Биотехнология, 2023, T. 39, № 5, стр. 97-107
Рекомбинантный вирус осповакцины, экспрессирующий симпортер натрия/йодида, для тераностики злокачественных опухолей с использованием синхротронного излучения
А. В. Семенова 1, *, А. А. Гражданцева 1, Г. Ф. Сиволобова 1, Г. А. Кудров 1, А. С. Кабанов 1, А. А. Легкодымов 2, К. Э. Купер 2, А. П. Агафонов 1, Г. В. Кочнева 1
1 ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии “Вектор”
Роспотребнадзора
630559 р.п. Кольцово, Новосибирская область, Россия
2 ФГБУН Институт ядерной физики им. Г.И. Будкера Сибирского отделения
Российской академии наук
630090 Новосибирск, Россия
* E-mail: tkacheva_av@mail.ru
Поступила в редакцию 26.09.2023
После доработки 15.10.2023
Принята к публикации 07.11.2023
Аннотация
Сконструирован рекомбинантный штамм вируса осповакцины VV-mNIS-dGF, геном которого содержит инсерцию трансгена ‒ симпортера натрия/йодида мыши (mNIS). Эта инсерция находится в районе делеции фрагмента гена вирусной тимидинкиназы (tk). Дополнительная делеция в гене вирусного ростового фактора (vgf) обеспечивает аттенуацию вируса в отношении нормальных клеток и усиливает адресность его репликации в раковых клетках. Противоопухолевые свойства штамма VV-mNIS-dGF изучали на двух мышиных моделях: меланомы В16-F10 и карциномы толстой кишки СТ-26. В обеих моделях сконструированный штамм VV-mNIS-dGF проявлял высокую онколитическую активность, эффективно экспрессировал трансген mNIS и аккумулировал йодид в опухолевых клетках как в экспериментах in vitro, так и in vivo в аллотрансплантатах мышей. Количественное определение содержания йода в опухолях проводили методом рентгенофлуоресцентного элементного анализа с использованием синхротронного излучения (РФА-СИ). На основании полученных данных штамм VV-mNIS-dGF можно рассматривать как перспективный препарат для виротерепии и диагностики (тераностики) злокачественных опухолей.
Создание препаратов, которые одновременно можно использовать и в ранней диагностике, и в терапии, ‒ новый подход в фармацевтике, получивший название тераностика (англ. theranostics). Тераностика ‒ это наиболее эффективный путь для лечения многих заболеваний, в том числе онкологических. Стратегия этого подхода состоит в том, чтобы сначала “увидеть”, то есть диагностировать, мишень, а потом этим же “инструментом” ее поразить (https://uihc.org/health-topics/what-theranostics).
На роль такого инструмента в случае онкологии идеально подходят онколитические вирусы, которые способны адресно распознавать и “убивать” (лизировать) раковые клетки [1]. Онколитические вирусы могут быть генетически модифицированы ‒ с целью повышения их диагностической и терапевтической эффективности в отношении опухолей и метастазов. Особое место при генетической модификации вирусов занимают трансгены репортерных белков, экспрессия которых в составе онколитических вирусов в раковых клетках позволяет отслеживать четкую картину опухолевого процесса в динамике, а также эффективность терапии [2, 3].
В настоящее время ген симпортера натрия/йодида SLC5A5, или чаще упоминаемый в научной литературе как NIS, является одним из старейших и наиболее успешных репортерных трансгенов, который используют для молекулярной визуализации и таргетной радионуклидной терапии. NIS – трансмембранный гликопротеин, участвующий в поглощении йодида в фолликулярных клетках щитовидной железы [4]. Векторная доставка гена NIS позволяет сконцентрировать йодид в тканях других органов ‒ в которых обычно NIS не экспрессируется. В ряде исследований продемонстрирована возможность визуализации опухолей с использованием технологий позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) и однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ) благодаря NIS-опосредованному поглощению γ-излучающих радиоизотопов йода:123I, 124I, 125I и 131I (см. обзор [5]). Поглощение и концентрирование нерадиоактивного йода опухолевыми клетками можно визуализировать рентгеноскопическими методами, в частности с использованием синхротронного излучения (СИ), где йод ‒ контрастирующий субстрат [6].
Использование СИ в рентгеновском диапазоне открывает новые возможности для оценки эффективности онкотерапии, в том числе это относится к таким новым направлениям, как онколитическая виротерапия [7]. СИ обладает высокой интенсивностью и имеет малую угловую расходимость, поэтому для получения изображений, кроме традиционного метода поглощения (принцип рентгеноскопии), можно использовать рефракцию (преломление) или рассеяние фотонов на границах раздела сред. Благодаря уникальным параметрам СИ можно получать снимки с высоким разрешением даже для тех объектов, плотность которых незначительно отличается друг от друга, что важно для выявления опухоли на ранней стадии ее развития. Технологию синхротронной рентгеноскопии используют в различных диагностических процедурах, таких как ангиография, маммография, денситометрия, то есть там, где требуется высокое качество снимков [4, 8, 9]. Визуализация с помощью СИ опухолей и метастазов у модельных животных в процессе лечения онколитическими вирусами позволит оценивать эффективность терапии в доклинических исследованиях за счет получения изображений с более высоким контрастом и лучшим пространственным разрешением, чем это возможно получить методами ОФЭКТ и ПЭТ.
Вирус осповакцины (vaccinia virus, VACV) относится к перспективным онколитическим вирусам для разработки противоопухолевых препаратов [1, 3]. VACV имеет широкий тропизм к клеткам опухолей человека и животных и лизирует их с высокой скоростью. Кроме того, VACV обладает высокой природной онкоселективностью ‒ его репликация в тысячи раз эффективнее в опухолевых клетках, чем в нормальных [10‒12].
