1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Биотехнология
  4. T. 39, № 5, 2023

Биотехнология, 2023, T. 39, № 5, стр. 52-60

Рибосомный промотор pRPL25 дрожжей Yarrowia lipolytica как перспективный объект для метаболической инженерии штаммов-продуцентов

А. А. Черенкова 1, Б. В. Свиридов 2, Т. К. Дворянчикова 2, О. Е. Мелькина 2, *

1 ФГБОУ ВО “Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева”
125480 Москва, Россия

2 ФГБУ НИЦ “Курчатовский институт” Курчатовский комплекс НБИКС-природоподобных технологий
123098 Москва, Россия

* E-mail: oligamelkina@gmail.com

Поступила в редакцию 21.09.2023
После доработки 16.10.2023
Принята к публикации 08.11.2023

Полный текст (PDF)

Аннотация

В метаболической инженерии дрожжевых штаммов-продуцентов промоторы относятся к ключевым элементам. Благодаря высокому уровню активности промотор гена RPL25, кодирующего белок L25 большой субчастицы рибосомы Yarrowia lipolytica, – это перспективный объект исследования и оптимизации. Для исследования структуры этого промотора нами сконструирована библиотека рандомизированных последовательностей с шагом в 100 нуклеотидов. Используя в качестве белка-репортера зеленый флуоресцентный белок, мы оценили активность полученных промоторных последовательностей. Показано, что среди исследованных производных промотора pRPL25 минимальная функциональная длина составляет 199 п.н., а оптимальная – 497 п.н. Также выявлено существенное снижение уровня экспрессии производных промотора pRPL25 при уменьшении длины от 497 до 400 п.н., на основании чего мы предполагаем, что между 400 и 500 нуклеотидами промотора гена RPL25 находится активирующая последовательность (upstream activating sequence, UAS). Промотор pRPL25 и его производные можно использовать в биоинженерии метаболических путей с требуемым уровнем экспрессии генов. Сконструированные на их основе штаммы могут быть более эффективными продуцентами целевых молекул, чем классические системы экспрессии, например на основе Saccharomyces cerevisiae.

Ключевые слова: Yarrowia lipolytica, метаболическая инженерия, рибосомный промотор, синтетический промотор, флуоресценция

Дрожжи Yarrowia lipolytica относятся к важным нетрадиционным продуцентам широкого спектра соединений промышленной биотехнологии, включая олеохимические соединения, терпены, органические кислоты, многоатомные спирты и рекомбинантные белки [1–4]. При конструировании штаммов-продуцентов Y. lipolytica необходима сборка одной или нескольких экспрессионных кассет – единиц транскрипции, каждая из которых состоит из промотора, кодирующей последовательности и терминатора [1, 5].

Типичная промоторная последовательность дрожжей включает основной (коровый) промотор и вышерасположенную регуляторную область [2, 6], что схематично изображено на рис. 1.

Рис. 1.

Схематичное строение дрожжевого промотора. Адаптировано из работы [2]. Fig. 1. Schematic structure of a yeast promoter. Adapted from [2].

Коровый промотор ‒ основная детерминанта экспрессии гена, он обеспечивает базовый, минимально необходимый уровень транскрипции [7]. Его длина составляет около 100–200 п.н., включая ТАТА-последовательность, с которой связывается РНК-полимераза II и начинается процесс транскрипции [7–9]. Регуляторная область содержит один или несколько сайтов связывания факторов транскрипции, которые могут взаимодействовать друг с другом и с основными транскрипционными белковыми комплексами, регулируя активность промотора [6, 10].

В настоящее время исследованы и модифицированы различные эндогенные или гибридные промоторы дрожжей Y. lipolytica [2]. Увеличение разнообразия доступных промоторов, варьирующих по транскрипционным характеристикам, способствует расширению инструментальной базы для метаболической инженерии штаммов-продуцентов. Ввиду сложности и специфичности системы регуляции эукариотических промоторов в работах по метаболической инженерии Y. lipolytica чаще всего выбирают эндогенные промоторные последовательности [2, 11].

