Биотехнология, 2023, T. 39, № 2, стр. 87-98

Материалы

В работе использовали коммерческие ФП: Alcalase^® и Flavourzyme^® 1000L (Novozymes). Гидролизаты получали из изолята соевого белка с массовой долей белка 92% на сухое вещество (%Nx6.25), определенной методом Кьельдаля.

В качестве белков-маркеров использовали коммерческий набор с молекулярными массами в диапазоне 14.4–116 кДа (Thermo Fisher Scientific, США). В качестве субстратов для определения активности ферментов использовали казеинат натрия, гемоглобин и L-лейцин-4-нитроанилид (Sigma, США).

Штамм микроорганизма

Объектом исследования был штамм A. oryzae 107 ВКПМ F-929 – продуцент кислых и слабокислых протеаз [8]. Для получения посевного материала использовали среду сусло‒агар (%): солодовое сусло 7°Б – 98.0, агар-агар – 2.0, рН 6.2. Штамм выращивали на агаризованной среде в течение 7 сут при 30°С и 7 сут при 22°С. Споровый посевной материал на агаризованной среде хранили при температуре 5°C не более 3 месяцев.

Условия селекции и мутагенеза

Для получения споровых суспензий споры смывали с агаризованной среды 0.1%-ным раствором Tween-80 и пропускали через стеклянный фильтр S2 ПОР100 (SIMAX, Чехия). Для ультрафиолетового (УФ) облучения использовали споровые суспензии с титром 10³ клеток/см³. Гамма-облучению подвергали споровые суспензии с титром 10⁶ клеток/см³. Титр устанавливали с использованием стерильной дистиллированной воды.

Мутагенез спор штамма A. oryzae 107 проводили, используя методы, разработанные ранее для штаммов рода Aspergillus [9]. УФ-облучение проводили в камере УФК-3 (“Касимовский приборный завод”, Россия) при длине волны 254 нм и мощности излучения 30 Вт. Для гамма-мутагенеза использовали установку камерного типа ГУТ-200М (НИЦ “Курчатовский институт”, Россия) с радиоактивным источником кобальт-60. Гамма-облучение проводили при 20–22°С в течение 6 ч.

При проведении селекции для рассева спор продуцента использовали среду Чапека следующего состава, %: NaNO₃ – 0.91, KCl – 0.05, MgSO₄⋅7H₂O – 0.05, KH₂PO₄ – 0.1, агар-агар – 2.0, ‒ добавляя в качестве индукторов синтеза протеаз 1% желатина говяжьего пищевого, казеината натрия, обезжиренного сухого молока или мясного пептона (все препараты российских производителей). В качестве ограничителя роста добавляли Triton Х-100 в конечной концентрации 0.1% к массе среды. Для рассева облученных споровых суспензий использовали среду Чапека с 1% казеината натрия к массе среды.

Глубинное культивирование в колбах

Продуцент выращивали на термостатируемых качалках (250 об./мин) при 31 ± 1°C в течение 120 ч в колбах объемом 750 см³ с 50 см³ ферментационной среды. В качестве исходной использовали следующую среду, %: ячменная мука – 3.0, пшеничные отруби – 3.0, KH₂РО₄ – 1.5, рН 5.7 ± 0.2. Среды засевали 2 см³ суспензии спорового посевного материала с титром 10⁶ спор/см³. Биомассу культуры отделяли центрифугированием при 10 750 g в течение 5 мин. Культуральную жидкость (КЖ) использовали для определения активности целевых ферментов.

Ферментация в лабораторных ферментерах и получение образца сухого ФП

Глубинное культивирование полученного в результате проведенных исследований мутантного штамма A. oryzae-Со-28 проводили в лабораторных ферментерах КФ 104/3 (ООО “Проинтех”, Россия) с геометрическим объемом 3 л и рабочим объемом 1.35 л, оснащенных системами автоматического регулирования рН, рО_2, температуры, барботерами для подачи воздуха и двухъярусной мешалкой. Инокуляты для засева ферментеров получали культивированием гриба в качалочных колбах (250 об./мин) при 30°C в течение 24 ч на средах, аналогичных ферментационным, но без пеногасителя. Доза засева ферментеров инокулятом – 10%. Ферментацию проводили в течение 120 ч на двух средах. Среда № 1, %: ячменная мука – 4, пшеничные отруби – 5, КН₂РО₄ – 1, пеногаситель Пропинол – 0.1, рН среды естественный – 5.0–6.5. Среда № 2, %: обезжиренная соевая мука – 1, пшеничные отруби – 5, КН₂РО₄ – 0.5, пеногаситель Пропинол – 0.1, водопроводная вода, рН среды естественный – 5.8–7.5. Ферментацию проводили при 30°C, при аэрации 1 объем воздуха на 1 объем среды в мин, поддерживая рО₂ выше 30% за счет скорости перемешивания.

