., Poolman J., Siegrist C.A. Glycoconjugate vaccines and immune interference: a review. Vaccine, 2010, 28(34), 5513–5523. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2010.06.026

  24. MacCalman T.E., Phillips-Jones M.K., Harding S.E. Glycoconjugate vaccines: some observations on carrier and production methods. Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 2019, 35(2), 93–125. https://doi.org/10.1080/02648725.2019.1703614

  25. Bröker M. Potential protective immunogenicity of tetanus toxoid, diphtheria toxoid and cross reacting material 197 (CRM197) when used as carrier proteins in glycoconjugates. Hum. Vaccin. Immunother., 2016, 12(3), 664–667. https://doi.org/10.1080/21645515.2015.1086048

  26. Micoli F., Adamo R., Costantino P. Protein carriers for glycoconjugate vaccines: history, selection criteria, characterization and new trends. Molecules, 2018, 23(6), 1451–1469. https://doi.org/10.3390/molecules23061451

  27. Yu R., Xu J., Hu T., Chen W. The pneumococcal polysaccharide-tetanus toxin native C-fragment conjugate vaccine: the carrier effect and immunogenicity. Mediators Inflamm., 2020, 2020, 9596129. https://doi.org/10.1155/2020/9596129

  28. Perciani C.T., Barazzone G.C., Goulart C., et al. Conjugation of polysaccharide 6B from Streptococcus pneumoniae with pneumococcal surface protein A: PspA conformation and its effect on the immune response. Clin. Vaccine Immunol., 2013, 20(6), 818–826. https://doi.org/10.1128/cvi.00754-12

  29. Zhao J., Hu G., Huang Y., et al. Polysaccharide conjugate vaccine: a kind of vaccine with great development potential. Chin. Chem. Lett., 2021, 32(4), 1331–1340. https://doi.org/10.1016/j.cclet.2020.10.013

  30. Suarez N., Massaldi H., Fraguas L.F., Ferreira F. Improved conjugation and purification strategies for the preparation of protein-polysaccharide conjugates. J. Chromatogr. A, 2008, 1213(2), 169–175. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2008.10.030

  31. McMaster R. Purification of polysaccharide-protein conjugate vaccines by ultrafiltration with ammonium sulfate solutions. Patent US 6146902A (USA), G01N 1118, CO7G 17/00, A61K 39/385 (IPC), Publ. 11/14/2000.

  32. He Y., Hou W., Thompson M., et al. Size exclusion chromatography of polysaccharides with reverse phase li-quid chromatography. J. Chromatogr. A, 2014, 1323, 97–103. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2013.11.010

  33. Shin J.-H., Yang J.-H., Ham D.-S., Park M.-H., et al. Polyvalent pneumococcal polysaccharide-protein co-njugate composition. Patent US 20150190520 A1 (USA), A61K 47/48, 39/39, 39/09 (IPC), Publ. 07/09/2015.

Дополнительные материалы отсутствуют.