Потенциальным источником дрожжевых промоторов с сильной конститутивной экспрессией могут быть гены, кодирующие белки рибосом. В исследованиях Saccharomyces cerevisiae показано, что 50% транскриптов, синтезированных РНК-полимеразой II, относится к пулу генов рибосомных белков, а активность промоторов этих генов максимальна в фазе экспоненциального роста клеток, тогда как при переходе к стационарной фазе заметно снижается [12, 13]. В недавно проведенном скрининге эндогенных и гибридных промоторов Y. lipolytica [14] показано, что в экспоненциальной фазе роста, при выращивании как в богатой, так и в минимальной питательной среде, из 64 исследованных промоторов рибосомных белков только активность промотора гена RPL25 превышала таковую для известного “сильного” промотора гена TEF1 (кодирует фактор элонгации трансляции 1α) [15].

В проведенной нами работе нативный рибосомный промотор pRPL25 был использован как объект получения рандомизированных последовательностей с различной активностью, которые в дальнейшем можно использовать при конструировании штаммов-продуцентов Y. lipolytica с требуемым уровнем экспрессии генов.

УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

Штаммы микроорганизмов и плазмиды

В работе использовали штаммы микроорганизмов и плазмиды, представленные в табл. 1.

Таблица 1.

Штаммы и плазмиды Table 1. Strains and plasmids

Штамм или плазмида Характеристика Источник или ссылка
Штаммы Escherichia coli
TOP10 F‒mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 nupG recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrR) endA1 λ‒ [16]
Штаммы Y. lipolytica
Y-3178           W29 MatA, дикий тип БРЦ ВКПМа
Y-4972 W29 ∆ku70::URA3 БРЦ ВКПМ
Y-4973 W29 ∆ku70 ∆URA3 БРЦ ВКПМ
Y-1156 W29 ∆ku70 IntC2::PTEF-hrGFP-TLIP2 ‒ с интегрированным в C2-локус генома промотором pTEF1, транскрипционно слитым с геном-репортером hrGFP [14]
Y-1384 W29 ∆ku70 IntC2::PRPL25-hrGFP-TLIP2 ‒ с интегрированной в C2-локус генома полноразмерной последовательностью промотора pRPL25, транскрипционно слитой с геном-репортером hrGFP [14]
RP100 W29 ∆ku70 IntC2::PdRPL25_100-hrGFP-TLIP2 ‒ как Y-1384, но содержит производное промоторной последовательности pRPL25 длиной 100 п.н. Данная работа
RP199 W29 ∆ku70 IntC2::PdRPL25_199-hrGFP-TLIP2 ‒ как Y-1384, но содержит производное промоторной последовательности pRPL25 длиной 199 п.н. Данная работа
RP300 W29 ∆ku70 IntC2::PdRPL25_300-hrGFP-TLIP2 ‒ как Y-1384, но содержит производное промоторной последовательности pRPL25 длиной 300 п.н. Данная работа
RP400 W29 ∆ku70 IntC2::PdRPL25_400-hrGFP-TLIP2 ‒ как Y-1384, но содержит производное промоторной последовательности pRPL25 длиной 400 п.н. Данная работа
RP497 W29 ∆ku70 IntC2::PdRPL25_497-hrGFP-TLIP2 ‒ как Y-1384, но содержит производное промоторной последовательности pRPL25 длиной 497 п.н. Данная работа
RP600 W29 ∆ku70 IntC2::PdRPL25_600-hrGFP-TLIP2 ‒ как Y-1384, но содержит производное промоторной последовательности pRPL25 длиной 600 п.н. Данная работа
Плазмиды
pProUA-mScarlet Плазмидный вектор содержит ген зеленого флуоресцентного белка (hrGFP), который оптимизирован по кодонам для экспрессии в Y. lipoly-tica, а также селективный маркер URA3, представляющий собой ген синтеза урацила. Вектор разработан для встраивания исследуемого промотора методом Golden Gate Assembly непосредственно перед геном hrGFP; Apr b [14]
pCasNA-IntC2 Хелперная плазмида содержит ген белка Cas9, последовательность ДНК-мишени (sgRNA) для встраивания в С2-локус хромосомы и ген устойчивости к ноурсетрицину; Apr [14]
pProUA-dRPL25_100 Производное промоторной последовательности pRPL25 длиной 100 п.н., встроенное в вектор pProUA-mScarlet; Apr Данная работа
pProUA-dRPL25_199 Производное промоторной последовательности pRPL25 длиной 199 п.н., встроенное в вектор pProUA-mScarlet; Apr Данная работа
pProUA-dRPL25_300 Производное промоторной последовательности pRPL25 длиной 300 п.н., встроенное в вектор pProUA-mScarlet; Apr Данная работа
pProUA-dRPL25_400 Производное промоторной последовательности pRPL25 длиной 400 п.н., встроенное в вектор pProUA-mScarlet; Apr Данная работа
pProUA-dRPL25_497 Производное промоторной последовательности pRPL25 длиной 497 п.н., встроенное в вектор pProUA-mScarlet; Apr Данная работа
pProUA-dRPL25_600 Производное промоторной последовательности pRPL25 длиной 600 п.н., встроенное в вектор pProUA-mScarlet; Apr Данная работа