Биомассу глубинной культуры отделяли центрифугированием на центрифуге Beckman Coulter J6-MI (Beckman, США) при 6500 об./мин в течение 30 мин. Супернатант КЖ высушивали с помощью лабораторной распылительной сушилки марки Mini Spray Dryer B-290 (Buchi Labortechnik AG, Швейцария).

Активность протеолитических ферментов

Активность протеаз определяли по методике, разработанной Sigma-Aldrich [10], с небольшими модификациями. Так, активность щелочной сериновой протеазы определяли при рН 10.0 и 37°С, используя в качестве субстрата казеинат натрия; общую протеолитическую активность – при рН 7.2 и 37°С с казеинатом натрия в качестве субстрата; активность кислой протеазы – при рН 4.7 и 37°С с гемоглобином в качестве субстрата.

За единицу протеолитической активности принимали количество фермента, которое за 1 мин при 37°С катализирует переход в не осаждаемое трихлоруксусной кислотой состояние такого количества соответствующего субстрата, которое содержит 1 мкмоль тирозина.

LAP-активность определяли по методике, разработанной Sigma-Aldrich® и основанной на действии аминопептидазы на субстрат L-лейцин-4-нитроанилид (с высвобождением п-нитроанилина, окрашенного в желтый цвет) при температуре 37°С и рН 7.2. За единицу LAP-активности принимали такое количество фермента, которое гидролизует 1.0 ммоль L-лейцин-4-нитроанилида до L-лейцина и п-нитроанилина за 1 мин (https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/356/218/l6007enz.pdf). Содержание растворимого белка определяли по методу Лоури.

В гидролизатах соевого изолята определяли содержание общего белка по методу Кьельдаля и выход свободных аминокислот нингидриновым методом. Результаты получали не менее чем в трех повторах.

Электрофорез белков в полиакриламидном геле

Электрофорез в денатурирующих условиях проводили в 12%-ном ПААГ в 25 мМ трис-глициновом буфере, pH 8.3, с 0.1% SDS на приборе Mini PROTEAN Tetra System (Bio-Rad, США). Гель окрашивали Coomassie G-250 (Amresco, США). В качестве маркеров молекулярной массы использовали коммерческий набор (Thermo Fisher Scientific), в состав которого входят следующие белки: β-галактозидаза (116.0 кДа), бычий сывороточный альбумин (66.2 кДа), овальбумин (45.0 кДа), лактатдегидрогеназа (35.0 кДа), REase Bsp981 Escherichia coli (25.0 кДа), β-лактоглобулин (18.4 кДа), лизоцим (14.4 кДа).

Масс-спектрометрический анализ

Анализ проводили в ЦКП “Промышленной биотехнологии” ФИЦ “Фундаментальные основы биотехнологии” РАН (Москва, Россия) на масс-спектрометре UltraflexXtreme (Bruker Daltonik GmbH, Германия). Исследуемый белок вырезали из полиакриламидного геля, обрабатывали трипсином, гидролизат анализировали методом MALDI-TOF-масс-спектрометрии. Обработку полученных данных проводили с использованием программы Bruker Data Analysis (Brucker Corporation, США). Для поиска исследуемого фермента по масс-спектрам в базах данных NCBI и SWISS-PROTT использовали программу Peptide Mass Fingerprint (Matrix Science Inc., США).

