Биотехнология, 2023, T. 39, № 4, стр. 3-28

1.1 Роль метионина в жизнедеятельности разных организмов

L-метионин (2-амино-4-(метилтио)бутановая кислота, или α-амино-γ-метилтиомасляная кислота, C₅H₁₁NO₂S (далее − L-метионин и метионин) является одной из двух серосодержащих аминокислот, входящих в состав белков всех организмов. Данная аминокислота является незаменимой для человека и сельскохозяйственных животных [1]. Как протеиногенная аминокислота, L-метионин играет важную роль в инициации трансляции мРНК, в сворачивании белка, в обеспечении его стабильности и функционирования [2].

Остатки метионина в белках являются сайтами для посттрансляционной модификации, в частности, путем их окисления. Окисление этой аминокислоты в настоящее время признано новым способом окислительно-восстановительной регуляции функции белка [3]. В частности, у высших животных обратимое окисление метионина в центральном регуляторном белке кальмодулине понижает энергетический метаболизм в ответ на окислительный стресс и тем самым обеспечивает клеточный гомеостаз в этих условиях [4].

В организме человека и животных метионин служит источником серы при биосинтезе цистеина, участвует в метаболизме глутатиона, а также наряду с цистеином и глутатионом является важным антиоксидантом. В нескольких белках метионин играет функциональную роль в качестве окислительно-восстановительного сенсора [5, 6]. Он необходим для синтеза карнитина и мелатонина, а также обеспечивает биологическую доступность селена и цинка.

Метионин косвенно регулирует различные клеточные процессы как предшественник S-аденозилметионина (SAM), основного биологического донора CH₃-группы в многочисленных реакциях метилирования. У человека и высших животных SAM участвует в синтезе ряда важных промежуточных продуктов, таких как липоевая кислота и полиамины (например, спермин, спермидин) и др. [7–9].

У растений субстраты SAM-зависимых метилтрансфераз (EC 2.1.1) участвуют как в первичном, так и во вторичном метаболизме. Примерами являются метилирование ДНК, РНК и белков, трансформация липидов, пектина, алкалоидов, фитостеролов, осмопротекторов, а также реакции, необходимые для синтеза хлорофилла, лигнинов и суберинов, в частности, флавоноидов, гидроксикоричных кислот, стильбенов и других ароматических и летучих ароматических соединений [10, 11].

Известно, что во многих растительных продуктах содержание метионина относительно низкое, и в белках основных продовольственных культур он присутствуют в меньших количествах, чем в белках животных и человека. Из-за биохимической и питательной важности этой аминокислоты были предприняты значительные усилия для изучения факторов, регулирующих ее метаболизм и уровень в растениях, и определения возможных путей повышения ее содержания в ряде сельхозпродуктов. С этой целью получали трансгенные растения, синтезирующие белки с повышенным содержанием метионина, или накапливающие в клетках больше свободной аминокислоты [11]. Однако использование таких генетически модифицированных организмов (ГМО) для получения на их основе продуктов питания или кормов для животных в большинстве стран ограничено, или даже запрещено. Часто этот запрет научно никак не обосновывается.

У микроорганизмов метионин играет еще одну важную физиологическую роль – он участвует в синтезе сигнальных молекул-аутоиндукторов на основе N-ацилгомосеринлактона, которые действуют как регуляторы экспрессии генов и зависят от плотности клеток – кворума (quorum sensing) [12, 13].

В желудочно-кишечном тракте человека метионин поступающих с пищей белков – основной источник сероводорода (H₂S), который является токсичным и вместе с тем биологически активным газом. В частности, H₂S необходим для нормальной перистальтики кишечника [14]. С другой стороны, было обнаружено, что он может по-разному влиять на здоровье и продолжительность жизни [15].

Исследования последнего десятилетия показывают, что ограничение поступления в организм метионина может увеличить продолжительность жизни ряда млекопитающих (мышей, крыс), насекомых (Drosophila melanogaster) и дрожжей (Saccharomyces cerevisiae). И хотя вопрос о том, можно ли обобщить это наблюдение является спорным, публикуются все новые работы, посвященные изучению этого явления [16].

1.2 Применение DL-метионина и L-метионина.

Метионин существует в форме двух изомеров, L- и D-метионина, из которых в природе преобладает L-форма. У человека и высших животных могут метаболизироваться обе формы, что важно при применении химически синтезируемого рацемата DL-метионина в качестве кормовой добавки в промышленном животноводстве. Основная часть произведенного химическим синтезом DL-метионина (это >1 300 000 тонн; при ежегодном приросте производства ~6%) используется для балансировки кормов в промышленном птицеводстве и свиноводстве, для подкормки дойных коров, а в последнее время и в рыбоводстве.

Содержащийся в рацемате D-метионин в результате двух ферментативных реакций, катализируемых оксидазой аминокислот (EC 1.4.3.3) и трансаминазой (EC 1.4.3.3), превращается в организме животных в L-метионин. Это происходит, в основном, в клетках печени и почек. Однако результаты ряда исследований показывают, что D- и L-формы по-разному метаболизируются in vivo, и что они выводятся из организма в разных пропорциях. Существует также разница в способности каждого из них выступать в качестве предшественника для синтеза белка в тканях, отличных от печени [17]. Согласно более поздним исследованиям, добавка L-метионина лучше влияла на окислительно-восстановительный статус и развитие слизистой кишечника цыплят по сравнению с DL-метионином. Цыплята, получавшие рацион с L-метионином, имели лучшие показатели роста, чем получавшие корм с DL-метионином [18]. У индюшат применение L-метионина, как правило, повышало усвоение корма, и более эффективно снижало окислительный стресс и увеличивало уровень глутатиона в печени по сравнению с использованием рацемата [19]. У кур-несушек, в корме которых присутствовал только L-метионин, гематологические показатели были лучше, чем у получавших DL-метионин [20]. Применение L-метионина для кормления цыплят-бройлеров в раннем возрасте является более эффективным, чем использование рацемата [21]. По-видимому, при конверсии D-метионина в L-форму клетки интенсивно растущего животного вынуждены отвлекать некоторые энергетические ресурсы для осуществления этого процесса.

L-метионин используется также в пищевой промышленности, где его применяют как ароматическую добавку и для улучшения качества пищи, а также при приготовлении продуктов детского и спортивного питания. Фармакологический препарат L-метионина оказывает липотропное действие, повышает синтез холина, лецитина и других фосфолипидов, в определенной степени способствует снижению содержания холестерина в крови и улучшению соотношения фосфолипиды/холестерин, уменьшению отложения нейтрального жира в печени и улучшению ее функционирования [22]. В связи с этим препараты, содержащие L-метионин, используются как в терапии заболеваний печени, так и для профилактики нарушений ее функции [23]. Метионин хелатирует тяжелые металлы, такие как свинец и ртуть, способствуя их выведению из организма. Как и целый ряд других L-аминокислот, он является компонентом смесей для парентерального питания, а также применяется для синтеза биологически активных пептидов.

В последние годы в ряде стран при выработке пищевых продуктов все шире применяется органическое (экологическое, биологическое) сельское хозяйство. Это метод осуществления сельскохозяйственного производства, один из провозглашаемых принципов которого − поддержание и улучшение здоровья людей, почвы, растений, животных, окружающей среды и планеты как единого и неделимого целого. В связи с этим происходит сознательная минимизация использования удобрений, пестицидов, регуляторов роста растений и кормовых добавок, полученных химическим синтезом. Следует отметить, что Министерство сельского хозяйства Российской Федерации приняло ряд мер по организации органического сельскохозяйственного производства в нашей стране, которые были в 2018 г. поддержаны соответствующим законом [24]. Можно критически относиться к ряду требований указанного подхода, но их существование привело к проблеме, связанной со снабжением метионином. Он считается первой лимитирующей аминокислотой в кормах для домашней птицы и третьей для поросят. [25]. Однако использование синтетического DL-метионина в органическом животноводстве запрещено. Учитывая все выше изложенное, промышленное получение L-метионина является сегодня актуальной задачей

2.1. Химический синтез DL-метионина

Химический синтез DL-метионина осуществляется в промышленности уже много десятилетий. С этой целью применяется многостадийный процесс, в котором используют получаемый из пропилена (CH₂=CH–CH₃) акролеин (CH₂=CHCHO), синильную кислоту (HCN) и метилмеркаптан (метантиол, CH₃SH), который можно производить из метанола (CH₃OH) и сероводорода (H₂S). Все эти соединения – очень токсичные вещества.

На первой стадии реакцией присоединения CH₃SH к акролеину синтезируют 3-метилтиопропионовый альдегид, который далее используется в качестве карбонильного компонента в реакциях Штреккера, предполагающих применение HCN и аммиака (NH₃) с последующим гидролизом образующегося аминонитрила [26]. В настоящее время обычно используют один из вариантов этих реакций – реакции Бюхерера-Бергса (Bucherer–Bergs reaction). При этом метилтиопропионовый альдегид, полученный из акролеина и CH₃SH, взаимодействует с HCN, NH₃ и углекислым газом (CO₂) с образованием 5-(2-метилмеркаптоэтил) гидантоина (метионин гидантоина), который гидролизуется щелочью с образованием метионата натрия (или калия). Далее, после нейтрализации кислотой высвобождается DL-метионин. Существуют различные варианты синтеза DL-метионина, направленные на уменьшение стоимости производства продукта за счет обеспечения непрерывности процесса, сокращения времени, оптимизации заключительных этапов и облегчения удаления отходов [27–29].