В представленной работе использован российский штамм VACV L-IVP (GenBank Acc. No. KP233807), который широко применялся для вакцинации населения против натуральной оспы, поэтому его структура и характеристики, в том числе безопасность, патогенность и реактогенность, хорошо изучены [13]. Использование VACV в качестве вектора при разработке противоопухолевых препаратов сопряжено с необходимостью дополнительной аттенуации вируса ‒ во избежание возможных постинфекционных осложнений [14]. С этой целью в два гена VACV: тимидинкиназы (tk) и вирусного ростового фактора (vgf) ‒ были введены делеции, сочетанное присутствие которых приводит к практически полному отсутствию репликации вируса в неделящихся или медленно делящихся клетках, в то время как цитотоксический эффект мутанта на раковые клетки не отличается от исходного штамма [15]. Ранее нами показано, что вирулентность рекомбинантных вариантов L-IVP с делециями генов tk и vgf в 100 и более раз ниже, чем родительского [16].
Цель представленной работы ‒ конструирование и изучение свойств рекомбинантного варианта штамма L-IVP VACV, несущего делеции в генах tk и vgf и вставку трансгена ‒ симпортера натрия/йодида мыши (mNIS) ‒ в район делеции tk-гена, с целью оценки его пригодности для тераностики опухолей с помощью СИ.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Вирусы и культуры клеток
В работе использовали культуры клеток, полученные из Коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ “Вектор” Роспотребнадзора: 4647 (линия клеток почки африканской зеленой мартышки; коллекционный шифр ‒ 184); Н143ТК‒ (дефектный по тимидинкиназе вариант линии клеток HOS остеосаркомы человека; коллекционный шифр ‒ 149). Культура клеток B16-Н10 меланомы мыши получена из ФГБНУ “Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина” (Москва); клетки СТ-26 карциномы толстой кишки мышей получены из Института химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (Новосибирск). Все клетки растили на среде DMEM с 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (ООО “БиолоТ”, Россия) и антибиотиками (ампициллин – 100 мкг/мл, гентамицин – 80‒160 мкг/мл, амфотерицин В – 25 мкг/мл). Рекомбинантный штамм вируса осповакцины – VVdGF2/6, несущий делецию гена vgf, ‒ получен ранее [11]. Вирус растили на культуре клеток 4647 и очищали центрифугированием в градиенте концентраций сахарозы (25‒40%). Титр вируса определяли методом бляшкообразования на монослое клеток 4647, окрашенном фиксирующим раствором кристаллического фиолетового (2 г/л кристаллический фиолетовый, 50 мл/л формальдегид, 100 мл/л этанол, вода).
Конструирование рекомбинантного варианта VV-mNIS-dGF
Для получения рекомбинантного варианта VV-mNIS-dGF сконструировали инсерционную плазмиду pXJP-P7.5synth-mNIS, которая содержала фрагмент ДНК VACV L-IVP, соответствующий позициям 80682‒82251 нуклеотидной последовательности (GenBank Acc. No. KP233807). Фрагмент вирусной ДНК в плазмиде разделили на левую (595 п.н., позиции 80682‒81277) и правую (933 п.н., позиции 81307‒82251) части (ТК flank 1 и ТК flank 2 соответственно) с делецией 30 п.н. в центральной части гена tk VACV, в область которой встроили фрагмент ДНК, содержащий синтетический промотор VACV Р7.5synth (36 п.н.) и полилинкер (Nhe1, HindIII, BamH1, EcoRI), ‒ для дальнейшего встраивания трансгенов и их экспрессии под контролем промотора Р7.5synth [17]. Оптимизированная последовательность гена mNIS (GenBank AF235001) ‒ мышиного симпортера нат-рия/йодида ‒ была синтезирована в ЗАО “Евроген” (Россия) и встроена в полилинкер плазмиды по сайтам рестрикции HindIII‒EcoRI.
Для проведения трансфекции ДНК плазмиды pXJP-P7.5synth-mNIS нарабатывали в препаративных количествах из 250 мл среды Лурия-Бертани (LB) и выделяли с использованием набора EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Германия). Для трансфекции использовали Lipofectamine™ LTX и PLUS™ (Invitrogen, США). Трансфекцию проводили на 90%-ном монослое клеток Н143ТК‒, выращенном в 6-луночных планшетах (Greiner, Австрия). Клетки заражали рекомбинантным штаммом-реципиентом VVdGF2/6 с множественностью инфекции (MOI) 0.05 БОЕ/клетка и через 1 ч инкубации при 37°С вносили 1 мл среды DMEM, содержащей 5 мкг плазмидной ДНК, 20 мкл Lipofectamine™ LTX и 5 мкл PLUS™ Reagent. Через 1 ч инкубации при 37°С в атмосфере 5%-ного СО2 (далее: 37°С/5% СО2) в лунки добавляли по 2 мл DMEM и инкубировали еще 24‒36 ч до развития цитопатического эффекта. Материал трижды замораживали‒оттаивали и обрабатывали ультразвуком для получения гомогенной вирусной суспензии. Далее проводили селекцию рекомбинантов путем двукратного пассирования на монослое клеток Н143ТК‒ с добавлением 25 мкг/мл бромдезоксиуридина (Sigma, США) в DMEM. Вирус клонировали методом бляшек под твердым агаровым покрытием и анализировали на наличие встроенного трансгена mNIS методом ПЦР с использованием пары праймеров: TK-flank1 sense (5'-CAGAATTAATTAGACGAGTTAGACG-3') и TK-flank2 as (5'-ATTGGGTGAGGAAACCGAGA-3'); делецию гена vgf подтверждали с использованием праймеров Up35 (5'-GTAAGCAAAGAATATAAGAATGAAGCGGTAATG-3') и Apa-L22 (5'-CCATCTCCCGGTATTGTGCTCG-3').