Гидролиз изолята соевого белка

Гидролиз проводили в течение 3 ч при температуре 50°С при рН 6.0–6.2 в водной суспензии изолята соевого белка при концентрации субстрата 10% и постоянном перемешивании 1100 об./мин. Коммерческий ФП Flavozyme 1000L и лабораторные образцы ФП: Протооризин-1 и Протооризин-2, ‒ полученные на основе мутантного штамма A. oryzae-Со-28, дозировали по LAP-активности из расчета 20 ед/г сырья. ФП Alcalase^® вносили в количестве 1.5% к массе субстрата. После гидролиза ферменты инактивировали при 95°С в течение 10 мин. Полученные гидролизаты центрифугировали при 10 750 g в течение 5 мин, осадок высушивали до постоянной влажности и определяли содержание общего белка и выход свободных аминокислот. Контрольный вариант инкубировали в аналогичных условиях (3 ч, 50°С, 1100 об./мин) без внесения ФП. Эффективность гидролиза соевого изолята оценивали по исчезновению белковых полос с молекулярной массой выше 10 кДа при анализе электрофоретической подвижности в SDS-ПААГ.

Повышение уровня LAP-активности штамма A. oryzae 107 с помощью селекции и мутагенеза

Синтез внеклеточных грибных аминопептидаз может регулироваться катаболитной репрессией или другими факторами, влияющими на синтез протеолитических ферментов на уровне транскрипции и посттранскрипционных модификаций при участии других протеаз [11]. Известно, что способность грибов рода Aspergillus к синтезу LAP часто коррелирует с общей протеолитической активностью [12]. В связи с этим на первом этапе исследований споровые суспензии A. oryzae 107 рассевали на селективные агаризованные среды с добавлением 1% индукторов протеаз: желатина, пептона, казеината натрия, обезжиренного сухого молока, ‒ которые служили также источниками углерода. Основным критерием для отбора селектантов была LAP-активность при глубинном культивировании в колбах. Продуцент, помимо синтеза кислых и слабокислых протеаз, проявлял протеолитическую активность в щелочной среде, что указывало на присутствие сериновой протеазы ‒ предположительно оризина. Кроме того, сериновая протеаза из A. oryzae была ранее нами использована для трансформации штамма Penicillium canescens RN3-11-7 (niaD^‒), что позволо получить продуцент сериновой протеазы и гемицеллюлаз – штамм P. canescens Alc_Aor cl. 25 [13]. По литературным данным, штаммы A. oryzae продуцируют также нейтральные протеазы [5, 14], поэтому для получения продуцента протеолитического комплекса, эффективного при глубоком гидролизе различных белоксодержащих субстратов, в клонах с максимальной LAP-активностью контролировали и общую протеолитическую активность при рН 4.7, 7.2 и 10.0.

Активные варианты продуцента отбирали по скорости роста колоний, морфологическим признакам, интенсивности спорообразования. Использование непрозрачных агаризованных сред с казеинатом натрия и сухим молоком позволило рассматривать в качестве критерия отбора активных клонов диаметр зоны гидролиза белкового субстрата. На среде с сухим молоком регистрировали наибольшее разнообразие морфологических вариантов культуры, однако казеинат натрия обеспечил более четкую корреляцию морфологических характеристик колоний с продуктивностью отобранных клонов. Колонии пересевали на среду Чапека с казеинатом натрия для накопления посевного материала. После второго пассажа активность клонов проверяли при глубинном культивировании в колбах.

В результате нескольких последовательных этапов рассева на среде с казеинатом натрия был отобран вариант A. oryzae 21-154, у которого по сравнению с общей популяцией штамма LAP-активность была выше на 76%, протеолитическая активность в кислой среде ‒ на 10%, в нейтральной – на 35%, в щелочной – на 55% (табл. 1).

Второй этап исследований включал УФ-мутагенез штамма A. oryzae 21-154. В соответствии с ранее разработанной схемой [9], суспензию спор A. oryzae 21-154 облучали в непрерывном режиме для определения экспозиции, обеспечивающей максимальное снижение выживаемости спор продуцента и отбор наиболее продуктивных клонов. Далее при выбранной экспозиции проводили УФ-мутагенез в дробном режиме.