Примечание: аНациональный биоресурсный центр “Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов”; bApr – устойчивость к ампициллину. Note: а National bioresource center “All-Russian Collection of Industrial Microorganisms”; b Apr – ampicillin resistance.

Нуклеотидная последовательность промотора гена RPL25, кодирующего белок L25 60S субчастицы рибосомы (локус YALI1_F32792g), представлена на рис. 2.

Рис. 2.

Нуклеотидная последовательность промотора гена RPL25 Y. lipolytica. Направление 5' → 3'. Fig. 2. Nucleotide sequence of the Y. lipolytica RPL25 gene promoter. Direction 5' → 3'.

Питательные среды и реактивы

Клетки E. coli TOP10 растили в бульоне Луриа‒Бертани (LB) при 37°С в течение 2 ч до средней логарифмической фазы роста. Селекцию трансформированных штаммов TOP10 проводили на L-агаре с добавлением ампициллина (100 мкг/мл). Клетки Y. lipolytica растили в богатой среде YP (пептон ‒ 10 г/л, дрожжевой экстракт ‒ 5 г/л) или минимальной среде YNB (Yeast Nitrogen Base; M139, HIMEDIA 6.75 г/л) c добавлением в качестве источника углерода 1% об. глюкозы. Для получения агаризованных сред дополнительно вносили 20 г/л агар-агара.

Ноурсетрицин (Jena Bioscience, Германия) использовали для селекции трансформированных штаммов Y. lipolytica в концентрации 50 мкг/мл агаризованной среды YP c добавлением 1% об. глюкозы.

Создание библиотеки рандомизированных последовательностей промотора pRPL25

Рандомизированные последовательности промотора pRPL25 с шагом в 100 п.н. синтезировали методом ПЦР с использованием праймеров, последовательности которых указаны в табл. 2. В качестве матрицы использовали хромосомную ДНК дрожжей Y. lipolytica Y-3178.

Таблица 2.  

Праймеры, использованные для создания рандомизированной библиотеки промотора pRPL25 Table 2.  Primers used to generate the randomized pRPL25 promoter library

Праймер Нуклеотидная последовательность (5' → 3')
RPL1F GCAGAAGACTCACGGGACAGTCACAGGCTAACC
RPL2F GCAGAAGACTCACGGGCCACTACAAGACAAATATTTAC
RPL3F GCAGAAGACTCACGGGGTTCGTCCTTTTTGGGGT
RPL4F GCAGAAGACTCACGGCCATTATTTAGTGCATGGCG
RPL5F GCAGAAGACTCACGGTTAATCTTCGAAGTAATGCTTTA
RPL6F GCAGAAGACTCACGGGCGGTTAAATAAGTTTAGTTGG
RPL_R ATGGAAGACAGCATTGTTGATGTCGTGAGTGTGA

ПЦР-продукты встраивали по сайтам рестрикции BpiI в плазмидный вектор pProUA-mScarlet методом Golden Gate Assembly непосредственно перед геном hrGFP. Трансформацию клеток E. coli TОР10 проводили кальциевым методом по ранее описанному протоколу [16]. Полученные плазмиды: pProUA-dRPL25_100, pProUA-dRPL25_199, pProUA-dRPL25_300, pProUA-dRPL25_400, pProUA-dRPL25_497 и pProUA-dRPL25_600 ‒ проверяли на правильность сборки с помощью аналитической рестрикции и секвенированием по Сэнгеру.