Вирусную ДНК для проведения ПЦР выделяли с использованием набора ДНК-сорб (ЗАО “Интерлабсервис”, Россия). Рекомбинант VV-mNIS-dGF содержал вставку трансгена mNIS расчетной длины ‒ 2298 п.н. Отобранный рекомбинантный вариант дважды реклонировали, чтобы избежать следовых примесей исходного вируса. Структуру района вставки подтверждали секвенированием. Готовый рекомбинантный штамм VV-mNIS-dGF с титром 109 БОЕ/мл хранили в расфасованном виде при ‒40°С до использования.
Анализ экспрессии mNIS методом иммуноблотинга
Монослой клеток B16-F10 заражали рекомбинантным штаммом VV-mNIS-dGF и исходным штаммом VVdGF2/6 (отрицательный контроль) с MOI 10 БОЕ/клетка и инкубировали 24 ч при 37°С/5% СО2. Клетки разрушали лизирующим буфером RIPA (Sigma), центрифугировали 30 мин при 22 000 g и 4°C, белки разделяли методом SDS-PAGE и анализировали методом иммуноблотинга, как описано ранее [18], используя в качестве первичных моноклональные анти-NIS-антитела G-5 (#sc-514487; Santa Cruz Biotechnology, США), специфичные к 594‒617 а.о. С-концевого цитоплазматического домена белка mNIS, а также антитела против β-актина ‒ в качестве внутреннего контроля (sc-47778; Santa Cruz Biotechnology). В качестве вторичных использовали конъюгированные с щелочной фосфатазой поликлональные антитела козы против IgG мыши (#A3562; Sigma).
Анализ экспрессии трансгена mNIS методом ПЦР в реальном времени
Монослой клеток B16-F10 и CT-26, выращенный в 6-луночных культуральных планшетах, заражали рекомбинантными вирусами c MOI 0.1, 1.0 и 10.0 БОЕ/клетка. Через 24 ч выделяли суммарную клеточную РНК с использованием набора для выделения РНК на колонках RU-250 (ООО “Биолабмикс”, Россия) по протоколу производителя. Для удаления загрязнения геномной ДНК и исключения контаминаций при ПЦР полученные образцы РНК обрабатывали ДНКазой I (Ambion DNase I; Invitrogen). Реакцию обратной транскрипции проводили с помощью набора реактивов ОТ-M-MuLV-RH (ООО “Биолабмикс”) по протоколу производителя. Уровень экспрессии гена mNIS определяли методом ПЦР в реальном времени в присутствии красителя SYBR Green I с использованием набора БиоМастер HS-qPCR SYBR Blue (2×) (ООО “Биолабмикс”) на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США). В качестве внутренних контролей для нормирования продуктов амплификации использовали гены “домашнего хозяйства”: глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) и β-актина (ACTB). Праймеры к мРНК mNIS, GAPDH и β-актина подбирали с помощью программы Primer Blast (табл. 1).
Таблица 1.
Структура праймеров Table 1. Structures of the primers
| Праймер | Последовательность, 5' → 3' |
|---|---|
| GAPDH-F | GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG |
| GAPDH-R | GAGCCCCAGCCTTCTCCATG |
| ACTB-F | CCTGGCACCCAGCACAAT |
| ACTB-R | GGGCCGGACTCGTCATAC |
| NIS-F | GATGCACCAATGCCTCTGTC |
| NIS-R | TACCCAGAGCCCCGTAGTAG |
Изменения в экспрессии генов рассчитывали по методу 2–∆∆CT [19]. Для анализа полученных данных и количественного определения уровня экспрессии целевых генов использовали программное обеспечение Manager 3.1 амплификатора Bio-Rad CFX.
Оценка онколитической активности рекомбинантного вируса in vitro
Цитотоксический эффект рекомбинантного штамма VV-NIS-dGF в отношении опухолевых клеток мышей (онколитическая активность) определяли в фотометрическом тесте с использованием субстрата для митохондриальных дегидрогеназ 2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2Н-тетразолий-5-карбосанилида (реагент XTT, Sigma), как описано ранее [11]. Онколитическую активность штамма оценивали по отношению специфической гибели клеток, инфицированных рекомбинантом VV-mNIS-dGF, к аналогичному показателю для неинфицированных клеток. В работе использовали раковые клетки мыши B16-F10 и СТ-26. Онколитическую активность выражали как 50%-ную цитотоксическую дозу (ЦТД50) – концентрацию вируса, вызывающую гибель 50% клеток. Чем выше ЦТД50, тем ниже онколитическая активность вируса. Диапазон доз инфицирования, MOI, варьировал в пределах 0.0001–10 БОЕ/клетка. Значение для каждой точки определяли в 5 повторах, рассчитывали среднее значение и дисперсию для различных концентраций вируса, строили график зависимости оптической плотности от множественности инфекции. Все расчеты проводили с использованием программного обеспечения LabView.