В России единственным производителем синтетического DL-метионина является завод АО “Волжский оргсинтез”, (www.zos-v.ru/en), расположенный в г. Волжский Волгоградской области (мощность – 25 000 т в год). Значительная часть произведенного там продукта ранее экспортировалась. С другой стороны, в 2020 г импорт кормового метионина в Россию составил 37.88 тыс. т. В плане импортозамещения в 2018 г. РНЦ “Прикладная химия” (Санкт-Петербург) по заказу ООО “ОНХ-Холдинг” разработал усовершенствованную схему производства метионина с мощностью достаточной, как утверждается, для импортозамещения продукта на российском рынке [30]. Исходными субстратами по этой схеме являются пропилен − продукт крекинга нефти, метанол, получаемый из природного газа и сероводород. В связи с этим следует упомянуть, что Россия располагает большими запасами не только нефти и газа, но и уникальными месторождениями меркаптансодержащего сырья в Прикаспийском регионе. Основными продуктами переработки сероводорода на газоперерабатывающих заводах сегодня являются газовая сера и серная кислота – недорогие продукты, предложение которых на рынке превышает спрос. Учитывая высокую прибыль от производства метионина, высказывается и обосновывается мнение о необходимости развивать технологии синтеза метионина из доступных серо- и азотсодержащих веществ, а также об организации крупного промышленного производства метионина на юге России [31].

Можно упомянуть, что летом 2022 г. появилось сообщение о том, что научный центр “Ростеха” при финансовой поддержке “Газпрома” построит в Петербурге производственную площадку по выпуску метионина с использованием разработки РНЦ “Прикладная химия” [32]. В случае создания достаточно эффективного биотехнологического метода получения L-метионина, прямого, или двухступенчатого (см. ниже), предполагающих биосинтез на основе сульфгидрилирования с использованием метилмеркаптана (MeSH) или диметилдисульфида (ДМДС), на таком производстве можно будет получать и L-метионин.

2.2. Получение L-метионина с помощью энзиматической трансформации химически синтезированного DL-метионин и предшественников

Как было отмечено, для фармацевтических и медицинских применений требуется оптически чистый L-метионин. В связи с этим было разработано несколько методов ферментативного превращения DL-рацемата и D-метионина в чистый изомер L-метионина. Некоторые из этих методов были рассмотрены в обзоре Willke [33].

Наиболее известным и используемым в промышленности процессом является энзиматическое превращение DL-метионина после ацетилирования в N-ацетил-DL-метионин. Только L-изомер в этой смеси затем преобразуется L-аминоацилазой (EC 3.5.1.14) в L-метионин, который отделяется, например, спиртовой экстракцией или кристаллизацией и очищается с помощью ионной хроматографии. Биотрансформация проводится в мембранном реакторе, обеспечивающем сохранение активного фермента в непрерывном ферментативном процессе. Используются также методы иммобилизации целых клеток продуцента фермента (Pseudomonas sp., Aspergillus oryzae), в частности, в желатиновых шариках, где период его полураспада продлевается до 70 дней [34]. Остающийся нетрансформированным D-N-ацетилметионин подвергается рацемизации уксусным ангидридом и рециркуляции [35]. Это производство, которое осуществляется в основном компанией Rexim® в Нанкине (Китай) и компанией Evonik [33] позволяет получать L-метионин фармацевтического класса в количестве нескольких сотен тонн в год.

Был также предложен процесс, в котором для получения чистой L-формы используются оба стереоизомера [36, 37]. Он включает микробиологическое превращение DL-рацемата рекомбинантным штаммом Escherichia coli, который синтезирует два фермента: D-оксидазу аминокислот (D-AAO) и лейциндегидрогеназу (LeuDH, дегидрогеназный комплекс разветвленных α-кетокислот, субъединица Е1 ЕС 1.2.4.4, субъединица Е2 ЕС 2.3.1.168, субъединица Е3 ЕС 1.8.1.4). Дезаминирование D-метионина приводит к образованию нехиральной кето-группы. Затем аминогруппа восстанавливается с помощью LeuDH, что приводит к получению только L-формы. Кроме указанных ферментов необходимо присутствие в реакционной смеси каталазы (ЕС 1.11.1.6) и фермента, восстанавливающего NAD⁺. Для повышения эффективности процесса гены, кодирующие соответствующие ферменты из разных организмов, амплифицировали на плазмидах. Содержащие эти плазмиды клетки штаммов E. coli, после получения их биомассы, обрабатывали, чтобы сделать их проницаемыми для субстратов и продуктов [36].

В другой работе для прямого превращения D-метионина в L-метионин применяли каскадную систему биотрансформации, состоящую из четырех ферментов. Оксидаза D-аминокислот (D-AAO) (EC 1.4.3.3) из Arthrobacter protophormiae использовалась для полного превращения D-метионина в 2-оксо-4-метилтиомасляную кислоту. Для предотвращения ее декарбоксилирования добавляли каталазу. На второй стадии с помощью L-фенилаланиндегидрогеназы (L-PheDH) (ЕС 1.4.1.20) из Rhodococcus sp. превращали 2-оксо-4-метилтиомасляную кислоту в L-метионин, а для регенерации NADH добавляли формиатдегидрогеназу (FDH) (ЕС 1.2.1.2) из Candida boidinii [37].

Еще одним подходом к получению чистого L-метионина является ферментативное превращение его химически синтезированных предшественников. С этой целью используют продуцируемые некоторыми микроорганизмами гидантоиназы (EC 3.5.2.2) [38]. Эти ферменты катализируют обратимое гидролитическое расщепление гидантоина или 5'-монозамещенных гидантоинов [39]. В конце 1990 гг на фирме Degussa (Германия) пытались генетически оптимизировать гидантоиназы путем направленной эволюции для дальнейшего их использования в процессе получения оптически чистого L-метионина из его предшественника D-5-(2-метилтиоэтил) гидантоина [40]. Этот процесс в настоящее время применяется французской дочерней компанией Evonik Degussa, Rexim, на заводе в Вуминге (Китай), где выпускается до 500 т/г L-метионина для пищевой промышленности [33].

Поскольку предшественники метионина синтезируются химическим путем, то у данного метода нет никакого реального преимущества перед процессами, упомянутыми ранее, которые основаны на использовании продуктов, получаемых из нефти, и с использованием агрессивных и токсичных соединений.

2.3. Получение L-метионина путем ферментации штаммов-продуцентов

Получение L-метионина на основе естественного процесса его биосинтеза с помощью культивирования (ферментации) соответствующих штаммов-продуцентов на основе Corynebacterium glutamicum и Escherichia coli, как это делается для получения лизина, треонина и других аминокислот, могло бы решить многие проблемы. Основным препятствием является очень сложный по сравнению с другими аминокислотами биосинтез метионина в клетках этих бактерий, в котором задействованы многочисленные регуляторные механизмы подавления по типу обратной связи, а также большие затраты метаболической энергии и NADPH [33, 41, 42]. Дополнительные энергозатраты в процессе биосинтеза данной аминокислоты связаны в первую очередь с необходимостью включения в ее молекулу атома серы, поступающей в клетки продуцентов с помощью АТФ (ATP)-зависимого транспорта в виде неорганического сульфата. Сульфат должен быть восстановлен до сульфида, который является донором серы в реакции сульфгидрилирования в пути синтеза метионина у многих микроорганизмов, или преобразован в цистеин, который в свою очередь является донором серы в альтернативной реакции транссульфурации в пути синтеза метионина. При этом максимальный теоретический выход метионина из глюкозы существенно меньше, чем многих других аминокислот и составляет 52% для E. coli и 49% для C. glutamicum [42].

Многие из указанных проблем могут решаться с помощью современных методов системной метаболической инженерии. Для этого получают соответствующие регуляторные мутации, модифицируют процессы транспорта метионина в клетки и из клеток, усиливают синтез всех предшественников и доноров метильной (CH₃- или C-1-) группы, используют вместо сульфата другие источники серы. В результате были сконструированы штаммы-продуценты, на основе которых разработаны защищенные многочисленными патентами процессы получения L-метионина с помощью ферментации. Заметных успехов достигли исследователи фирмы Metabolic Explorer (METEX, Франция), которая прилагала большие усилия для запуска коммерческой ферментационной установки с целью получения L-метионина на основе штамма-продуцента E. coli. Однако некоторые технические вопросы так и не были решены. В декабре 2016 г. было опубликовано сообщение, что технологию производства метионина с помощью продуцента E. coli приобрела у METEX компания Evonik (Германия) [43]. Но пока информация о прямом синтезе метионина с помощью ферментации штамма-продуцента так и не появилась.

У многих бактерий существует путь синтеза метионина, предполагающий сульфгидрилирование активированного L-гомосерина, т.е. его эфиров О-сукцинилгомосерина (OSHS) и О-ацетилгомосерина (OAHS) в гомоцистеин или даже непосредственно в метионин за счет, соответственно, H₂S, который содержит восстановленную серу, или CH₃SH, в котором одновременно присутствуют и восстановленная сера, и метильная группа. Прямая ферментация продуцента метионина с использованием таких источников серы могла бы оказаться перспективной, поскольку существенно повысила бы выход метионина из глюкозы и снизила энергозатраты клетки. Однако основным препятствием является высокая токсичность H₂S и CH₃SH для бактерий. Чтобы ее обойти, предлагается использовать менее токсичные их производные в сочетании с техническими подходами. В частности, менее токсичный диметдисульфид (DMDS, CH₃S-SCH₃) (он довольно легко преобразуется в CH₃SH), сначала адсорбируют на носителе, полистироловой смоле Amberlite^TM XAD4, из которой он медленно высвобождаются в процессе культивирования продуцентов [44]. Однако нельзя утверждать, что эта проблема уже решена, или ее можно будет просто решить технически, обеспечивая конкурентоспособный процесс. Поэтому сегодня большое внимание сосредоточено на комбинированном методе производства L-метионина из его предшественников OSHS или OAHS, получаемых ферментацией.

2.4 Комбинированный метод получения L-метионина из предшественников

Этот метод предполагает биотехнологическое получение L-метионина в два этапа. Сначала с помощью ферментации эффективных продуцентов на основе E. coli или C. glutamicum получают естественные предшественники L-метионина – OSHS или OAHS. При конструировании таких продуцентов не нужно обеспечивать поступление и восстановление источников серы, формирование и включение С-1-компонента. Соответственно, на синтез этих предшественников тратится гораздо меньше ATP и NADPH, а потому выход целевого продукта может быть достаточно высоким.