Конструирование штаммов

Полученные плазмиды линеаризовали по сайтам рестрикции NotI и встраивали в хромосому С штамма Y-4973 Y. lipolytica. Трансформацию дрожжей проводили совместно с хелперной плазмидой pCasNA-IntC2 по ранее описанному протоколу [14].

Схематичное изображение интегрированных в С2-локус генома конструкций представлено на рис. 3.

Рис. 3.

Схематичное изображение интегрированных в хромосому С Y. lipolytica конструкций, содержащих рандомизированные последовательности промотора pRPL25. Обозначения: P – промотор; hrGFP – ген зеленого флуоресцентного белка; TerLIP2 – терминатор гена LIP2. Fig. 3. Schematic representation of Y. lipolytica C chromosome-integrated constructs containing randomized pRPL25 promoter sequences. Designations: P, promoter; hrGFP, green fluorescent protein gene; TerLIP2, terminator of the LIP2 gene.

Измерение оптической плотности и флуоресценции биомассы Y. lipolytica

Измерение оптической плотности и флуоресценции дрожжевых культур проводили на планшетном люминометре CLARIOstar Plus (BMG Labtech, Германия). Для этого 200 мкл дрожжевой культуры осаждали центрифугированием, полученный осадок промывали 200 мкл дистиллированной воды, после чего ресуспендировали в таком же объеме дистиллированной воды. Для корректного измерения значений оптической плотности и флуоресценции пробы с дрожжевыми клетками разводили в 10 раз и 100 мкл полученной суспензии клеток переносили в черный 96-луночный планшет (#655096; Greiner Bio-One, Германия) для исключения перекрестного засвечивания. Планшет помещали в люминометр и измеряли оптическую плотность при длине волны 600 нм (OD600) и флуоресценцию (λex/λem 495/535 нм). Коэффициент усиления фотоумножителя автоматически регулировался функцией расширенного динамического диапазона. Измеренные значения нормировали на время накопления ‒ 1 с. В качестве образца сравнения использовали лунки с 200 мкл дистиллированной воды. Обработку полученных данных проводили с использованием программного обеспечения MARS (BMG Labtech).

Оценка активности промоторов

Измеренные значения оптической плотности (OD600) и флуоресценции обрабатывали с помощью программного обеспечения Excel (Microsoft Office 2010). Относительную флуоресценцию (Relative Fluorescence, RF) для каждой лунки рассчитывали путем деления значения измеренной флуоресценции на OD600. Активность исследуемого (i-го) промотора (Pi) рассчитывали по следующему уравнению:

${{P}_{{i~}}}\left( \% \right) = \frac{{\left. {{\text{R}}{{{\text{F}}}_{{{{P}_{i}}~}}} - \bar {X}({\text{R}}{{{\text{F}}}_{{{\text{parent}}}}}} \right)}}{{\bar {X}\left. {\left( {{\text{R}}{{{\text{F}}}_{{{\text{pTEF}}1}}} - \bar {X}({\text{R}}{{{\text{F}}}_{{{\text{parent}}}}}} \right)} \right)}} \times 100,$
где RFPi и RFpTEF1 – значения относительной флуоресценции штаммов с интегрированными i-м промотором и pTEF1 соответственно; RFparent – значение относительной флуоресценции родительского штамма Y-4972 без интеграции; $\bar {X}$ – среднее арифметическое значение для трех повторов.

Активность каждого промотора (Pi) рассчитывали по шкале, где аутофлуоресценция родительского штамма Y-4972 без интеграции равна 0%, а флуоресценция штамма Y-1156 (W29 ∆ku70 IntC2::PTEF-hrGFP-TLIP2) с сильным промотором pTEF1 равна 100%. Стандартное отклонение для полученных значений силы i-го промотора рассчитывали на основе трех повторов с использованием независимых трансформантов с каждой конструкцией.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для исследования активности промоторов рандомизированной библиотеки в сравнении с исходным промотором pRPL25 полученные дрожжевые трансформанты с каждой конструкцией инкубировали в богатой (YP) и минимальной (YNB) средах до экспоненциальной и стационарной фаз роста. Три изолированных колонии каждого штамма инокулировали в 20-миллилитровые стеклянные пробирки, содержащие 1 мл YP с 1% об. глюкозы, и культивировали в течение 16–20 ч при 30°С и перемешивании со скоростью 250 об/мин. Полученную культуру засевали в 50-миллилитровые стеклянные пробирки, содержащие 2 мл YP или YNB с 1% об. глюкозы, доводили оптическую плотность до 0.1 OD600 и растили при 30°C и 250 об/мин до экспоненциальной и стационарной фаз роста (соответственно 16/32 ч для богатой среды и 24/48 ч для минимальной среды). Из каждой культуры отбирали по 200 мкл суспензии, осаждали клетки центрифугированием (12 000 g в течение 1 мин) и промывали в 200 мкл дистиллированной воды. На этом этапе визуально оценивали активность исследуемых промоторов ‒ по флуоресценции биомассы штамма в синем светодиодном трансиллюминаторе DR46B (Clare Chemical Research, США) с оранжевым фильтром (рис. 4).