Реакция Санделла‒Колтоффа [20] для определения поглощения ионов йода клетками
Монослой клеток В16-F10 и CT-26 в культуральных 96-луночных микропланшетах заражали вирусной суспензией в 10-кратных разведениях (MOI от 1 до 0.01 БОЕ/клетка), инкубировали 24 ч, промывали буфером HHBS (Hank’s буфер с 10 мМ HEPES) 4 раза (после каждого цикла промывки оставляли в лунке 95 мкл). После последней процедуры промывки в каждую лунку вносили 5 мкл раствора 0.1 мМ NaI (конечная концентрация 0.005 мМ). Клетки инкубировали 2 ч при комнатной температуре, промывали 4 раза буфером HHBS, планшет переворачивали и высушивали в течение 10 мин, чтобы удалить оставшиеся внеклеточные ионы йода (I–). Стандартные растворы NaI (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 пмоль в 100 мкл воды) и воду вносили в двух повторах в контрольные лунки планшета. Во все лунки, кроме содержащих стандартные образцы, вносили по 100 мкл деионизованной воды, а затем во все лунки планшета ‒ по 100 мкл 10.5 мМ (NH4)4Ce(SO4)4 и 100 мкл 24 мМ NaAsO2. Планшет инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре и регистрировали оптическую плотность при длине волны 405 нм (OD450) на планшетном спектрофотометре SpectraCount (Packard, США). Для каждого планшета строили кривую зависимости значений OD450 от стандартных концентраций NaI и использовали линейную регрессию для построения калибровочной кривой. Концентрацию йодида в инфицированных клетках определяли по калибровочной кривой на основании значения OD450 в соответствующей лунке планшета. Значения OD450 для каждой экспериментальной точки определяли в 8 повторах, рассчитывали среднее значение и дисперсию.
Эксперименты на животных
В работе использовали мышей линий BALB/c и C57BL/6 (самки, возраст 8 недель, масса 18–22 г, без посторонней микрофлоры), которые были получены из питомника лабораторных животных ФБУН ГНЦ ВБ “Вектор” Роспотребнадзора. Животных содержали на стандартном рационе питания и свободном доступе к воде.
Оценка противоопухолевой активности рекомбинантного штамма VACV
Опухолевые клетки В16-F10 и CT-26 трансплантировали мышам подкожно, вдоль позвоночника в верхнюю половину туловища. Объем клеточной суспензии во всех случаях составлял 100 мкл. Клетки разводили 0.9%-ным раствором NaCl, доза введения составляла 5 × 105 для клеток В16-F10 и 1 × 106 для клеток СТ-26. Через 10 сут у мышей образовывались опухолевые узлы размером 200‒400 мм3, животных делили на 2 группы: опытная (n = 10) и контрольная (n = 10) ‒ для каждого вида опухоли.
Вирус вводили мышам опытных групп в район опухоли двукратно с интервалом 3 сут в дозе 1 × 107 БОЕ/опухоль в 50 мкл 0.9%-ного NaCl, мышам контрольных групп вводили только физраствор в том же объеме.
Эффективность виротерапии оценивали по уменьшению объема опухолевого узла и проценту торможения роста опухоли (ТРО). Размер опухоли оценивали электронным штангенциркулем в двух измерениях, объем вычисляли по формуле:
где a ‒ длина (мм), b –ширина (мм).Процент ТРО вычисляли по формуле:
Длительность эксперимента составляла 21 сут; на 22 сутки мышей выводили из эксперимента и забирали образцы опухолевых узлов для последующего рентгенофлуоресцентного анализа.
Рентгенофлуоресцентный элементный анализ опухолей с использованием синхротронного излучения (РФА-СИ)
За 30 мин до выведения из эксперимента мышам внутрибрюшинно вводили 100 мкл раствора 20 мМ NaI (Scharlau, Испания) в 0.9%-ном NaCl. После эвтаназии фрагменты опухолей извлекали и готовили 25%-ные гомогенаты в 0.9%-ном NaCl. По 4 образца гомогенатов опухолей из опытных и контрольных групп животных лиофилизовали в системе FreeZone 2.5 (Labconco, США) в течении 24 ч. Для лиофилизации использовали следующие объемы 25%-ных гомогенатов: по 350 мкл в случае аллотрансплантатов В16-F10 и по 500 мкл для CT-26. Из высушенных образцов массой более 10 мг прессовали таблетки диаметром 6 мм под давлением ~200 кг/см2. Таблетки помещали между двумя майларовыми пленками и закрепляли во фторопластовые кольца. Эксперименты проводили на станции РФА-СИ накопительного кольца ВЭПП-4М ИЯФ СО РАН. Характеристики станции РФА-СИ на накопителе ВЭПП-4М и ее экспериментальное оборудование подробно описаны в работе [21]. Синхротронное излучение генерировалось 9-полюсным вигглером, установленным в прямолинейном промежутке накопителя ВЭПП-4М. Рабочая энергия электронного сгустка в накопителе составляла 4.5 ГэВ при среднем токе электронов около 20 мА. Магнитное поле в вигглере составляло 1.9 Тл. Эти параметры позволили обеспечить высокий поток рентгеновских фотонов с энергией более 40 кэВ.
Эксперимент выполнен по методу внешних стандартов. Важным критерием для подбора стандартного образца было соответствие матриц стандартного и исследуемого образцов. Так, для исследования элементного состава фрагментов опухолей мышей использовали международный стандартный образец тканей устрицы ‒ NIST® SRM® 1556b (National Institute of Standards and Technology, США). Для количественного определения содержания йода в исследуемых образцах их облучали монохроматическим пучком с энергией возбуждения 38 кэВ, время экспозиции каждого образца составляло 600 с.
Статистический анализ данных
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета прикладных программ GraphPad Prism 8.0.1 и Microsoft Excel 2019. Для сравнения групп в экспериментах in vitro использовали t-критерий Стьюдента. Различия между средними значениями объема опухоли у животных из разных групп оценивали непараметрическим критерием Манна‒Уитни (U-test). Данные РФА-СИ представлены средними значениями ± стандартное отклонение (SD). Во всех случаях критический уровень значимости (р) принимали равным 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Создание рекомбинантного штамма VV-mNIS-dGF
Способность онколитических вирусов находить опухолевые клетки и селективно реплицироваться в них, а также возможность встраивания в геном вирусов трансгенов репортерных белков можно использовать для визуализации и определения размеров опухолевой массы, а также для обнаружения метастазов [2, 3]. В качестве репортерного белка мы использовали симпортер натрия/йодида (NIS).