На втором этапе используют другие штаммы, способные к сверхсинтезу ферментов сульгидрилаз − О-ацетилгомосерин сульфгидрилазы (MetY) (EC:2.5.1.49) или О-сукцинилгомосерин сульфгидрилазы (MetZ). С помощью этих ферментов проводят трансформацию полученных OAHS или OSHS в метионин с применением восстановленных источников серы, также содержащих метильную группу − CH₃SH или CH₃S-SCH₃. При этом токсичность этих соединений уже не важна, так как в реакции не участвуют живые бактерии, а только их клетки, обработанные тем или иным методом, обеспечивающим доступ субстратов к указанным ферментам. Недостатком этого процесса является образование значительного количества побочных продуктов – ацетата или сукцината.

При использовании такого метода теоретический выход OAHS составляет 80.3%, а его трансформации – 92.5%, т.е. теоретический выход метионина составит – 74.3%. В случае OSHS выход OSHS – 81.2%, трансформации – 68%, а выход метионина – 55.2% [45].

Этот подход активно разрабатывала компания ЧейлДжеданг (CJ, Южная Корея). Были сконструированы штаммы E. coli, способные эффективно продуцировать предшественники метионина OSHS и OAHS, которые под воздействием, соответственно, ферментов О-сукцинилгомосерин сульфгидрилазы и О-ацетилгомосерин сульфгидрилазы, превращались в метионин с сопутствующим образованием сукцината или ацетата [45]. Патент Arkema-CJ от 2013 г защищает ферментативное превращение в метионин его предшественника OAHS в результате взаимодействия с газообразным CH₃SH [46]. В 2014 г. компании CJ и Arkema построили в Кертехе (Малайзия) завод, который начал производство L-метионина, основанное на описанном в этом патенте процессе. Первоначальная мощность завода 80 000 т. чистого L-метионина в год. В 2019 г. проведено дальнейшее расширение производства [47, 48].

3.1. Биосинтез метиониа и его регуляция у Escherichia coli

Современные подходы к созданию штаммов-продуцентов аминокислот предполагают использование методов системной и синтетической метаболической инженерии, основанных на данных о путях метаболизма в клетках бактерий и их регуляции, структуре и функции соответствующих ферментов [49]. Основные гены, кодируемые ими ферменты и соответствующие реакции биосинтеза метионина у бактерий, хорошо изучены и описаны как в экспериментальных статьях, так и в обзорах. Тем не менее, целесообразно вкратце здесь их рассмотреть.

Путь биосинтеза метионина, как и других аминокислот, начинается с утилизации источника углерода и энергии, в качестве которого обычно выступает глюкоза. Происходят последовательные реакции, обеспечивающие поступление ее в клетки с помощью фосфотрансферазной системы (PTS) и превращения в процессе гликолиза (пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса, EMP), в пентозофосфатном пути (PPP) и в цикле трикарбоновых кислот (TCA) где, в частности, синтезируется щавелевоуксусная кислота (оксалоацетат, OAA). В результате восстановительного аминирования OAA с использованием глутамата в качестве донора аминогруппы, образуется аспарагиновая кислота (аспартат). Эту реакцию катализирует аспартатаминотрансфераза (ЕС 2.6.1.1), которую у E. coli кодирует ген aspC. Клетки способны несколькими способами регенерировать глутамат. В условиях избытка аммония эту реакцию выполняет использующая NADPH глутаматдегидрогеназа (Gdh) (EC 1.4.1.3), кодируемая геном gdhA [50].

OAA является предшественником для биосинтеза всех аминокислот семейства аспартата, к которому принадлежат треонин, лизин и метионин; некоторые авторы причисляют к этому семейству и изолейцин, предшественником которого является треонин [33, 51]. В связи с этим следует отметить, что модификации, направляющие поток углерода в аспартат, являются общим подходом для повышения продукции этих аминокислот. К ним относятся повышение уровня активности фермента пируваткарбоксилазы (ЕС 1.2.4.1) (ген pyc) и фосфоенолпируваткарбоксилазы (ЕС 4.1.1.31) (ген ppc), усиливающее превращение пирувата и фосфоенолпирувата в OAA, а также ослабление пируваткиназ (ЕС 2.7.1.40) (гены pykA и pykF), снижающее превращение фосфоенолпирувата (PEP) по пути гликолиза и направляющее его в OAA. При этом может оказаться необходимым дополнительное увеличение активности аспартатаминотрансферазы и глутаматдегидрогеназы.

Путь биосинтеза метионина из аспартата состоит из нескольких этапов. На первом этапе аспартат фосфорилируется с образованием аспартил-4-фосфата. У E. coli имеется три изофермента, осуществляющих эту реакцию, AKI, AKII и AKIII, которые кодируются, соответственно, генами thrA, metL и lysC. При этом AKI и AKII являются бифункциональными изоферментами − оба обладают активностью аспартаткиназы (EC 2.7.2.4) и гомосериндегидрогеназы (EC 1.1.1.3). Далее, аспартил-4-фосфат под воздействием дегидрогеназы аспартатполуальдегида (EC 1.2.1.11) (ген asd) и гомосериндегидрогеназы (гены thrA, metL) (EC 1.1.1.3) восстанавливается в гомосерин − общий предшественник для треонина, изолейцина и метионина [51].

Первой реакцией биосинтеза непосредственно самого метионина является активация гомосерина. Гомосерин-О-сукцинилтрансфераза (EC 2.3.1.46) (ген metA) переносит сукцинильную группу от сукцинил-СоА на гомосерин, в результате чего образуется L-О-сукцинил-гомосерин (OSHS). Затем пиридоксаль-5'-фосфат (PLP)-зависимая цистатионин-γ-синтаза MetB (EC 2.5.1.48) (ген metB) катализирует превращение О-сукцинилгомосерина и цистеина в цистатионин и сукцинат. На следующем этапе, в результате отщепления пирувата от цистатионина синтезируется гомоцистеин; данную реакцию катализирует цистатионин-β-лиаза (EC 4.4.1.1) (ген metC). Гены metB и metC являются гомологами. Этот единственный у E. coli путь включения атома серы в молекулу метионина с использованием цистеина и есть транссульфурация [51]. Следует отметить, что пути биосинтеза этой аминокислоты у разных бактерий могут различаться [52].

Путь биосинтеза метионина из аспартата и реакции, обеспечивающие образование аспартата в клетках помимо TCA у E. coli и C. glutamicum показаны на рис. 1.

Рис. 1.

Схема реакций биосинтеза L-метионина в клетках E. coli и C. glutamicum. Вместо названий ферментов используются названия соответствующих генов (см. текст). PEP – фосфоенолпируват; OAA – оксалоацетат, Pyr – пируват; Glu – глутамат; α-KG – α-кетоглутарат; 5-MeTHF – 5-метилтетрагидрофолат; THF – тетрагидрофолат; 5-MeTHP-tri-Glu – 5-метилтетрагидроптероилтриглутамат; THP-tri-Glu - тетрагидроптероилтриглутамат; NADPH – никотинамидадениндинуклеотидфосфат; ATP – аденозинтрифосфат; AcCoA – ацетилкофермент А; SucCoA – сукцинилкофермент А; Ac – ацетат; Suc – сукцинат; Asp - аспартат; Asp-P – аспартилфосфат; Asp-sa – аспартатполу-альдегид; Hms – гомосерин; Hms-P – гомосеринфосфат; О-Ac-Hms – О-ацетилгомосерин; O-Suc-Hms – О-сукцинилгомосерин; Cst – цистатионин; Hmc – гомоцистеин; Met – метионин. Fig. 1. Scheme of L-methionine biosynthesis reactions in E. coli and C. glutamicum cells. Instead of enzyme names, the names of the corresponding genes are used (see the text). PEP – phosphoenolpyruvate; OAA – oxaloacetate, Pyr – pyruvate; Glu – glutamate; α-KG – α-ketoglutarate; 5-MeTHF – 5-methyltetrahydrofolate; THF – tetrahydrofolate; 5-MeTHP-tri-Glu – 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate; THP-tri-Glu – tetrahydropteroyltriglutamate; NADPH – nicotinamide adenine dinucleotide phosphate; ATP – adenosine triphosphate; AcCoA – acetyl coenzyme A; SucCoA – succinyl coenzyme A; Ac – acetate; Suc – succinate; Asp – aspartate; Asp-P–aspartyl phosphate; Asp-sa – aspartate semialdehyde; Hms – homoserine; Hms-P – homoserine phosphate; O-Ac-Hms – O-acetylhomoserine; O-Suc-Hms – O-succinylhomoserine; Cst – cystathionine; Hmc – homocysteine; Met –methionine.

Интересно отметить, что у E. coli K-12 были получены супрессорные мутации, которые позволяют синтезировать гомоцистеин в отсутствие продукта metC. Образование гомоцистеина в мутантных штаммах требовало цистатионин-γ-синтетазы, но, по мнению авторов, обходилось без нормального промежуточного соединения цистатионина. При этом экспрессия гена-супрессора была подвержена катаболитной репрессии. Авторы сделали вывод, что цистатионин-γ-синтетаза может катализировать образование гомоцистеина непосредственно из о-сукцинилгомосерина и пока еще не идентифицированного донора серы [53]. Предполагалось, что им является H₂S, который действительно образуется в клетках этих бактерий (см. ниже). Однако существует другое, более обоснованное объяснение этому феномену. Оказалось, что ген malY, экспрессия которого приводит к репрессии всех генов мальтозного регулона, способен устранять потребность мутантов metC в метионине. Таким образом, расщепление цистатионина до гомоцистеина, аммиака и пирувата, которое обеспечивает MetC, может эффективно катализировать и репрессор MalY, который оказался одновременно и PLP-зависимым ферментом [54]. При этом ген malY, очевидно, не реагирует на обычные регуляторы генов биосинтеза метионина.

Последней стадией биосинтеза метионина является перенос метильной группы CH₃- на гомоцистеин. Донорами метильной группы могут выступать 5-метилтетрагидрофолат или 5-метилтетрагидроптероил-три-L-глутамат, а соответствующую реакцию катализирует PLP-зависимая метионинсинтаза (EC 2.1.1.13) (ген metE) или кобаламин-зависимая метионинсинтаза (ЕС 2.1.1.14) (ген metH), соответственно [51, 55]. MetH может функционировать только в присутствии экзогенного кобаламина (витамина B12), а в его отсутствие функционирует метионинсинтаза MetE.