УФ-мутагенез в непрерывном режиме обеспечил снижение выживаемости спор продуцента до 1.1–4.9% (табл. 2). Минимальное количество спор сохраняло жизнеспособность при 4.5 мин облучения, далее выживаемость увеличивалась, что можно объяснить включением процесса фоторепарации [9]. При повторном УФ-облучении культура (штамм A. oryzae-83, мутант первого поколения) была более устойчива к действию мутагена по сравнению с исходным штаммом A. oryzae 21-154. Применение дробного УФ-мутагенеза позволило снизить выживаемость A. oryzae-83 до 0.7–2.4%. В результате двух сеансов УФ-мутагенеза LAP-активность штамма A. oryzae 21-154 была увеличена на 72%, кислой протеазы – на 30%, нейтральной и щелочной протеаз – на 15%.

Далее споровые суспензии УФ-мутанта второго поколения, штамма A. oryzae-83-21, подвергали воздействию различных доз γ-излучения. Наиболее эффективный мутагенез вызывали дозы 1250–1750 Гр, при которых выживаемость спор составила 0.003–0.02% (табл. 3). Последовательное облучение дозами 1500 и 1750 Гр позволило отобрать штамм A. oryzae-Со-28, LAP-активность которого была на 50% выше, чем у A. oryzae-83-21, при сохранении высокого уровня экспрессии сопутствующих протеаз.

Установлено, что на каждом этапе мутагенеза и селекции значительно увеличивалась LAP-активность, а также общая протеолитическая активность при рН 4.7, 7.2 и 10.0 (рис. 1). В результате мутагенеза штамма A. oryzae 107 с использованием УФ и γ-облучения был получен штамм A. oryzae-Со-28 с повышенной в 4.5 раза активностью LAP, на 62% активностью кислой протеазы и почти в 2 раза нейтральной и сериновой протеаз.

Рис. 1.

Увеличение продуктивности штамма A. oryzae на различных этапах селекции. I – исходный штамм A. oryzae 107, II – селектант A. oryzae 21-154, III – УФ-мутант A. oryzae-83-21, IV – штамм A. oryzae-Со-28, полученный с помощью γ-мутагенеза. Fig. 1. Increase in A. oryzae productivity at different stages of selection. I – original A. oryzae 107 strain, II – A. oryzae 21-154 selectant, III – A. oryzae-83-21 UV mutant, IV – A. oryzae-Co-28 strain obtained by γ-mutagenesis.

На электрофореграмме КЖ исходного штамма (рис. 2) присутствовали две четкие полосы белков, соответствующие, согласно данным масс-спектрометрии, α-амилазе А  A. oryzae ATCC 42149/RIB 40 (AMY3, 51.4 кДа) и аспергиллопепсину О A. oryzae ATCC 42149/RIB 40 (PEPA, 36 кДа). На электрофореграммах КЖ A. oryzae-Со-28, помимо α-амилазы и аспергиллопепсина, появились дополнительные полосы, соответствующие лейцинаминопептидазе А A. oryzae ATCC 42149/RIB 40 (LAPA, 40 кДа) и предшественнику щелочной протеазы-1 A. oryzae ATCC 42149/RIB 40 (ALP1, 29 кДа).

Рис. 2.

Электрофореграмма белков культуральной жидкости исходного штамма A. oryzae 107 (1) и мутантного A. oryzae-Со-28 (2). M ‒ маркеры молекулярных масс белков (Thermo Fisher Scientific); AMY3 ‒ α-амилаза А; PEPA ‒ аспергиллопепсин О; LAPA ‒лейцинаминопептидаза А; ALP1 ‒предшественник щелочной протеазы-1. Fig. 2. Electrophoregram of the proteins in the culture liquid of original strain A. oryzae 107 (1), and mutant strain A. oryzae-Co-28 (2). M ‒ protein molecular mass markers (Thermo Fisher Scientific, USA); AMY3 ‒ α-amylase A; PEPA ‒ aspergillopepsin O; LAPA ‒ leucine aminopeptidase A; ALP1 ‒ alkaline protease-1 precursor.

Глубинное культивирование мутантного штамма A. oryzae-Со-28 в колбах и лабораторных ферментерах

Проведен подбор условий культивирования мутантного штамма для максимальной реализации его потенциала биосинтеза протеолитических ферментов, прежде всего LAP. Продуцент выращивали на средах, содержащих в качестве основных компонентов различные количества ячменной, соевой, кукурузной, овсяной муки, солодовых ростков, пшеничных отрубей. Для синтеза LAP наиболее благоприятными оказались среды на основе ячменной и соевой муки.