NIS ‒ консервативный белок позвоночных с высокой межвидовой гомологией [22]. Для встраивания в геном онколитического вируса нами была выбрана последовательность мышиного гена NIS (mNIS), соответствующая GenBank AF235001. Выбор обусловлен тем, что mNIS более эффективно катализирует транспорт йодида в трансфицированные клетки, чем NIS человека. Предполагают, что это обусловлено их различной локализацией: mNIS преимущественно обнаруживают на плазматической мембране, а его человеческий ортолог внутри экспрессирующих клеток (примерно в 40%) [23].
В качестве вируса-реципиента для встраивания трансгена mNIS в район tk-гена был использован ранее сконструированный штамм VVdGF2/6 ‒ вариант штамма L-IVP с делецией гена vgf [11]. Рекомбинантный штамм VV-mNIS-dGF с инсерцией mNIS получен в результате двойного кроссинговера по гомологичным участкам плазмидной ДНК pXJP-P7.5synth-mNIS и ДНК штамма-реципиента VVdGF2/6 соответственно и последующей селекции рекомбинантов в клетках H143TK‒ с добавлением в культуральную среду 5-бромдезоксиуридина. Схематичное изображение структуры рекомбинаного штамма VV-mNIS-dGF представлено на рис. 1a. Наличие в геноме рекомбинанта вставки трансгена mNIS подтверждено методом ПЦР со специфической парой праймеров: TK-flank1 sense и TK-flank2 as ‒ а делеции гена vgf ‒ с праймерами Up35 и Apa-L22. Как видно из рис. 1b, геном сконструированного вируса содержит вставку трансгена mNIS расчетной длины (2298 п.н.) и несет делецию гена vgf, которая уменьшает размер амплифицированного фрагмента до 449 п.н. ‒ в отличие от исходного штамма L-IVP, с ДНК которого амплифицируется фрагмент размером 583 п.н. Определена полная нуклеотидная последовательность генома рекомбинантного варианта VV-mNIS-dGF: длина составляет 188 292 п.н., трансген mNIS встроен по позициям 81 265–83 178 п.н. Рекомбинантный штамм VV-mNIS-dGF депонирован в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ “Вектор” Роспотребнадзора под номером V-1205.
Рис. 1.
Структура рекомбинантного штамма VV-mNIS-dGF. a ‒ Схематичное изображение структуры генома рекомбинантного варианта VV-mNIS-dGF с указанием позиций праймеров. b ‒ ПЦР-анализ ДНК VV-mNIS-dGF с использованием пары праймеров TK-flank1 sense и TK-flank2 as (дорожки 1‒3) или Up35 и ApaL22 (4‒6). Дорожки 1 и 4 ‒ VV-mNIS-dGF; дорожки 2 и 5 – L-IVP; дорожки 3 и 6 – вода; М ‒ маркер длин ДНК (ООО “СибЭнзайм”, Россия). Fig. 1. Structure of recombinant VV-mNIS-dGF strain. a – Schematic representation of the recombinant virus genome with primer positions indicated. b – PCR analysis of recombinant VACV DNA using following primer pairs: TK-flank1 sense/TK-flank2 as (tracks 1‒3) and Up35/ApaL22 (4‒6). Tracks 1 and 4, VV-mNIS-dGF; 2 and 5, L-IVP; 3 and 6, water; M, DNA ladder (SibEnzyme LLC, Russia).
Экспрессия mNIS в клетках B16-F10, инфицированных VV-mNIS-dGF
Na+/I‒ симпортер мыши и крысы состоит из 618 а.о. и несет три сайта N-гликозилирования, расположенных во внемембранных сегментах в позициях Asn225, Asn485 и Asn497. В результате этой посттрансляционной модификации образуется зрелый белок, который мигрирует в SDS-PAGE с кажущейся молекулярной массой 80‒90 кДа. В нескольких исследованиях показано, что этот белок встречается в димерных и олигомерных формах, что характерно для многих мембранных белков [24, 25].
Экспрессия трансгена mNIS в составе VV-mNIS-dGF подтверждена методом иммуноблотинга с антителами, специфичными к С-концевому цитоплазматическому домену белка mNIS. Как видно из результатов, представленных на рис. 2a, в лизатах клеток B16-F10, инфицированных VV-mNIS-dGF, детектируется белок с молекулярной массой более 200 кДа, взаимодействующий с антителами к mNIS. Из этого можно сделать вывод, что сконструированный рекомбинантный штамм экспрессируют белок mNIS, причем в димерной или олигомерной форме, устойчивой к действию детергента (SDS), что согласуется с результатами исследования E. Darrouzet и др. [26].
Рис. 2.
Анализ экспрессии mNIS. а ‒ Анализ экспрессии mNIS в клетках B16-F10 методом иммуноблотинга. На дорожки 12%-ного SDS-PAAG были нанесены лизаты клеток, зараженных VV-mNIS-dGF (1), VVdGF2/6 (2), а также лизат контрольных клеток (3) и маркер молекулярной массы белков (M; Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder; Thermo Fisher Scientific, США). Разделенные белки переносили на PVDF-мембрану и детектировали целевой продукт, как описано в разделе “Условия эксперимента”. b ‒ Оценка методом ПЦР в реальном времени экспрессии мРНК mNIS в культурах клеток B16-F10 и CT-26, инфицированных штаммом VV-mNIS-dGF с MOI 0.1, 1.0 и 10.0 БОЕ/клетка. Статистические различия между контрольной (К) и экспериментальными группами были значимыми (p < 0.01 для MOI 10.0 БОЕ/клетка; p < 0.05 для MOI 0.1 и 1.0 БОЕ/клетка). Fig. 2. Analysis of mNIS expression. a – Western blot analysis of mNIS expression in B16-F10 cells. Lysates of cells infected with VV-mNIS-dGF (1), VVdGF2/6 (2), as well as control cells (3), and a protein molecular weight marker (M; Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder; Thermo Fisher Scientific, USA) were loaded onto 12% SDS-PAAG. The separated proteins were transferred to a PVDF membrane, and the target product was detected as described in the “Experimental”. b – RT-qPCR eva-luation of mNIS mRNA expression in B16-F10 and CT-26 cells infected with VV-mNIS-dGF strain with MOI of 0.1, 1.0 and 10.0 PFU/cell. Statistical differences between control (K) and experimental groups were significant (p < 0.01 for MOI 10.0 PFU/cell; p < 0.05 for MOI 0.1 and 1.0 PFU/cell).