Важно отметить, что активность MetH в 50 раз выше активности MetE, что компенсируется высоким уровнем экспрессии гена metE и большим количеством этого фермента в клетках [55]. Синтез MetE является для клеток обременительным и не целесообразен в продуцентах, которые культивируют в средах с добавлением витамина B12.

Как уже отмечалось, метионин включается в молекулы белка и играет важную роль в инициации трансляции мРНК. Кроме того, эта аминокислота может конвертироваться в SAM в реакции, катализируемой S-аденозилметионинсинтазой (EC 2.5.1.6) (ген metК) [51]. Данная реакция выводит метионин из клеточного пула и обеспечивает синтез корепрессора (см. ниже). Поэтому у штаммов-продуцентов активность MetК должна быть снижена.

Биосинтез метионина в клетках бактерий регулируется на уровне активности ферментов и транскрипции соответствующих генов [51, 55, 56]. У E. coli активность AKI и AKIII ингибируется по типу обратной связи, соответственно, L-треонином и L-лизином. Активность MetA синергически ингибируется своими конечными продуктами − метионином и S-аденозилметионином; при этом в присутствии 1 мМ метионина или SAM ее активность снижается до 4% или 13%, соответственно [57]. Было обнаружено, что мутации в ферменте MetA E. coli, затрагивающие Arg27, Ile296, и Pro298, в значительной степени уменьшают ретроингибирование [58]. В дальнейшем были обнаружены дополнительные аминокислотные остатки в MetA, замены которых также снимают подавление конечными продуктами.

Гены, участвующие в биосинтезе метионина у E. coli, разбросаны по всей хромосоме и образуют “met-регулон”. Экспрессия генов этого регулона контролируются репрессором MetJ и корепрессором SAM [59, 60]. MetJ совместно с SAM подавляет экспрессию генов metL, metA, metB, metE, metF, metH. Комплекс SAM-MetJ связывается со своими операторными сайтами, которые имеют общую структуру тандемных повторов двух или более МЕТ-боксов с консенсусной последовательностью 5'-AGACGTCT-3'. Совместно с метионином MetJ репрессируют и экспрессию metC [51, 55].

Кроме того, экспрессия генов, участвующих в выработке метионина таких, как metE, metH, metF и glyA, контролируется регулятором MetR, который является активатором транскрипции этих генов, но подавляет транскрипцию metA [61, 62]. При этом гомоцистеин усиливает активирующее действие MetR на экспрессию metE. Наконец, известно, что витамин В12 может подавлять экспрессию гена metE. Этот эффект опосредован холоферментом MetH, который содержит кобаламидную простетическую группу (51, 55).

3. 2. Биосинтез метионина и его регуляция у Corynebacterium glutamicum

У C. glutamicum реакции, в которых OAA превращается в гомосерин, являются идентичными с E. coli, с тем лишь отличием, что аспартатаминотрансферазу кодирует ген, названный aspB, а фосфорилирование аспартата катализирует монофукциональная аспартаткиназа LysC (ген lysC); другое обозначение – Ask (ген ask). На последней общей стадии биосинтеза, восстановление аспартат-полуальдегида до гомосерина катализирует единственная гомосериндегидрогеназа Hom (EC 1.1.1.3), кодируемая геном hom [51]. Для активации гомосерина C. glutamicum использует ацетил-КоА с участием гомосерин-О-ацетилтрансферазы (EC 2.3.1.31), (ген metX), в результате чего образуется OAHS [63] (рис. 2). Следует отметить, что гомосерин-О-ацетилтрансфераза C. glutamicum не гомологична MetA (см. ниже).

Рис. 2.

Схема реакций биосинтеза L-серина, L-глицина и 5-метилтетрагидрофолата в клетках E. coli. Вместо названий ферментов используются названия соответствующих генов (см. текст). 3-P-G – 3-фосфоглицерат; 3-P-H-Pyr – 3-фосфогидроксипируват; Glu – глутамат; α-KG – α-кетоглутарат; 3-P-Ser – 3-фосфосерин; Ser – серин; Gly – глицин; NADH – никотинамидадениндинуклеотид восстановленный; NAD⁺ – никотинамидадениндинуклеотид окисленный; P_i – фосфат; 5,10-MeTHF – 5,10-метилентетрагидрофолат; 5-MeTHF – 5-метилтетрагидрофолат; THF – тетрагидрофолат. Fig. 2. Scheme of biosynthesis reactions of L-serine, L-glycine and 5-methyltetrahydrofolate in E. coli cells. Instead of enzyme names, the names of the corresponding genes are used (see the text). 3-P-G – 3-phosphoglycerate; 3-P-H-Pyr – 3-phosphohydroxypyruvate; Glu – glutamate; α-KG – α-ketoglutarate; 3-P-Ser – 3-phosphoserine; Ser– serine; Gly – glycine; NADH – nicotinamide adenine dinucleotide reduced; NAD⁺ – nicotinamide adenine dinucleotide oxidized; P_i – phosphate; 5,10-MeTHF – 5,10-methylenetetrahydrofolate; 5-MeTHF – 5-methyltetrahydrofolate; THF – tetrahydrofolate.

В отличие от E. coli, C. glutamicum, может включать серу как путем транссульфурации, так и путем сульфгидрилирования [64–66]. Реакции транссульфурации, как и у E. coli катализируют цистатионин γ-синтаза (ген metB) и цистатионин-β-лиаза (ген metC или aecD) [64, 67, 68]. Цистатионин γ-синтаза MetB C. glutamicum на 41% идентична своему ортологу из E. coli и предпочтительно принимает ацетилированный гомосерин [67]. Перенос метильной группы на образующийся гомоцистеин осуществляется так же, как у E. coli, двумя формами метионин-синтазы, кодируемыми генами metE и metH. На основе метионина синтезируется SAM, и эту реакцию катализирует S-аденозилметионинсинтаза (ген metК) [64]. Как уже отмечалось, эта реакция выводит метионин из клеточного пула и у продуцентов должна быть ослаблена.

Прямое сульфгидрилирование О-ацетилгомосерина в гомоцистеин осуществляется с использованием неорганического источника серы, H₂S, восстановленного из сульфатов, ассимилированных клеткой. (В действительности в реакции участвует HS⁻ или S²⁻). Данную реакцию у C. glutamicum катализирует O-ацетил-гомосеринсульфгидрилаза, в настоящее время относящаяся к трансферазам (EC 2.5.1.49), кодируемая геном metY [64–66]. Этот фермент функционально гомологичен О-ацетилсерин сульфгидрилазам, обеспечивающим биосинтез цистеина, и требует PLP в качестве кофактора (см. ниже).

Генетические и биохимические данные свидетельствуют о том, что C. glutamicum использует как путь транссульфурации, так и путь сульфгидрилирования почти с одинаковой эффективностью. Из-за наличия этих параллельных путей биосинтеза метионина, одиночная делеция каждого из генов metB, metC или metY не приводит к ауксотротрофности. Однако при одновременном удалении двух генов, metB и metY, или metC (aecD) и metY, клетки становятся ауксотрофными по метионину [65–68]. Следует указать, что гены, участвующие в биосинтезе метионина у C. glutamicum, также разбросаны по ее хромосоме [64].

Первый фермент общего пути биосинтеза аминокислот семейства аспартата, аспартаткиназа (LysC или Ask), согласованно подавляется лизином и треонином [69]. Как отмечено выше, у C. glutamicum имеется единственная гомосериндегидрогеназа Hom, активность которой регулируется по механизму обратной связи (ретроингибированием) и подавляется одним из конечных продуктов – треонином, а синтез репрессируется при участии репрессора McbR (см. ниже). Были получены мутации, нарушающие ретроингибирование, одна из которых связана с заменой в ферменте глицина-378 на глутамат (Hom^G378E) [70].

Изучение регуляции биосинтеза метионина у C. glutamicum на уровне активности катализирующих его ферментов показало, что in vitro активность цистатионин γ-синтазы MetB полностью подавлялась только при добавлении 10 mM цистатионина и была не чувствительна к метионину и SAM, тогда как при добавлении 10 mM метионина или цистотионина остаточная активность о-ацетил-гомосеринсульфгидрилазы MetY подавлялась на 50% от исходного уровня [71]. Репрессия метионином синтеза ряда ферментов неоднократно наблюдалась разными авторами [76–78] Так, при добавлении 10 mM метионина в минимальную ростовую среду остаточная активность гомосерин-ацетилтрансферазы MetX составляла 25% от исходной. Синтез цистатионин γ-синтазы и цистатионин β-лиазы также подавлялся, но только до остаточной активности на уровне 50–70%. Очень чувствительной к репрессии оказалась О-ацетилгомосеринсульфгидрилаза, демонстрируя в этих условиях 13% остаточной активности. Кроме того, синтез гомосеринацетилтрансферазы MetX подавлялся 10 мM цистеина до 50% от ее первоначальной активности [72].

Роль репрессора в процессе биосинтеза метионина у C. glutamicum играет белок McbR, кодируемый геном mcbR, продукт которого был первоначально установлен как белок, cвязывающийся с регуляторной областью metY [73]. McbR относится к регуляторам TetR-типа, которые обычно индуцируются низкомолекулярными эффекторами [74]. С помощью двумерного гель-электрофореза протеома с последующей идентификацией разделенных белков было установлено, что образование, по крайней мере, 6 белков, MetY, MetK, Hom, CysK, CysI и SsuD, у штамма дикого типа C. glutamicum подавляется, если его выращивать в присутствии метионина, а у делеционного мутанта mcbR оно повышено и не зависит от метионина [73].