Рис. 4.

Визуальная оценка флуоресценции биомассы штаммов Y. lipolytica, культивированных в среде YP с 1% об. глюкозы в течение 16 (a) и 32 (b) ч. Слева направо: родительский штамм Y-4972 без интеграции; штаммы с интегрированными в геном промоторными последовательностями: dRPL25_100, _199, _300, _400, _497, _600, RPL25 и TEF1. Fig. 4. Visual assessment of biomass fluorescence of Y. lipolytica strains cultivated in YP medium with 1% vol. glucose for 16 (a) and 32 (b) h. From left to right: parent Y-4972 strain without integration; strains with the genome integrated promoter sequences: dRPL25_100, _199, _300, _400, _497, _600, RPL25, and TEF1.

На следующем этапе измеряли оптическую плотность и флуоресценцию биомассы штаммов и рассчитывали активность промоторов по алгоритму, приведенному в разделе “Условия эксперимента”. Полученные результаты представлены на рис. 5.

Рис. 5.

Оценка активности промоторов (Pi) в штаммах Y. lipolytica, культивированных в средах YP (a) и YNB (b) с 1% об. глюкозы до экспоненциальной и стационарной фаз роста (16/32 и 24/48 ч соответственно для a и b). Планки погрешностей отображают стандартное отклонение, рассчитанное на основе трех независимых трансформантов. Fig. 5. Evaluation of promoter activity (Pi) in Y. lipolytica strains cultivated in YP (a) and YNB (b) media with 1% vol. glucose to exponential and stationary growth phases (16/32 and 24/48 h for a and b, respectively). Error bars represent the standard deviation calculated for three independent transformants.

Как видно из результатов, представленных на рис. 4 и 5, при длине последовательности pRPL25 в 100 п.н. интенсивность флуоресценции трансформанта аналогична контрольному штамму Y. lipolytica 4972. При увеличении длины до 199 п.н. активность промотора усиливается и достигает 30–40% (зависит от среды культивирования и стадии роста) от pTEF1. При увеличении длины промотора до 400 п.н. интенсивность флуоресценции и активность промотора практически не меняются. Исходя из этого, можно заключить, что последовательность dRPL25 длиной 199 п.н. представляет собой коровый элемент промотора pRPL25, обеспечивающий базовый уровень экспрессии.

При дальнейшем увеличении длины промоторной последовательности до 497 п.н. наблюдали резкое усиление интенсивности флуоресценции и, следовательно, активности промотора: с 50 до 120% от активности pTEF1. На основе наблюдаемой разницы в силе dRPL25_400 и dRPL25_497 можно предположить, что между 400 и 500 нуклеотидами pRPL25 находится активирующая последовательность (upstream activating sequence, UAS).

Дальнейшее увеличение длины промотора pRPL25 до 600 п.н. не приводило к усилению его активности как в минимальной, так и в богатой среде. Таким образом, можно заключить, что последовательность dRPL25 длиной 497 п.н. может выступать в качестве оптимального укороченного варианта полноразмерного промотора pRPL25 без существенного снижения его силы.

Следует заметить, что для всех исследованных промоторов рандомизированной библиотеки выявлено снижение экспрессии репортерного гена при переходе от экспоненциальной к стационарной фазе роста штаммов Y. lipolytica, что характерно и для нативного промотора гена RPL25. Это видно как визуально ‒ по ослаблению зеленой флуоресценции биомассы (рис. 4), ‒ так и по данным гистограмм (рис. 5). Данная закономерность наблюдается при выращивании дрожжевой культуры как в богатой, так и в минимальной питательной среде. Сопоставимость результатов, полученных для сред различного состава, может свидетельствовать об одинаковой регуляции активности исследуемых промоторов в разных условиях роста клеток дрожжей [13]. Полученные результаты по снижению активности рибосомных промоторов в стационарной фазе роста клеток согласуются с данными исследований, проведенных на S. cerevisiae [12, 13].