Экспрессия трансгена mNIS в инфицированных рекомбинантом VV-mNIS-dGF клетках опухолей мышей, B16-F10 и CT-26, также подтверждена по уровням мРНК mNIS, определенным методом ПЦР в реальном времени. Как видно из данных, представленных на рис. 2b, уровни мРНК mNIS коррелировали с множественностью заражения клеток рекомбинантным штаммом VV-mNIS-dGF. В неинфицированных клетках обнаружен только низкий фоновый уровень экспрессии мРНК mNIS, который был принят за условную единицу. В клетках B16-F10 содержание мРНК mNIS было в 15‒20 раз выше, чем в клетках CT-26, из чего можно сделать вывод о повышенной чувствительности клеток меланомы к рекомбинантому штамму VV-mNIS-dGF по сравнению с клетками карциномы толстой кишки.
Онколитическая активность штамма VV-mNIS-dGF in vitro и in vivo
На рис. 3a представлены результаты определения цитотоксической активности рекомбинантного штамма VV-mNIS-dGF в отношении клеток B16-F10 и CT-26. Для клеток B16-F10 значение ЦТД50 штамма VV-mNIS-dGF составляло 0.05 БОЕ/клетка, а для CT-26 – 0.8 БОЕ/клетка, то есть клетки меланомы в 16 раз чувствительнее к заражению этим вирусом, чем клетки карциномы толстой кишки.
Рис. 3.
Онколитическая активность штамма VV-mNIS-dGF in vitro и in vivo. а ‒ Цитотоксическая активность штамма VV-mNIS-dGF в отношении опухолевых клеток B16-F10 и CT-26 in vitro. b ‒ Анализ объема опухолей в динамике. Мышам с подкожными аллотрансплантатами меланомы (В16-Н10) или карциномы толстой кишки (СТ-26) в опухоль вводили препарат VV-mNIS-dGF в дозе 1.0 × 107 БОЕ/мышь (двукратно, с интервалом 3 суток). Животным контрольной группы вместо вируса вводили физраствор. Различия между опытными (лечеными) группами и контрольными были значимыми (р < 0.05). Fig. 3. In vitro and in vivo oncolytic activity of the VV-mNIS-dGF strain. a – Cytotoxicity of VV-mNIS-dGF strain for B16-F10 and CT-26 cancer cells in vitro. b – Analysis of tumor volume in dynamics. Mice with subcutaneous allografts of melanoma (B16-H10) or colon carcinoma (CT-26) were injected with VV-mNIS-dGF into the tumor at a dose of 1.0 × 107 PFU/mouse (twice, 3 days apart). Animals of the control groups were injected with saline instead of the virus. Differences between experimental (treated) and control groups were significant (p < 0.05).
Для оценки противоопухолевой активности штамма VV-mNIS-dGF in vivo использовали две сингенных модели: “меланома В16-F10 – мыши линии С57BL/6” и “карцинома СТ-26 – мыши линии BALB/c”. Как видно из рис. 3b, штамм VV-mNIS-dGF значимо ингибировал рост этих двух типов опухолей относительно соответствующего отрицательного контроля. Индекс ТРО в случае меланомы B16-F10 составил 44.9%, а в случае карциномы СТ-26 – 47.3%.
Накопление йодида в инфицированных VV-mNIS-dGF опухолевых клетках in vitro и in vivo
Измерение количества ионов йода, захваченных клетками, проводили спектрофотометрически в формате 96-луночного планшета с использованием реакции Санделла‒Колтоффа [20]. Реакция Санделла‒Колтоффа основана на колориметрической детекции концентрации ионов йода в результате реакции между четырехвалентным церием и трехвалентным мышьяком, катализируемой ионами йода в растворе серной кислоты:
Восстановление Ce4+ до Ce3+ под действием As3+ протекает очень медленно, но следы ионов йода сильно ускоряют эту реакцию, причем дозозависимым образом.
Результаты измерений представлены на рис. 4a, на котором видно, что количество ионов йода, поглощенных раковыми клетками B16-F10 и CT-26, инфицированными VV-mNIS-dGF, растет с увеличением дозы вируса. Различия в количестве йодида в зараженных клетках в сравнении с контрольными были значимыми при MOI 0.1 и 1.0 БОЕ/клетка. Так, клетки B16-F10 и CT-26, выращенные в 96-луночных планшетах, при множественности заражения 1.0 БОЕ/клетка в среднем поглощали I‒ в количестве 41 и 48 пмоль/лунка соответственно, что статистически значимо (p < 0.01) превышало этот показатель в неинфицированных клетках (~6 пмоль/лунка для обоих типов клеток).
Рис. 4.