На основании результатов экспериментов по подбору компонентов ферментационных сред в колбах, для культивирования мутантного штамма в лабораторных ферментерах были выбраны две среды:

Среда № 1: ячменная мука – 4%, пшеничные отруби – 5%, КН₂РО₄ – 1.0%.

Среда № 2: обезжиренная соевая мука – 1%, пшеничные отруби – 5%; КН₂РО₄ – 0.5%.

Из результатов, представленных на рис. 3., можно сделать вывод о возможности масштабирования процесса глубинного культивирования мутантного штамма A. oryzae-Co-28. Максимальная активность LAP наблюдалась на 120 ч роста и составила около 40 ед/мл на обоих вариантах ферментационных сред. Активность сопутствующих ферментов (кислой и щелочной протеаз) была выше соответственно в 2.5 и 1.5 раза на среде с ячменной мукой, чем с соевой мукой.

Рис. 3.

Активность LAP (1), кислой протеазы (2), щелочной протеазы (3) при культивировании A. oryzae-Со-28 в лабораторных ферментерах: a – на среде № 1 (с ячменной мукой), b – на среде № 2 (с соевой мукой). Fig. 3. Activity of LAP (1), acid protease (2), and alkaline protease (3) during cultivation of A. oryzae-Co-28 in laboratory fermenters: a – medium 1 (with barley flour), b – medium 2 (with soy flour).

Компонентный состав и основные характеристики образцов ФП “Протооризин”

Из КЖ мутантного штамма A. oryzae-Со-28 методом распылительной сушки были получены образцы концентрированного комплексного препарата Протооризин, предназначенного для глубокого гидролиза белка. Определены основные характеристики ФП Протооризин-1 и Протооризин-2, полученных при ферментации A. oryzae-Со-28 соответственно на среде № 1 (с ячменной мукой) и среде № 2 (с соевой мукой), в сравнении с коммерческим ФП – Flavourzyme® 1000L (Novozymes, Дания).

По результатам, приведенным в табл. 4 и на рис. 4, можно говорить о том, что состав ферментационной среды существенно влиял на содержание в ФП сопутствующих протеаз, прежде всего аспергиллопепсина, активность которого на среде с ячменной мукой почти в 2 раза выше, чем на среде с соевой мукой. В то же время уровень активности LAP был практически одинаков в обоих ФП и сравним с коммерческим препаратом Flavourzyme® 1000L, широко применяемым при получении белковых гидролизатов пищевого и лечебно-профилактического назначения. Активность сопутствующих протеаз в ФП Протооризин-1 и Протооризин-2 в среднем была в 25–50 раз выше, чем в коммерческом аналоге, что позволяет рассматривать ФП на основе A. oryzae-Со-28 как комплексные препараты протеаз эндо- и экзодействия.

Рис. 4.

Электрофореграмма белков, входящих в состав Протооризина-1 (1) и Протооризина-2 (2). Условные обозначения и ссылки см. в подписи к рис. 2. Fig. 4. Electrophoregram of the protein composition of the Protoorizin-1 (1) and Protoorizin-2 (2). For symbols and references, see the legend to fig. 2.

Среди мажорных белков в составе Протооризина-1 и Протооризина-2 отсутствовали нейтральные протеазы, но значимым компонентом протеолитического комплекса была кислая протеаза ‒ аспергиллопепсин (PEPA). По данным М. Merz и др. [5], в состав Flavourzyme® 1000L входят две нейтральные протеазы, но отсутствует аспергиллопепсин. В то же время Протооризин-1 и Протооризин-2 проявляют достаточно высокую протеолитическую активность в нейтральном диапазоне рН, возможно, за счет суммарного действия кислой и сериновой протеаз.