Стабильный уровень экспрессии сильных конститутивных промоторов обеспечивает высокие выходы целевых продуктов, что было показано для эндогенных промоторов Y. lipolytica pFBA1, pTDH1, pGPM1 [17], задействованных в катаболических реакциях, а также для рибосомных промоторов pTEF1 и pRPS7 [15]. Для приведенных “катаболических” промоторов высокую активность регистрировали как в экспоненциальной, так и в стационарной фазах роста дрожжевой культуры, что позволяет применять их для синтеза гетерологичных белков или накопления липидных соединений [17], где важно сохранение высокого уровня экспрессии ключевых генов в стационарной фазе роста культуры.

Характерное для рибосомных промоторов дрожжей снижение активности в стационарной фазе роста можно использовать как инструмент для конструирования метаболических путей, в которых синтез конечных или промежуточных продуктов необходим на стадии экспоненциального роста [3, 18, 19]. Однако из рибосомных промоторов Y. lipolytica, помимо широкого используемого сильного промотора pTEF1, применение находит только значительно уступающий ему по активности промотор гена RPS7, кодирующего белок S7 малой субчастицы рибосомы [15, 20].

Исследованные нами нативный рибосомный промотор pRPL25 и его производное dRPL25_497 проявляют сопоставимые с pTEF1 уровни активности и дополняют набор сильных конститутивных промоторов, доступных для метаболической инженерии дрожжей Y. lipolytica. Сконструированные на их основе штаммы могут быть более эффективными продуцентами биологически активных молекул, чем классические системы экспрессии, такие как S. cerevisiae [15, 21, 22]. Более короткие производные промотора pRPL25, со сниженной активностью, также могут найти применение для решения задач метаболической инженерии, например, когда использование сильного промотора может привести к снижению выхода целевого продукта [23].

Список литературы

  1. Madzak C. Yarrowia lipolytica strains and their biotechnological applications: how natural biodiversity and metabolic engineering could contribute to cell factories improvement. J. Fungi, 2021, 7(7), 548. https://doi.org/10.3390/jof7070548

  2. Sun M.L., Shi T.Q., Lin L., Ledesma-Amaro R., Ji X.J. Advancing Yarrowia lipolytica as a superior biomanufacturing platform by tuning gene expression using promoter engineering. Bioresour. Technol., 2022, 347, 126717. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2022.126717

  3. Soong Y.V., Liu N., Yoon S., Lawton C., Xie D. Cellular and metabolic engineering of oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for bioconversion of hydrophobic substrates into high-value products. Eng. Life Sci., 2019, 19(6), 423–443. https://doi.org/10.1002/elsc.201800147

  4. Park Y.K., Ledesma-Amaro R. What makes Yarrowia lipolytica well suited for industry? Trends Biotechnol., 2023, 41(2), 242–254. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2022.07.006

  5. Decoene T., De Maeseneire S.L., De Mey M. Modulating transcription through development of semi-synthetic yeast core promoters. PLoS One, 2019, 14(11), e0224476. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0224476

  6. Blazeck J., Alper H.S. Promoter engineering: recent advances in controlling transcription at the most fundamental level. Biotechnol. J., 2013, 8(1), 46–58. https://doi.org/10.1002/biot.201200120

  7. Portela R.M., Vogl T., Kniely C., Fischer J.E., Oliveira R., Glieder A. Synthetic core promoters as universal parts for fine-tuning expression in different yeast species. ACS Synth. Biol., 2017, 6(3), 471–484. https://doi.org/10.1021/acssynbio.6b00178

  8. Lubliner S., Regev I., Lotan-Pompan M., Edelheit S., Weinberger A., Segal E. Core promoter sequence in yeast is a major determinant of expression level. Genome Res., 2015, 25(7), 1008–1017. https://doi.org/10.1101/gr.188193.114

  9. Haberle V., Stark A. Eukaryotic core promoters and the functional basis of transcription initiation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2018, 19(10), 621–637. https://doi.org/10.1038/s41580-018-0028-8