Накопление йодида в инфицированных VV-mNIS-dGF опухолевых клетках in vitro и in vivo. а ‒ Поглощение ионов йода клетками B16-F10 и CT-26, зараженными VV-mNIS-dGF (MOI 0.01, 0.1, 1.0 БОЕ/клетка), и контрольными (К) в реакции Санделла–Колтоффа. Приведено содержание I‒ в лунке. b ‒ Количественное определение содержания йода в опухолевых клетках методом РФА-СИ. Клетки заражали VV-mNIS-dGF двукратно, с интервалом 3 суток, в дозе 1 × 107 БОЕ/опухоль. Fig. 4. Iodide accumulation in VV-mNIS-dGF-infected tumor cells in vitro and in vivo. a – Iodine ion uptake by B16-F10 and CT-26 cells infected with VV-mNIS-dGF (MOI 0.01, 0.1, 1.0 PFU/cell), and control cells (K) in the Sandell–Koltoff reaction. The content of I‒ per well is shown. b – Quantification of iodine content in tumor cells by X-ray Fluorescence Analysis with using Synchrotron Radiation (XRF-SR). Cells were infected with VV-mNIS-dGF twice, 3 days apart, at a dose of 1 × 107 PFU/tumor.
Полученные in vitro результаты подтверждены в экспериментах in vivo. Из аллотрансплантатов меланомы В16-F10 и карциномы толстой кишки СТ-26, обработанных и не обработанных VV-mNIS-dGF, готовили образцы (таблетки) для РФА-СИ. Массовая доля йода в образцах контрольных (нелеченых) опухолей составляла в среднем 0.48 мкг/г таблетки, в обработанных вирусом опухолях B16–F10 – в среднем 143 мкг/г, CT-26 – 28.3 мкг/г.
Таким образом, сконструированный нами рекомбинантный онколитический вирус VV-mNIS-dGF эффективно экспрессирует трансген mNIS и аккумулирует йодид в опухолевых клетках как в культуре, так и в аллотрансплантатах опухолей. В дальнейших экспериментах с использованием рекомбинантного штамма VV-mNIS-dGF и СИ мы планируем провести неинвазивную прижизненную визуализацию модельных опухолей как мыши, так и человека. Неинвазивная визуализация всего организма экспериментального животного в нескольких временных точках позволит оценить эффективность доставки вируса в целевые органы и ткани, а также контролировать и оценивать вирусемию и экспрессию терапевтических трансгенов на протяжении всего курса лечения. Известно, что, в отличие от широко применяемых в онкологии ядерных методов визуализации (ОФЭКТ/КТ, ПЭТ), для получения рентгеновского изображения с помощью СИ не требуется введения радионуклида в организм. Однако можно ввести рентгеноконтрастное соединение, содержащее йод (например, NaI), и визуализировать клетки, в которых происходит репликация рекомбинантного вируса, не нагружая организм при этом радиоактивными препаратами [4]. Еще один важный момент ‒ при использовании синхротронного излучения для рентгеноскопии требуется меньшие дозы контрастного вещества для получения качественного изображения, чем при обычной рентгеновской диагностике [9]. Высокий контраст и пространственное разрешение изображений, полученных с помощью синхротронной рентгеноскопии, обеспечит возможность отслеживания онколитической активности рекомбинантных штаммов вируса осповакцины, экспрессирующих трансген NIS, даже для небольших опухолей и метастазов на ранней стадии формирования.
Список литературы
Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Ткачева А.В., Горчаков А.А., Кулемзин С.В. Комбинированная терапия рака на основе онколитической виротерапии и таргетной CAR T/NK-клеточной иммунотерапии. Молекуляр. биология, 2020, 54(1), 3‒16. https://doi.org/10.31857/S0026898420010103
Haddad D., Fong Y. Molecular imaging of oncolytic viral therapy. Mol. Ther. Oncolytics, 2014, 1, 14007. https://doi.org/10.1038/mto.2014.7
Kirn D.H., Thorne S.H. Targeted and armed oncolytic poxviruses: a novel multi-mechanistic therapeutic class for cancer. Nat. Rev. Cancer., 2009, 9(1), 64–71. https://doi.org/10.1038/nrc2545
Semenova A.V., Sivolobova G.F., Grazhdantseva A.A., Agafonov A.P., Kochneva G.V. Reporter transgenes for monitoring the antitumor efficacy of recombinant oncolytic viruses. Acta Naturae, 2022, 14(3), 46–56. https://doi.org/10.32607/actanaturae.11719
Spitzweg C., Nelson P.J., Wagner E., Bartenstein P., Weber W.A., Schwaiger M., Morris J.C. The sodium iodide symporter (NIS): novel applications for radionuclide imaging and treatment. Endocr. Relat. Cancer, 2021, 28(10), T193–T213. https://doi.org/10.1530/ERC-21-0177
Brown S.L., Freytag S.O., Barton K.N., Flynn M.J., Peck D.J., Dragovic A.F., Jin R., Yeni Y.N., Fyhrie D.P., Les C.M., Zhu G., Kolozsvary A., Pitchford W.C., Nathanson S.D., Fenstermacher J.D., Kim J.H. Reporter gene imaging using radiographic contrast from nonradioactive iodide sequestered by the sodium-iodide symporter. Contrast Media Mol. Imaging, 2007, 2(5), 240–247. https://doi.org/10.1002/cmmi.150
Кондранова А.М., Гладышева А.А., Гладышева А.В., Агафонов А.П. Использование синхротронного излучения в вирусологии. Здоровье населения и среда обитания, 2022, 30(12), 81‒88. https://doi.org/10.35627/2219-5238/2022-30-12-81-88
Pełka J.B. Synchrotron radiation in biology and medicine. Acta Phys. Pol. A, 2008, 114(2), 309–329. https://doi.org/10.12693/APhysPolA.114.309
Morgan K.S., Parsons D., Cmielewski P., McCarron A., Gradl R., Farrow N., Siu K., Takeuchi A., Suzuki Y., Uesugi K., Uesugi M., Yagi N., Hall C., Klein M., Maksimenko A., Stevenson A., Hausermann D., Dierolf M., Pfeiffer F., Donnelley M. Methods for dynamic synchrotron X-ray respiratory imaging in live animals. J. Synchrotron Radiat., 2020, 27(1), 164‒175. https://doi.org/10.1107/S1600577519014863
Thorne S.H., Hwang T.H.H., O’Gorman W.E., Bartlett D.L., Sei S., Kanji F., Brown C., Werier J., Cho J.H., Lee D.E., Wang Y., Bell J., Kirn D.H. Rational strain selection and engineering creates a broad-spectrum, systemically effective oncolytic poxvirus, JX-963. J. Clin. Invest., 2007, 117(11), 3350–3358. https://doi.org/10.1172/JCI32727
Кочнева Г.В., Бабкина И.Н., Лупан Т.А., Гражданцева А.А., Юдин П.В., Сиволобова Г.Ф., Швалов А.Н., Попов Е.Г., Бабкин И.В., Нетесов С.В., Чумаков П.М. Апоптин усиливает онколитическую активность вируса коровьей оспы in vitro. Молекуляр. биология, 2013, 47(5), 733–742. https://doi.org/10.1134/S0026893313050075
Zonov E., Kochneva G., Yunusova A., Grazhdantseva A., Richter V., Ryabchikova E. Features of the antitumor effect of vaccinia virus Lister strain. Viruses, 2016, 8(1), 20. https://doi.org/10.3390/v8010020
Shvalov A.N., Sivolobova G.F., Kuligina E.V., Kochneva G.V. Complete genome sequence of vaccinia virus strain L-IVP. Genome Announc., 2016, 4(3), e00372-16. https://doi.org/10.1128/genomeA.00372-16
Yakubitskiy S.N., Kolosova I.V., Maksyutov R.A., Shchelkunov S.N. Attenuation of vaccinia virus. Acta Naturae, 2015, 7(4), 113–121. https://doi.org/10.32607/20758251-2015-7-4-113-121
McCart J.A., Bartlett D.L., Moss B. A combined growth factor-deleted and thymidine kinase-deleted vaccinia virus vector. Patent EP1180157B1, Publ. 2012.11.28. https://www.patentguru.com/EP1180157B1
Koval O., Kochneva G., Tkachenko A., Troitskaya O., Sivolobova G., Grazhdantseva A., Nushtaeva A., Kuligina E., Richter V. Recombinant vaccinia viruses coding transgenes of apoptosis-inducing proteins enhance apoptosis but not immunogenicity of infected tumor cells. Biomed. Res. Int., 2017, 2017, 3620510. https://doi.org/10.1155/2017/3620510
Merchlinsky M., Eckert D., Smith E., Zauderer M. Construction and characterization of vaccinia direct ligation vectors. Virology, 1997, 238(2), 444–451. https://doi.org/10.1006/viro.1997.8828
Grazhdantseva A.A., Sivolobova G.F., Tkacheva A.V., Gileva I.P., Kuligina E.V., Rikhter V.A., Kochneva G.V. Highly effective production of biologically active, secreted, human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor by recombinant vaccinia virus. Appl. Biochem. Microbiol., 2016, 52(7), 685-691. https://doi.org/10.1134/S0003683816070036
Schmittgen T.D., Livak K.J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nat. Protoc., 2008, 3(6), 1101–1108. https://doi.org/10.1038/nprot.2008.73
Dong H., Atlas E., Wade M.G. Development of a non-radioactive screening assay to detect chemicals disrupting the human sodium iodide symporter activity. Toxicol. In Vitro, 2019, 57, 39–47. https://doi.org/10.1016/j.tiv.2019.01.021
Легкодымов А.А., Купер К.Э., Колмогоров Ю.П., Баранов Г.Н. Станция РФА-СИ на накопительном кольце ВЭПП-4М. Известия Российской академии наук. Серия физическая, 2019, 83(2), 158–162. https://doi.org/10.1134/S0367676519020194
Concilio S.C., Russell S.J., Peng K.-W. A brief review of reporter gene imaging in oncolytic virotherapy and gene therapy. Mol. Ther. Oncolytics, 2021, 21, 98–109. https://doi.org/10.1016/j.omto.2021.03.006
Dayem M., Basquin C., Navarro V., Carrier P., Marsault R., Chang P., Huc S., Darrouzet E., Lindenthal S., Pourcher T. Comparison of expressed human and mouse sodium/iodide symporters reveals differences in transport properties and subcellular localization. J. Endocrinol., 2008, 197(1), 95–109. https://doi.org/10.1677/JOE-07-0455
Huc-Brandt S., Marcellin D., Graslin F., Averseng O., Bellanger L., Hivin P., Quemeneur E., Basquin C., Navarro V., Pourcher T., Darrouzet E. Characterisation of the purified human sodium/iodide symporter reveals that the protein is mainly present in a dimeric form and permits the detailed study of a native C-terminal fragment. Biochim. Biophys. Acta, 2011, 1808(1), 65–77. https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2010.08.013
Hingorani M., Spitzweg C., Vassaux G., Newbold K., Melcher A., Pandha H., Vile R., Harrington K. The bio-logy of the sodium iodide symporter and its potential for targeted gene delivery. Curr. Cancer Drug Targets, 2010, 10(2), 242–267. https://doi.org/10.2174/156800910791054194
Darrouzet E., Lindenthal S., Marcellin D., Pellequer J.L., Pourcher T. The sodium/iodide symporter: state of the art of its molecular characterization. Biochim. Biophys. Acta, 2014, 1838(1 Pt. B), 244–253. https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2013.08.013
Дополнительные материалы отсутствуют.
Пн.-пт.: 10.00-19.00