Соевый белок характеризуется сбалансированным аминокислотным составом и служит сырь-ем для получения гидролизатов пищевого, кормового и лечебно-профилактического назначения. В то же время основные белки сои: глицинин и β-конглицинин (~70% от всех белков сои) ‒ обладают сильным иммуногенным действием и устойчивы к термообработке. Эффективным способом устранения антипитательных свойств соевых белков и повышения их пищевой ценности считается ферментативный гидролиз до низкомолекулярных пептидов [15, 16]. Для глубокого гидролиза соевого белка при получении пищевых гидролизатов в мировой практике наиболее широко используют сочетание двух ФП: бактериальной сериновой протеазы Alcalase^® и Flavourzyme®. Alcalase^® быстро гидролизует белки до пептидов, снижая иммуногенность основных белков сои и повышая выход растворимого белка. Flavourzyme® повышает эффективность гидролиза, увеличивая выход свободных аминокислот и формируя удовлетворительные органолептические свойства гидролизатов, главным образом за счет устранения горечи пептидов, образовавшихся при действии препарата Alcalase^® [1, 15, 16].

При гидролизе изолята соевого белка в качестве эталонной комбинации ФП, обеспечивающей наибольшую степень гидролиза, использовали сочетание Alcalase^® в дозировке 1.5% к массе субстрата с Flavourzyme® 1000L в дозе 20 ед LAP/г субстрата. Предполагая, что присутствие в ФП на основе A. oryzae-Со-28 сериновой и аспартатной эндопротеаз достаточно для моделирования действия препарата Alcalase^®, в опытных вариантах мы использовали только Протооризин-1 и Протооризин-2, дозируя их по LAP-активности: 20 ед/г субстрата. Эффективность гидролиза оценивали методом Кьельдаля, по выходу свободных аминокислот и растворимого белка, определяемого по разнице между содержанием общего белка в навеске субстрата и в нерастворимом осадке (рис. 5). Эффективность гидролиза соевого белка также оценивали по исчезновению на электрофореграммах белковых полос с молекулярной массой выше 10 кДа (рис. 6).

Рис. 5.

Анализ эффективности гидролиза соевого белка под действием коммерческих и разработанных ферментных препаратов. Содержание растворимого белка (a) и свободных аминокислот (b) в изоляте соевого белка, не обработанном ФП (1), обработанном ФП Alcalase^® + Flavourzyme® 1000L (2), Протооризин-1 (3), Протооризин-2 (4). Fig. 5. Analysis of the efficiency of soy protein hydrolysis under the action of commercial and developed enzyme preparations. Content of soluble protein (a) and free amino acids (b) in untreated soy protein isolate (1), and in soy protein isolate processed with Alcalase^® + Flavourzyme® 1000L (2); Protoorizin-1 (3); Protoorizin-2 (4).

Рис. 6.

Электрофореграмма ферментативных гидролизатов соевого белка. На дорожки нанесены: М – маркеры молекулярной массы; соевый изолят, не обработанный ФП (1); обработанный ФП Alcalase^® + Flavourzyme® 1000L (2), Протооризин-1 (3), Протооризин-2 (4). Fig. 6. Electrophoregram of enzymatic hydrolysates of soy protein. The tracks marked are: М – molecular weight markers; untreated soy protein isolate (1), and soy protein isolate processed with Alcalase^® + Flavourzyme® 1000L (2), Protoorizin-1 (3), Protoorizin-2 (4).

На основании этих данных можно сделать вывод, что ФП Протооризин-1 и Протооризин-2, полученные нами на основе нового мутантного штамма A. oryzae-Со-28, гидролизуют соевый белок не менее эффективно, чем коммерческие ФП ‒ Alcalase^® и Flavourzyme® 1000L. Действие сбалансированного комплекса эндо- и экзопептидаз ФП на основе A. oryzae-Со-28 позволило получить более высокий выход растворимого белка и свободных аминокислот, чем комбинация Alcalase^® + Flavourzyme® 1000L. ФП Протооризин-1 и Протооризин-2 эффективно гидролизуют основные белки сои. На электрофореграмме гидролизатов, полученных после 3-часовой ферментативной обработки, детектировали слабую полосу с молекулярной массой около 15 кДа, соответствующую промежуточным продуктам расщепления трудногидролизуемой основной субъединицы глицинина [16].

Таким образом, с помощью селекции и мутагенеза под действием УФ- и γ-излучения получен штамм A. oryzae-Со-28 – продуцент сбалансированного комплекса протеолитических ферментов с повышенной лейцинаминопептидазной активностью. Ферментные препараты Протооризин-1 и Протооризин-2, полученные на основе штамма Aspergillus oryzae-Со-28, с высокой эффективностью гидролизуют основные белки сои.