Последующее сравнительное транскрипционное профилирование мутанта mcbR и штамма дикого типа выявило 86 генов, экспрессия которых была у мутанта повышена, и 51 ген со сниженным уровнем экспрессии. Это снижение могло быть вторичным результатом действия McbR как репрессора и замедления скорости роста клеток, хотя нельзя исключать и его роль как активатора экспрессии [75]. Дерепрессированными оказались гены, контролирующие биосинтез серосодержащих аминокислот, транспорт и усвоение различных источников серы, а также гены, кодирующие белки-регуляторы, и гены, связанные с реакцией клеток на окислительный стресс (sod, katA, trx, trxB, trxC, sufBCD и nifSU).

Биоинформатический анализ выявил наличие перед 22 генами и оперонами (всего 45 генов) инвертированного повтора 5'-TAGAC-N6-GTCTA-3' как консенсусной последовательности, с которой связывается репрессор McbR. Таким образом, McbR может подавлять транскрипцию всех генов, обеспечивающих биосинтез метионина (за исключением aecD и metF), L-цистеина, поглощение и усвоение соединений серы, а также ряда регуляторных генов. Все это свидетельствует о том, что McbR является глобальным клеточным регулятором [75]. Функция указанного мотива как потенциального сайта связывания McbR перед генами hom, cysI, cysK, metK и mcbR была подтверждена экспериментально [76]. В указанной работе удалось также идентифицировать эффектор McbR. Им оказался S-аденозилгомоцистеин (SAH), основной продукт реакций трансметилирования, осуществляемых при участии SAM. SAH под воздействием SAH- гидролазы AhcY (EC 3.3.1.1) может рециркулироваться в предшественник метионина – гомоцистеин без потери клеткой восставновленной серы. Гомолог гена, кодирующего SAH-гидролазу (NСgl0860), был обнаружен авторами в геноме C. glutamicum. Поскольку SAM и SAH физиологически связаны реакциями трансметилирования, клеточный уровень SAH напрямую отражает потребление SAM. Кроме того, было установлено, что не только SAH, но также SAM влияет на связывание McbR. Подтвердилось также репрессирующее влияние метионина на экспрессию генов пути его биосинтеза, зависимое от McbR, хотя механизм репрессии остается не известным. Интересно, что уровни экспрессии генов metX, metB, metY, metE, metH, and metK в условиях недостатка кислорода были значительно выше, чем в аэробных условиях [76].

Делеция регулятора McbR у штамма C. glutamicum дикого типа не приводит к сверхсинтезу метионина, но вызывает накопление в клетках гомолантионина и изолейцина. Гомолантионин, очевидно, образуется из о-ацетил-гомосерина и гомоцистеина при помощи цистатионин γ-синтазы, поскольку появление этих соединений блокировалось делецией гена metB. Изолейцин же синтезировался по необычному, ранее не известному пути [77]. Более того, при этом значительно замедлялcя рост культуры, уменьшалась скорость усвоения глюкозы, выход биомассы и выделение CO₂. В клетках появлялись полифосфатные гранулы, отсутствовавшие у исходного штамма [78]. Авторы рассматривают эти факты как проявление окислительного стресса, на преодоление которого затрачиваются клеточные ресурсы. Действительно, исследование метаболических потоков глюкозы в путях центрального метаболизма выявило у мутанта ΔmcbR перенаправление потока из пентозо-фосфатного пути в гликолиз и цикл трикарбоновых кислот. Эти изменения нарушили энергетический метаболизм и редокс-статус клеток, соотношения NADH:NAD⁺ и особенно NADPH:NADP⁺ существенно уменьшились. При этом произошла выраженная индукция белков, связанных с окислительным стрессом. Была затронута также экспрессия ферментов центрального метаболизма, синтеза аминокислот, витаминов и усвоения железа. Все это подтверждает роль McbR как глобального регулятора клеточного метаболизма [78].

Можно отметить, что с фрагментом ДНК регуляторной области гена metY, которая использовалась для обнаружения McbR, связывалось еще 3 белка, функции которых не известны. Причем, один из этих белков относится к регуляторным белкам LacI-типа и, возможно, также участвует в регуляции синтеза метионина [73].

С точки зрения перспективности использования делеции McbR для создания продуцента представляется особенно важным обнаруженное ее влияние на ограничение образования NADPH, особенно учитывая высокую потребность биосинтеза метионина в этом кофакторе. Кроме того, не благоприятным для продукции метионина является синтез гомолантионина. И хотя его можно предупредить делецией MetB, это не повышает биосинтез и накопление метионина. Другим негативным фактором является нарушение синтеза серина и как следствие – уменьшение доступности метил-тетрагидрофолата [78]. Таким образом, целесообразность использования делеции регулятора McbR при создании штаммов-продуцентов метионина остается под вопросом.

В связи с данными о том, что делеция McbR вызывает окислительный стресс, следует отметить, что C. glutamicum обладает относительно высокой устойчивостью к этому стрессу. Недавно описан белок-регулятор, CssR (ген cssR), котролирующий реакцию бактериальных клеток на стрессы. Гены, обеспечивающие окислительно-восстановительный гомеостаз, в штамме с делецией CssR проявляют повышенные уровни транскрипции, а соотношение NADPH/NADP⁺ было выше, чем у родительского штамма [79]). Возможно, что мутация ΔcssR будет в той или иной степени супрессировать негативные последствия инактивации McbR и ее можно использовать при конструировании продуцента метионина.

У C. glutamicum был обнаружен еще один регуляторный элемент, контролирующий метаболизм серосодержащих аминокислот и усвоение серы. Оказалось, что инсерционная инактивация или делеция гена NCgl2640 с неизвестной функцией вызывает устойчивость к этионину – аналогу метионина – за счет сверхсинтеза и накопления последнего внутри клеток и в среде [80]. При этом уменьшалась метионин-зависимая репрессия о-ацетилгомосерин сульфгидрилазы (MetY), цистеинсинтазы (EC 2.5.1.47) (cysK) и cys-оперона. Однако продукт гена NCgl2640 не связывался с промоторной областью cysK, metY и cys-оперона, хотя эти же авторы наблюдали такое связывание для McbR. Поэтому предполагается его непрямое участие в регуляции биосинтеза метионина, механизм которого остается пока не известным.

Поскольку инактивация NCgl2640 вызывала накопление метионина и не влияла заметным образом на скорость роста мутанта, представляется перспективным использовать такого рода модификацию при создании штаммов-продуцентов метионина и его предшественников.

Рассматривая пути биосинтеза метионина и их регуляцию у C. glutamicum, следует оценить значение прямого сульфгидрилирования для создания эффективного продуцента этой аминокислоты. Хотя путь транссульфурации может быть благоприятным для биосинтеза метионина, выбор прямого пути сульфгидрилирования, который использует сульфид-ион в качестве субстрата, очевидно, связан с доступными источниками серы в среде. На переключение клеток на соответствующий путь может влиять внутриклеточный уровень пула цистеина и H₂S. Прямое попадание сульфида в путь биосинтеза метионина может обеспечить энергетические преимущества для клеток. Следовательно, наличие двух независимых ферментов для путей, транссульфурации и прямого сульфгидрилирования, с различными регуляторными механизмами обеспечивает C. glutamicum заметную метаболическую гибкость, которую следует использовать в процессе получения продуцентов на основе этой бактерии.

3.3. Биосинтез метионина у других микроорганизмов и растений.

Кратко остановимся на особенностях биосинтеза метионина у других микроорганизмов и у растений. Путь биосинтеза метионина и гены, кодирующие соответствующие ферменты у разных бактерий различается. Реакцию активирования гомосерина могут катализировать ферменты, гомологичные принадлежащим к разным семействам MetA и MetX. При этом первоначально считалось, что все гомологи MetA являются гомосерин-о-сукцинил трансферазами. Однако у ряда бактерий, таких как Thermotoga maritima [81], Bacillus cereus [82] и Agrobacterium tumefaciens [83], было экспериментально показано, что MetA катализирует ацетил-трансферазную реакцию, т.е. является гомосерин-о-ацетилтрансферазой. При исследовании кристаллической структуры фермента из Bacillus cereus оказалось, что специфичность определяется аминокислотным остатком глутамата, Glu111, в активном центре фермента. Замена его на глицин изменяла субстратную специфичность MetA с ацетил-CoA на сукцинил-CoA и наоборот [82]. Согласно результатам биоинформатического анализа у большинства бактерий имеется фермент с активностью MetX [52].

Последующий синтез гомоцистеина из активированного гомосерина осуществляется у всех организмов или двухступенчатым путем трансульфурации, и/или одноступенчатым сульфгидрилированием. Надо отметить, что ферменты, которые катализируют прямой синтез гомоцистеина и способны к замещению ацильного остатка у четвертого атома углерода сульфидом (это так называемое γ-замещение), были давно обнаружены у грибов, дрожжей и бактерий [84]. Эти реакции относятся к PLP-зависимым элиминациям и замещениям [85]. В результате такого рода реакции может, например, осуществляться синтез цистеина, катализируемый триптофансинтазой, непосредственно из серина и сульфида [86].

Было показано, что в экстрактах дрожжей Schizosaccharomyces pombe присутствовала активность, способная к сульфгидрилированию с помощью H₂S как O-ацетил-L-серина, так и O-ацетил-L-гомосерина. Очищенный в 300 раз фермент реагировал также с O-сукцинилгомосерином и непосредственно с L-гомосерином, обеспечивая прямой синтеза гомоцистеина, но не мог использовать вместо H₂S в качестве косубстрата цистеин [87].

Как отмечалось, прямое сульфгидрилирование на самом деле является преобладающим путем биосинтеза метионина по всему филогенетическому древу. В этом пути большинство бактерий используют О-ацилгомосерин сульфгидрилазу (MetY или MetZ) для катализа образования гомоцистеина из О-ацилгомосерина и H₂S. Все ферменты путей транссульфурации и сульфгидрилирования являются гомологами, и все они используют PLP в качестве кофактора. У Leptospira meyeri ген metY, кодирующий о-ацетилгомосерин-сульфгидролазу, клонировали по комплементации мутации metB. При этом, хотя он обладал большой гомологией с аналогичными белками из Aspergillus nidulans и Saccharomyces cerevisiae, степень подобия с бактериальными цистатионин γ-синтазами была низкой [88].