  10. Blazeck J., Liu L., Redden H., Alper H. Tuning gene expression in Yarrowia lipolytica by a hybrid promoter approach. Appl. Environ. Microbiol., 2011, 77(22), 7905–7914. https://doi.org/10.1128/AEM.05763-11

  11. Liu R., Liu L., Li X., Liu D., Yuan Y. Engineering yeast artificial core promoter with designated base motifs. Microb. Cell Fact., 2020, 19(1), 38. https://doi.org/10.1186/s12934-020-01305-4

  12. Warner J.R. The economics of ribosome biosynthesis in yeast. Trends Biochem. Sci., 1999, 24(11), 437–440. https://doi.org/10.1016/s0968-0004(99)01460-7

  13. Keren L., Zackay O., Lotan-Pompan M., Barenholz U., Dekel E., Sasson V., Aidelberg G., Bren A., Zeevi D., Weinberger A., Alon U., Milo R., Segal E. Promoters maintain their relative activity levels under different growth conditions. Mol. Syst. Biol., 2013, 29(9), 701. https://doi.org/10.1038/msb.2013.59

  14. Yuzbashev T.V., Yuzbasheva E.Y., Melkina O.E., Patel D., Bubnov D., Dietz H., Ledesma-Amaro R. A DNA assembly toolkit to unlock the CRISPR/Cas9 potential for metabolic engineering. Commun. Biol., 2023, 6(1), 858. https://doi.org/10.1038/s42003-023-05202-5

  15. Müller S., Sandal T., Kamp-Hansen P., Dalbøge H. Comparison of expression systems in the yeasts Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Klyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe and Yarrowia li-polytica. Cloning of two novel promoters from Yarrowia lipolytica. Yeast, 1998, 14(14), 1267–1283. https://doi.org/10.1002/(SICI)1097-0061(1998100)14:14<1267::AID-YEA327>3.0.CO;2-2

  16. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва, Мир, 1984, 480 с.

  17. Hong S.P., Seip J., Walters-Pollak D., Rupert R., Jackson R., Xue Z., Zhu Q. Engineering Yarrowia lipolytica to express secretory invertase with strong FBA1IN promoter. Yeast, 2012, 29(2), 59–72. https://doi.org/10.1002/yea.1917

  18. Wang D.N., Feng J., Yu C.X., Zhang X.K., Chen J., Wei L.J., Liu Z., Ouyang L., Zhang L., Hua Q., Liu F. Integrated pathway engineering and transcriptome analysis for improved astaxanthin biosynthesis in Yarrowia lipolytica. Synth. Syst. Biotechnol., 2022, 7(4), 1133‒1141. https://doi.org/10.1016/j.synbio.2022.08.001

  19. Celinska E., Borkowska M., Bialas W., Kubiak M., Korpys P., Archacka M., Ledesma-Amaro R., Nicaud J.M. Genetic engineering of Ehrlich pathway modulates production of higher alcohols in engineered Yarrowia lipolytica. FEMS Yeast Res., 2019, 19(2), foy122. https://doi.org/10.1093/femsyr/foy122

  20. Cho E.M., Lee H.S., Eom C.Y., Ohta A. Construction of high sensitive detection system for endocrine disruptors with yeast n-alkane-assimilating Yarrowia lipolytica. J. Microbiol. Biotechnol., 2010, 20(11), 1563–1570. https://doi.org/10.4014/jmb.1004.04030

  21. Madzak C., Gaillardin C., Beckerich J.M. Heterologous protein expression and secretion in the non-conventional yeast Yarrowia lipolytica: a review. J. Biotechnol., 2004, 109(1–2), 63–81. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2003.10.027

  22. Nicaud J.M. Yarrowia lipolytica. Yeast, 2012, 29(10), 409–418. https://doi.org/10.1002/yea.2921

  23. Dulermo R., Brunel F., Dulermo T., Ledesma-Amaro R., Vion J., Trassaert M., Thomas S., Nicaud J.M., Leplat C. Using a vector pool containing variable-strength promoters to optimize protein production in Yarrowia lipolytica. Microb. Cell Fact., 2017, 16(1), 31. https://doi.org/10.1186/s12934-017-0647-3

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Биотехнология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал