Биотехнология, 2023, T. 39, № 5, стр. 108-112

Настоящая работа продолжает серию исследований, нацеленных на разработку ЛП на основе рекомбинантных производных инкретинов GLP-1 и GIP [1–4]. С целью создания двухкомпонентного лекарственного препарата (ЛП) были получены рекомбинантные модифицированные гормоны rmGIP(3‒31)rat и rmGLP-1(3‒31). Вводимые животным по отдельности они демонстрировали активность рекомбинантных антагонистов рецепторов GIPR и GLP-1R, соответственно. В то же время, при совместном применении гормоны полностью нейтрализовали друг друга [4]. Расшифровка этого удивительного явления представляла интерес как с точки зрения уточнения фундаментальных механизмов гликемического контроля, так и в плане разработки новых ЛП на основе агонистов и антагонистов рецепторов GIP и GLP-1.

Мы предполагали два принципиальных механизма обнаруженного эффекта. В его основе могли лежать либо контакты между гормонами, основанные на их межмолекулярном сродстве друг к другу, либо гораздо более сложные биологические взаимодействия, например, опосредуемые рецепторами. В этой связи любые результаты, которые позволяли надежно исключить из рассмотрения один из двух механизмов, автоматически могли быть учтены как свидетельствующие в пользу другого. Опираясь на данный подход, для текущего исследования был выбран поиск свидетельств межмолекулярного взаимодействия между модифицированными гормонами rmGIP(3‒31)rat и rmGLP-1(3‒31).

Исследования возможного взаимодействия между гормонами проводили in vitro с помощью гель-проникающей хроматографии. Растворы гормонов с концентрацией 500 мкг/мл в буфере PBS инкубировали совместно при температуре 24 и 37°C в течение 30 мин. Результаты взаимодействия анализировали на колонке PackDiol-120 (8.0 × 300 mm, S‒5 µm, 12 nm) (YMC, Япония) на жидкостном хроматографе Ultimate 3000 (Dionex, Германия) в буфере PBS со скоростью потока 0.5 мл/мин Разрешающая способность метода позволяет зарегистрировать образование димеров и других продуктов взаимодействия между молекулами гормонов.

Результаты анализа представлены на рис. 1.

Рис. 1.

Хроматограммы очищенных препаратов: а – rmGLP1(3–31), b – rmGIP(3–31)rat, c – [rmGLP1(3–31) + rmGIP(3–31)rat]. Fig. 1. Chromatograms of purified preparations: a – rmGLP1(3-31), b – rmGIP(3-31)rat, c – [rmGLP1(3-31) + rmGIP(3-31)rat].

Согласно результатам анализа, в условиях in vitro признаков взаимодействия между модифицированными гормонами rmGIP(3‒31)rat и rmGLP-1(3‒31) обнаружить не удалось. Наличие замены H18R в rmGIP(3‒31)rat, отличающей гормон человека rmGIP(3‒31)hum от гормона крысы, не повлияло на результат (данные не приведены). Исследуемые пары гормонов не проявили склонности к образованию комплексов в концентрации 500 мкг/мл. Данная величина намного превышает не только нормальное содержание гормонов GIP и GLP-1 в крови животных (максимум, 0.1 мкг/л для GLP-1 и 2.5 мкг/л для GIP [5]), но также и теоретическую величину, ожидаемую в результате применения модифицированных гормонов в обоснованной дозировке. Полученные результаты позволили исключить теорию о непосредственном взаимодействии между гормонами in vitro и in vivo, в том числе – как основу механизма взаимной нейтрализации активности гормонов rmGIP(3‒31)rat и rmGLP-1(3‒31).

Таким образом, данное заключение резко повысило интерес к биологическим рецептор-опосредованным механизмам взаимодействия гормонов.

Известно, что сигнальная активность гормонов GLP-1 и GIP обеспечивается их взаимодействием с рецепторами GLP-1R и GIPR [5]. Вероятным элементом этого процесса является димеризация активированных лигандами рецепторов, причем непосредственными проводниками активности могут выступать как гомо-, так и гетеродимеры [6–8]. При этом рецептор-опосредуемый процесс передачи гормонального сигнала характеризуется негативной кооперативностью [7]. Как было показано (авторами [9], а также в нашей работе [1]), агонисты рецепторов GLP-1 и GIP реализуют присущую им активность как по отдельности, так и в композиции, не обнаруживая никаких признаков эффекта взаимной нейтрализации. Согласно имеющимся представлениям, антагонистическое действие протеолитически инактивированных производных инкретинов и их аналогов основано на конкурентном ингибировании соответствующих рецепторов [10]. В то же время механизм ингибирования остается до конца непонятен и более того, его анализ сопровождается массой противоречивых эффектов [5].