Фермент MetY у C. glutamicum также является бифункциональным и действует довольно эффективно и как цистатионин γ-синтаза (MetB). Оба эти фермента используют OAHS в качестве субстрата и могут, хотя и плохо, использовать OSHS. Надо отметить, что у этого организма последовательность MetY на 33% идентична MetB [71]. Основываясь на филогенетическом древе и результатах тестов на комплементацию, сделано предположение о способности продукта предкового гена действовать как OAHS- или OSHS-сульфгидрилаза [89].

При сравнении структуры MetY и MetB из Thermatoga maritime, остаток Arg270 был выявлен как критический фактор, определяющий специфичность. Он обеспечивает связывание сульфида (HS⁻) в качестве второго субстрата MetY, блокируя более крупный субстрат MetB, цистеин [90]. Мутагенез этого остатка может дать представление о специфичности, а также о предполагаемой эволюции MetB из предкового MetY.

У высших растений имеется как путь транссульфурации, так и путь прямого сульфгидрилирования [10, 11, 91]. Исходным соединением для обоих путей является предшественник треонина – 4-фосфо-гомосерин. Реакцию активации гомосерина за счет ATP катализирует гомосеринкиназа. Решающую стадию биосинтеза метионина, при которой О-фосфогомосерин направляются в путь синтеза, ведущий к метионину, у высших растений катализирует О-фосфогомосерин-зависимая цистатионин-γ-синтаза. Интересно отметить, что центральное место в фиксации дистального фосфата в структуре этого фермента занимает открытый остаток лизина, который строго консервативен в растительных цистатионин-гамма-синтазах, тогда как у бактериальных ферментов в этом положении остаток глицина. Примечательно также, что этот фермент может обеспечить образование метионина как по пути трассульфурации, так и по пути сульфгидрилирования. Первый так же как и у микроорганизмов, включает образование цистатионина, который затем превращается цистатионин-β-лиазой в гомоцистеин и далее за счет переноса метильной группы с N5-метилтетрагидрофолата из него образуется метионин. В растениях эту реакцию катализирует кобаламин-независимая метионинсинтаза [92].

4.1. Биосинтез серина и глицина

Серин используется как предшественник для синтеза цистеина, так и в качестве донора метильных групп для образования метил-тетрагидрофолата (метил-ТГФ, CH₃-THF), который, в свою очередь, является одним из доноров метильной группы на последней стадии биосинтеза метионина.

Биосинтез серина у E coli и C. glutamicum осуществляется одинаково из продукта гликолиза − 3-фосфоглицерата (рис. 2). На первой стадии биосинтеза гидроксильная группа 3-фосфоглицерата окисляется фосфоглицератдегидрогеназой SerA (EC 1.1.1.95) (ген serA), использующей NAD⁺ в качестве кофактора, до кето-группы с образованием 3-фосфогидроксипирувата. Далее, с помощью фосфосеринаминотрансферазы (ЕС 2.6.1.52) (ген serC), требующей пиридоксаль-5'-фосфат в качестве кофактора, происходит перенос аминогруппы с глутамата на 3-фосфогидроксипируват с образованием 3-фосфосерина, который гидролизуется до свободного серина фосфосеринфосфатазой (EC 3.1.3.3) (serB) [93, 94]. Регуляция этого пути осуществляется за счет ингибирования серином по принципу обратной связи активности фермента SerA [95].

Серин превращается в глицин серингидроксиметилтрансферазой (SHMT) (EC 2.1.2.1) (ген glyA) в результате переноса гидроксиметильной группы на тетрагидрофолат c одновременным образованием 5,10-метилентетрагидрофолата [94] (рис. 2). Эта реакция у C. glutamicum является единственным источником 5,10-метилентетрагидрофолата (см. ниже).

4.2. Биосинтез цистеина

В пути биосинтеза метионина у E. coli если не единственным (см. ниже), то основным источником серы в реакции транссульфурации для синтеза цистатионина из OSHS является цистеин. Он же участвует в данной реакции и у C. glutamicum, взаимодействуя с OAHS.

Следует отметить, что образование цистеина – это важнейший способ включения восстановленной серы в органические структуры. Второй механизм обеспечивается синтезом гомоцистеина в реакции активированного гомосерина с сульфидом, которую катализирует цистатионин-γ-синтаза или сульфгидрилаза (см. выше).

Путь биосинтеза цистеина, по-видимому, идентичен у различных микроорганизмов. Первую стадию его образования катализирует серинацетилтрансфераза (SAT) (EC 2.3.1.30) (ген сysE), превращающая серин в O-ацетилсерин путем ацетилирования с использованием ацетил-CoA [96]. Цистеин подавляет активность этого фермента и вместе с прекращением экспрессии генов цистеинового регулона предупреждает негативный эффект избытка этой аминокислоты на физиологию и рост клеток. При дефиците серы белок-регулятор CysB совместно с N-ацетилсерином активирует этот регулон [96]. Для обеспечения сверхсинтеза цистеина используют мутанты SAT, не чувствительные к ретроингибированию [97].

Серинацетилтрансфераза E. coli находится в многофункциональном комплексе с цистатеинсинтазой A, которую также называют О-ацетилсерин-(тиол)-лиазой A или О- ацетилсерин-сульфгидрилазой A. Это − один из двух ферментов, катализирующих синтез L-цистеина из O-ацетилсерина и сульфида. Цистеинсинтаза A кодируется геном cysK [98].

Второй фермент, цистеинсинтаза B (О-ацетилсерин-(тиол)-лиаза B или О-ацетилсерин-сульфгидрилаза B) (EC 2.5.1.47), кодируется геном cysM и осуществляет PLP-зависимое преобразование О-ацетилсерина и сульфида в цистеин. Кроме того, цистеинсинтаза B может катализировать взаимодействие О-ацетилсерина непосредственно с тиосульфатом, с образованием S-сульфоцистеина, который восстанавливается в цистеин [99].

У C. glutamicum L-цистеин синтезируется в основном тем же путем, что и у E. coli, и используется для синтеза метионина, хотя, как отмечалось, имеются два пути его биосинтеза − путь транссульфурации и путь прямого сульфгидрилирования. Активность SAT чувствительна к ретроингибированию L-цистеином, а синтез SAT подавляется L-метионином. Однако C. glutamicum, очевидно, имеет только одну O-ацетилсерин сульфгидрилазу (цистеинсинтетазу), кодируемую геном cysK [100, 101].

Синтез цистеина тесно связан с поглощением и ассимиляционной редукцией сульфата и тиосульфата.

4.3. Поглощение и ассимиляционная редукция сульфата у E. coli

Cульфат и тиосульфат поглощаются из внешней среды с помощью обеспечивающего высокоаффинный транспорт сульфата и тиосульфата ABC-транспортера (АТФ-связывающей кассеты), кодируемого у E. coli генами cysPUWASbp (рис. 3). При этом гены cysP и sbp кодируют периплазматические белки, связывающие преимущественно тиосульфат (CysP) или сульфат (Spb), гены cysU и cysW кодируют интегральные мембранные белки, образующие транспортный канал, ген cysA – АТP-азу, энергетически обеспечивающую перемещение субстратов через мембрану [96, 102, 103].

Рис. 3.

Схема поглощения и реакций метаболизма сульфата и тиосульфата в клетках E. coli. Вместо названий ферментов используются названия соответствующих генов (см. текст) ATP – аденозинтрифосфат; ADP – аденозиндифосфат; PP_i – пирофосфат; APS – аденозинфосфосульфат; PAPS – фосфоаденозинфосфосульфат; Trx – тиоредоксин; NADPH – никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный; NADP+ – никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный; Cys – цистеин; Ac – ацетат; Ser – серин; AcCoA – ацетилкофермент А; CoA – кофермент А; О-AcSer – О-ацетилсерин; S-sulfo-Cys – S-сульфоцистеин; Grx1 – глутаредоксин 1; NrdH – глутаредоксин-подобный белок; GSH – глутатион восстановленный; GSSH – глутатион окисленный (глутатиондисульфид), red – восстановленная форма; ox – окисленная форма. Fig. 3. Scheme of uptake and reactions of sulfate and thiosulfate metabolism in E. coli cells. Instead of enzyme names, the names of the corresponding genes are used (see text) ATP – adenosine triphosphate; ADP – adenosine diphosphate; PPi – pyrophosphate; APS – adenosine phosphosulfate; PAPS – phosphoadenosine phosphosulfate; Trx – thioredoxin; NADPH – nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced; NADP+ –nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidized; Cys – cysteine; Ac – acetate; Ser – serine; AcCoA – acetylcoenzyme A; CoA – coenzyme A; O-AcSer – O-acetylserine; S-sulfo-Cys – S-sulfocysteine; Grx1 – glutaredoxin 1; NrdH – glutaredoxin-like protein; GSH – reduced glutathione; GSSH is oxidized glutathione (glutathione disulfide); red – reduced form; ox – oxidized form.

При использовании сульфата в качестве источника серы сначала сульфат-аденилилтрансфераза (EC 2.7.7.4) (гены cysD, cysN) катализирует две сопряженные реакции (рис. 3): гидролиз АТФ и активацию поступившего в клетку сульфата с образованием APS и аденозин-дисфосфата (ADP) [104].

На следующем этапе аденилилсульфаткиназа (EC2.7.1.25) (ген cysC) осуществляет фосфорилирование APS в результате чего образуется 3-фосфоаденилил-5-фосфосульфат (PAPS) [105]. Затем фосфоаденилсульфатредуктаза (или PAPS фосфоаденилилсульфатсульфотрансфераза) (EC 1.8.4.8) (ген cysH) катализирует восстановление фосфоаденилсульфата до сульфита (${\text{SO}}_{3}^{{2 - }}$) с выделением ADP [106]. Для этой реакции ферменту CysH требуется два электрона, которые передают ему белки тиоредоксин (ген trxA) или глуторедаксин (ген grxA). Для последующего восстановления этих белков соответствующими редуктазами требуется NADPH [107].

На последней стадии сульфитредуктаза (EC 1.8.1.2), состоящая из двух субъединиц (гены cysJI), катализирует восстановление сульфита до сульфида (S²⁻) за счет переноса 6 электронов, используя NADPH в качестве донора электронов [108]. В результате, для ассимиляции одного сульфат-иона (${\text{SO}}_{4}^{{2 - }}$) и восстановления его в сульфид-ион (S²⁻) для синтеза одной молекулы цистеина требуются 4 молекулы NADPH. Простетической группой в субъединице CysI сульфитредуктазы является сирогем, который синтезируется из уропорфириногена-III с помощью сирогемсинтазы (EC 2.1.1.107) (ген cysG) [109].

Следует отметить, что экспрессия генов усвоения и редукции сульфата активируется регулятором CysB, который для этого должен связаться с N-ацетилсерином, спонтанно образующимся из О-ацетилсерина. В целом, процессы биосинтеза цистеина и ассимиляции серы жестко регулируются конечным продуктом, цистеином, и промежуточным − О-ацетилсерином [110, 111].

4.4. Поглощение и ассимиляционная редукция тиосульфата у E. coli

Вторым важным источником серы для синтеза серосодержащих аминокислот в бактериальных клетках является тиосульфат. Тиосульфат используется бактериями для синтеза цистеина в качестве источника неорганической серы в ее глобальном биологическом круговороте. Он представляет собой молекулу неорганической серы, относящуюся к сульфановым соединениям, в которых атомы серы связаны с другими атомами серы (S=${\text{SO}}_{3}^{{2 - }}$). Благодаря сульфановому атому тиосульфат суммарно имеет более восстановленное состояние серы, чем сульфат (+2). Из-за меньшего числа необходимых стадий восстановления серы в цитоплазме бактерий энергетическая эффективность биосинтеза серосодержащих аминокислот из тиосульфата выше, чем из сульфата. Интересно отметить, что тиосульфат подавляет утилизацию сульфатов, в частности, резко снижая экспрессию комплексов-переносчиков сульфата/тиосульфата и других генов, регулируемых CysB [112].

Как было отмечено, тиосульфат может поглощаться клетками E. coli с помощью ABC-транспортера, кодируемого генами cysPUWASbp, связываясь в периплазме преимущественно с CysP. После поступления в клетки, он с помощью цистеинсинтазы B реагирует с О-ацетилсерином с образованием S-сульфоцистеина, который затем превращается в цистеин [111]. Это происходит в результате реакций редукционного расщепления дисульфидной связи (R–S–SO₃) дисульфидредуктазами − глутаредоксиноподобным белком NrdH или глутаредоксином Grx1. Для непрерывности этих восстановительных реакций сам NrdH должен быть затем восстановлен тиоредоксинредуктазой (EC 1.8.1.9), использующей NADPH, и аналогично Grx1 (EC 1.8.1.8) (ген grxA) − редуцированной формой глутатиона (GSH), которая каждый раз восстанавливается глутатионредуктазой (EC 1.8.1.7), использующей NADPH [113]. В целом, тиосульфатный путь требует только одну молекулу NADPH в качестве расхода клеточной энергии для биосинтеза одной молекулы цистеина, а одновременно высвобождаемый сульфит (${\text{SO}}_{3}^{{2 - }}$) также ассимилируется в другую молекулу цистеина через сульфатный путь, которому требуется только три молекулы NADPH. Таким образом, при усвоении тиосульфата 4 молекулы NADPH расходуются на синтез 2 молекул цистеина (рис. 3).

Второй путь восстановления тиосульфата, поступившего в клетки обычным путем, катализирует цитоплазматическая тиосульфат сульфотрансфераза GlpE (EC 2.8.1.1) (ген glpE), имеющая одиночный роданез-подобный домен [114]. Роданезы – ферменты, множество генов которых имеется в геномах почти всех организмов. Эти ферменты катализируют перенос сульфановой серы тиосульфата на цианид (тиосульфат-цианид сульфотрансферазы) с образованием тиоцианата (нем. “rhodanid”) и сульфита. В отсутствии цианида перенос осуществляется на другие акцепторы, в частности, на тиоредоксин [115, 116]. Таким образом, после взаимодействия тиосульфата с тиоредоксином с участием тиоредоксинредуктазы и NADPH образуется H₂S и сульфит [116]. H₂S используется для синтеза цистеина и, возможно, в каких-то условиях также для синтеза метионина, минуя цистатионин. Сульфит же восстанавливается далее до сульфида по ранее описанному механизму (рис. 3). По этой причине штамм, мутантный по цистеинсинтазе B (cysK) оказался способным к росту на среде с тиосульфатом, а сверхэкспрессия glpE повысила продукцию цистеина при культивировании штамма-продуцента в этих условиях [117].

Кроме GlpE у E. coli еще имеется намного более активная и специфичная к тиосульфату сульфотрансфераза, PspE, которая локализуется в периплазме и катализирует взаимодействие с тиосульфатом транспортируемого сюда GSH [118]. Ее можно рассматривать как тиосульфат-глутатион сульфотрансферазу. При этом образуется сульфит и дисульфид глутатиона (GSSH), которые транспортируются из периплазмы в цитоплазму клетки (рис. 3). GSSH может служить источником сульфановой серы и H₂S [119]. В связи с этим интересно отметить, что недавно описанная способность E. coli генерировать из тиосульфата H₂S зависит от белка-регулятора CRP, контролирующего множество генов, участвующих в гликолизе, и вместе с циклическим AMP обеспечивающего катаболитную репрессию [120]. Весьма вероятно, что соответствующая активность связана с тиосульфат-сульфотрансферазами GlpE и PspE, о которых известно, что их синтез подвержен такой репрессии [114, 119].

Недавно был описан дополнительный специфический мембранный импортер тиосульфата, YeeE, кодируемый геном yeeE, который имеет необычную структуру и принадлежит к семейству YeeE/YedE [121]. У мутантов cysPcysASbp, у которых нарушен транспорт сульфата и тиосульфата, этот транспортер обеспечивает поглощение тиосульфата, необходимое для синтеза цистеина (рис. 3). При этом наблюдается медленный, но уверенный рост культуры, который можно ускорить за счет сверхэкспрессии гена yeeE. Еще одним фактором, необходимым для усвоения тиосульфата в этих условиях является продукт гена yeeD, цитоплазматический белок, предположительно кодирующий сульфотрансферазу. В связи с тем, что гены yeeE и yeeD необходимы для поглощения тиосульфата (thiosulfate uptake), предложено называть их, соответственно, tsuA и tsuB [112]. Усиление экспрессии этих генов, в том числе, за счет повышения стабильности соответствующих мРНК (путем инактивации РНК-пирофосфогидролазы, удаляющей пирофосфат с 5'-конца мРНК и инициирующей распад мРНК), вдвое повышало продукцию цистеина ([112, 117, 122]).

4.5. Поглощение и ассимиляционная редукция сульфата и тиосульфата у C. glutamicum

У C. glutamicum существует иной чем у E. coli механизм поглощения и восстановления неорганических соединений серы. С помощью геномного и последующего генетического анализа у этого организма был идентифицирован кластер из восьми генов, fpr2 cysIXHDNYZ, которые кодируют транспортер и ферменты, ответственные за поступление в клетки и восстановление сульфата [123]. При этом только четыре гена кластера кодируют белки, которые можно отнести к ортологам соответствующих генов E. coli.

Это cysI, cysH, cysD и cysN (рис. 4), которые, однако, только частично или совсем не комплементируют соответствующие мутации у E. coli. Функция остальных генов была предсказана на основании гомологии кодируемых ими белков с белками других бактерий, в большинстве своем − представителей порядка Actinomycetales. Относящийся к мембранным белкам CysZ, очевидно, является сульфатпермеазой. Это − высокоафинный транспортер, переносящий через мембрану сульфат и сульфит. Кроме него C. glutamicum имеет дополнительный низкоафинный транспортер сульфата, способный функционировать только при концентрации субстрата, превышающей 5 mM [123].

Рис. 4.

Схема поглощения и реакций метаболизма сульфата в клетках C. glutamicum. Вместо названий ферментов используются названия соответствующих генов (см. текст). ATP – аденозинтрифосфат; ADP – аденозиндифосфат; PP_i – пирофосфат; APS – аденозинфосфосульфат; NADPH – никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный; NADP+ – никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный; Cys – цистеин; Ac – ацетат; Ser – серин; AcCoA – ацетилкофермент А; CoA – кофермент А; О-AcSer – О-ацетилсерин. Fig. 4. Scheme of absorption and reactions of sulfate metabolism in C. glutamicum cells. Instead of enzyme names, the names of the corresponding genes are used (see the text). ATP – adenosine triphosphate; ADP – adenosine diphosphate; PPI – pyrophosphate; APS – adenosine phosphosulfate; NADPH – nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced; NADP+ –nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidized; Cys – cysteine; Ac – acetate; Ser – serine; AcCoA – acetylcoenzyme A; CoA – coenzyme A; O-AcSer – O-acetylserine.

Поступивший в клетки сульфат аденилируется CysDN, и образующийся APS затем сразу восстанавливается CysH до сульфита. Таким образом, CysH является здесь APS редуктазой (EC 1.8.99.2). Сульфит редуцируется до сульфида с помощью редуктазы CysI, сирогемный кофактор для которой синтезирует CysY, а электроны поставляет ферредоксин CysX и NADPH-ферредоксинредуктазы Fpr2 и Fpr1 (EC 1.18.1.2), которые используют NADPH для его последующего восстановления. Ген fpr1 не сцеплен с упомянутым кластером и локализуется отдельно. Интересно, что он не может быть удален, что указывает и на другую важную функцию этого гена [123].