Тем не менее, приняв за основу принципиальное взаимодействие агонистов и антагонистов (лигандов) с рецепторами GLP-1R и GIPR, мы попытались объяснить обнаруженный эффект. Для этого в схему взаимодействия пришлось внести одно радикальное уточнение. Мы предположили, что сродство протомеров рецепторов GLP-1R и GIPR друг к другу и, следовательно, их склонность к образованию сигнальных гомо- и гетеродимеров, может зависеть от лигандов, участвующих в их активации, причем наивысшим уровнем сродства обладают протомеры GLP-1R и GIPR, формирующие гетеродимерные пары. Другим, менее значимым условием сродства может оказаться активация протомеров лигандами одного класса – агонистов или антагонистов рецепторов GLP-1R и GIPR. Все остальные взаимодействия между протомерами, реализуемые путем гомодимеризации или, особенно под влиянием активации лигандами разных классов, могут характеризоваться существенно более низкой эффективностью.

На основании гипотезы следует ожидать, что активированные агонистами и антагонистами протомеры рецепторов GLP-1R и GIPR преимущественно и в первоочередном порядке будут формировать именно гетеродимерные, а не гомодимерные пары. Специфическая сигнальная активность таких пар может отражать, в том числе, уровень сродства между протомерами, участвующими в их образовании. Как следствие, применение сбалансированных комплексов агонистов и/или антагонистов рецепторов GLP-1R и GIPR будет стимулировать повышенное вовлечение соответствующих лигандов в образование гетеродимерных пар и снижение синтеза всех других, менее аффинных продуктов межлигандного взаимодействия. Это может проявляться в виде эффекта нейтрализации антагонистической активности. Однако в случае существенного избытка какого-либо лиганда следует ожидать истощения потенциала гетеродимеризации рецепторов GLP-1R и GIPR и появления их гомодимерных пар, в том числе активированных лигандами сразу двух разных классов, агонистов и антагонистов. Таким образом, в соответствии с гипотезой, антагонистические эффекты являются результатом несбалансированного применения антагонистов рецепторов GLP-1R и GIPR, тогда как их сбалансированное применение будет приводить к их рецептор-опосредованной изоляции и, как возможное следствие, к эффекту взаимной нейтрализации активности. Таким образом, гипотеза полностью и непротиворечиво объясняет эффекты, связанные с индивидуальной активностью антагонистов рецепторов GLP-1R и GIPR и активностью их комплекса, зафиксированные в нашей работе [4].

Данная гипотеза имеет, как минимум, два существенных следствия.

Известно, что агонисты рецепторов GLP-1R и GIPR обладают множественной сигнальной активностью [5, 11]. При этом, ни одна из известных нам работ не раскрывает, какие именно пары рецепторов, гомо- или гетеродимерные, служат истинными проводниками гормональной активности. Это, однако, не подвергает сомнению роль этих рецепторов в соответствующих биологических процессах. В то же время функция рецепторов и их гипотетических гетеродимерных пар, активированных с участием антагонистов, в особенности – сразу обоих антагонистов рецепторов GLP-1R и GIPR, остается загадкой. Предложенная гипотеза предсказывает эффективное образование таких гетеродимерных пар, но не раскрывает их специфическую активность, которая может отличаться от антагонистической. Ряд известных публикаций и в особенности работы последних лет говорят о том, что комплексы агонистов и антагонистов, способные, согласно гипотезе, стимулировать эффективное формирование гетеродимерных пар рецепторов, могут обладать такой же сахароснижающей активностью, как и комплексы агонистов [5, 10].

Второе. В случае ее подтверждения гипотеза способна изменить подход к использованию инкретинов или их аналогов при разработке ЛС. Согласно гипотезе, именно комплексный состав ЛС определяет, будет ли влияние ЛС на гликемию осуществляться сбалансированным образом. Нельзя исключить, что длительное применение или действие несбалансированных ЛС будет нарушать гармоничную “работу” систем, активируемых агонистами и антагонистами рецепторов GLP-1R и GIPR, что может привести к непредсказуемым последствиям.

Таким образом при изучении эффекта взаимной нейтрализации активности антагонистов рецепторов GLP-1R и GIPR, обнаруженного ранее, получены экспериментальные результаты, свидетельствующие в пользу представленной гипотезы о неизвестном ранее механизме взаимодействия рецепторов GLP-1R и GIPR.