Гены cysIXHDNYZ образуют оперон, который, видимо, транскрибируется с единственного промотора, а ген fpr2 – с другого промотора и в противоположном направлении. Оба промотора перекрывают сайты связывания транскрипционного репрессора McbR, который подавляет их экспрессию, как и предполагалось ранее [82]. Кластер генов fpr2–cysIXHDNYZ, обеспечивающий поглощение и восстановление сульфата, находится также под контролем другого регулятора транскрипции CysR [124], который принадлежит к регулону McbR и является необходимым активатором их экспрессии. Делеционный мутант гена cysR теряет способность утилизировать сульфат в качестве источника серы. Выравнивание промоторных областей генов, активированных CysR, выявило мотив связывания регулятора, состоящий из двух последовательностей по 10 п.н., образующих инвертированный повтор с переменным спейсером в 6–8 п.н. ДНК-связывающая активность CysR требует наличия O-ацетил-L-серина или O-ацетил-L-гомосерина, каждый из которых является акцептором H₂S для синтеза цистеина или метионина соответственно. Таким образом, CysR является функциональным аналогом CysB E. coli и контролирует экспрессию генов, ответственных за поглощение и редукцию серы, в ответ на доступность сульфидных акцепторов, что позволяет избежать накопления токсичного сульфида в клетках. Следует также отметить, что избыток в среде сульфата и сульфита, а также цистеина, подавляет экспрессию генов усвоения серы.

Недавно у C. glutamicum был обнаружен новый глобальный регулятор OsnR, функционирующий как репрессор транскрипции генов, участвующих в окислительно-восстановительных реакциях на стресс [125]. Среди контролируемых им генов оказался ген, обозначенный как cysS. Белок, кодируемый этим геном, в свою очередь, регулирует экспрессию регулятора CysR и играет положительную роль в ассимиляции источников серы. Одновременно CysS подавляет экспрессию гена NCgl2463, который кодирует импортер цистеина/цистина [126]. Таким образом, у C. glutamicum метаболизм серы связан с глобальной реакцией клетки на стресс. Интересно, что CysR подавляет экспрессию некоторых генов, функция которых пока не известна. Поскольку эти гены регулируются совместно McbR, кодируемые ими белки, вероятно, также вовлечены в путь метаболизма серы и как-то влияют на синтез метионина.

Бактерии C. glutamicum способны также усваивать в качестве единственного источника серы тиосульфат, хотя растут на нем в 1.5 раза медленнее, чем на сульфате. При этом делеция транспортера CysZ не влияет на скорость роста, хотя по сравнению со штаммом дикого типа увеличивается длительность лаг-фазы. В любом случае это указывает на отдельный путь поглощения тиосульфата у C. glutamicum (рис. 4), причем, соответствующие гены, очевидно, локализуются на другом участке хромосомы. В отличие от того, что наблюдается у E. coli (см. выше), тиосульфат практически не оказывает никакого влияния на экспрессию генов усвоения сульфата [124].

Следует отметить, что транспорт и метаболизм тиосульфата у C. glutamicum мало изучены. Вероятно, что образование сульфида и сульфита из тиосульфата происходит при участии сульфотрансфераз и системы тиоредоксина и глутаредоксина [127], в частности, каких-то продуктов гомологов гена glpE, обнаруженных у этого организма [128]. Кроме того, эти процессы могут осуществляться также импортерами и сульфотрансферазами, родственными YeeE и YeeD, функционирование которых существенно снижает потребность в АТP и NADPH для редукции серы при использовании тиосульфата. В свою очередь, модификации этих генов могут значительно увеличить выход метионина. Наконец, можно использовать соответствующие гены из E. coli, обеспечивая их оптимальную экспрессию в условиях, когда весь образующийся в клетках сульфид расходуется для синтеза метионина.

Применение тиосульфата вместо сульфата обеспечивало повышенную продукцию серосодержащих аминокислот соответствующими штаммами-продуцентами C. glutamicum [128, 129].

4.6. Биосинтез метил-тетрагидрофолата

Метионин отличается от всех других аминокислот, входящих в белки, тем, что содержит метильную группу CH₃-, называемую также C-1, которую должен получать в свою молекулу в процессе биосинтеза. Как уже отмечалось, донорами метильной группы могут выступать 5-метилтетрагидрофолат или 5-метилтетрагидроптероил-три-L-глутамат, а соответствующую реакцию катализирует PLP-зависимая метионинсинтаза (ген metE) или кобаламин-зависимая метионинсинтаза (ген metH), соответственно.

При превращении катализируемого SHMT серина в глицин происходит перенос гидроксиметильной группы на тетрагидрофолат с образованием 5,10-метилентетрагидрофолата (CH₂-THF) [94, 130], который восстанавливается продуктом гена metF 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазой до 5-метилтетрагидрофолата (CH₃-THF) (рис. 2). MetF состоит из четырех идентичных субъединиц, каждая из которых содержит молекулу не ковалентно связанного FAD. В ходе реакции в качестве восстановителя используется NADH, с которого электроны при посредстве FAD переносятся на CH₂-THF [131]. Освобождающийся в результате реакций, катализируемых метионинсинтазами, THF вновь используется в процессе превращения серина в глицин, формируя вместе с ними так называемый одноуглеродный цикл, (One Carbon Cycle) [55].

Известно, что SHMT является PLP-зависимым ферментом. Таким образом, для синтеза глицина и C-1 в клетках также должно поддерживаться достаточное количество этого кофермента, впрочем, как и для ряда других реакций, обеспечивающих синтез метионина.

У E. coli 5,10-метилентетрагидрофолат синтезируется также при расщеплении глицина системой GcvTHP (glycine cleavage system) (рис. 2), кодируемой опероном gcvTHP [132]. Были охарактеризованы системы Gcv нескольких микробных, растительных и животных систем и установлено, что они представляют собой мультиферментные комплексы, состоящие из четырех белковых компонентов: P-белка, H-белка, T-белка и L-белка. Р-белок катализирует PLP- зависимое высвобождение CO₂ из глицина, оставляя метиламиновую часть. Фрагмент метиламина переносится в группу липоевой кислоты Н-белка, которая связывается с Р-белком перед декарбоксилированием глицина. Т-белок катализирует высвобождение NH₃ из метиламиновой группы и переносит оставшуюся единицу C-1 в THF, образуя 5,10-СН₂-THF. Затем L-белок окисляет липоевую кислоту, входящую в состав H-белка, и переносит электроны на NAD⁺, образуя NADH (94). У E. coli L-белок отсутствует, и его роль выполняет многофункциональный белок, кодируемый геном lpdA [133].

Было установлено, что уровень образования C-1 групп в клетках может быть узким местом для биосинтеза метионина, ограничивающим его продукцию. В то же время, усиление активности Gcv системы повысило накопление целевой аминокислоты [134, 135].

У C. glutamicum реакция синтеза глицина, которую катализирует SHMT, кодируемая геном glyA, является единственным способом получения 5,10-СН₂-THF [136]. Однако сверхэкспрессия glyA не благоприятна для роста этих бактерий. Поэтому для обеспечения C-1 группами сверхсинтеза метионина, а также для перепрограммирования метаболизма у продуцентов серина на основе C. glutamicum, вводили оперон gcvTHP из E. coli [137].

6.2. Транспорт метионина и его предшественников в клетки и из клеток у C. glutamicum

Предварительный анализ выявил у C. glutamicum две системы поглощения метионина. Одна из них представлена кластером генов, в котором находился оперон metQNI (обозначен в соответствие с порядком расположения гомологичных генов в локусе metD). Было показано, что делеция ∆metNI нарушает высокоафинный транспорт метионина в клетки, но при этом сохраняется низкоафинный транспорт. Обнаружено также, что высокоафинный транспорт контролируется глобальным регулятором McbR [158].

Исследование природы низкоафинного транспорта выявило, что он зависит от ионов натрия (Na⁺), а не от ATP. Эти результаты указывают на то, что соответствующая система поглощения метионина, обозначенная MetP, функционирует как система вторичного транспорта, связанная с Na⁺. Кроме метионина MetP обеспечивает и поглощение аланина. Установлено, что система MetP кодируется двумя сцепленными генами, metP (NCgl1030) и metS (NCgl1029) и, соответственно, двумя белковыми субъединицами, состоящими из 579 и 60 аминокислотных остатков. Большая субъединица содержит 12, а малая 1 трансмембранный сегмент. Было показано, что оперон metPS не регулируется McbR [158]. Ослабление или удаление генов высокоафинной системы поглощения метионина положительно влияло на его продукцию [158].

Транспорт метионина из клеток C. glutamicum осуществляет двухкомпонентный комплекс BrnFE, кодируемый генми brnF и brnE [159]. Кроме L-метионина этот транспортер, зависимый от протондвижущей силы, участвует в экспорте L-лейцина, L-изолейцина и L-валина. [160]. Однако индукция brnFE была более эффективной в ответ на повышенный уровень метионина по сравнению с изолейцином, хотя именно он и является предпочтительным субстратом для экспорта. У данного транспорера Km для метионина составляет около 10 mM, и кроме него в клетках имеется, по крайней мере, еще одна низкоафинная система экспорта метионина (Km ~ 50 mM), которая экспрессируется конститутивно. Однако возможно, что при значительном повышении внутриклеточной концентрации метионина, его экспорт осуществляется всего лишь за счет побочной активности какого-то транспортера других аминокислот [160]. Экспрессия BrnFE стимулируется регулятором Lrp и усиление его синтеза может положительно влиять на продукцию соответствующих аминокислот штаммами-продуцентами [161].

В заключение следует еще раз отметить важную роль L-метионина в жизнедеятельности различных организмов, его ценность как фармакологического препарата и расширяющееся применение в сельском хозяйстве. В связи с этим задача создания эффективных биотехнологических методов получения этой аминокислоты приобретает все большую актуальность. Сегодня к биотехнологическим процессам получения L-метионина относится как прямой микробиологический синтез, так и двухэтапный способ его получения, предполагающий использование предшественников и их трансформацию в химически чистый L-метионин с помощью ферментов. При этом оба этапа обеспечиваются специально сконструированными штаммами бактерий. Создание эффективных штаммов для этих процессов должно опираться на глубокое знание путей метаболизма этой аминокислоты и всех ее предшественников, их регуляции и взаимосвязи со всем метаболизмом клетки.