Биология внутренних вод, 2019, № 1, стр. 73-78

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время большинство водоемов подвержено антропогенному загрязнению. Тяжелые металлы (ТМ) и их соединения относятся к числу наиболее опасных загрязнителей пресных вод. Они аккумулируются в тканях гидробионтов и не подвергаются химической биодеградации как органические соединения. ТМ могут присутствовать в водной среде в коллоидной (органической или неорганической), взвешенной и растворимой (или ионной) форме. Наибольшей биологической активностью, как правило, обладают ионные формы металлов либо их липофильные комплексы [3]. Содержание ТМ в гидробионтах часто в десятки и сотни раз превышает таковое в воде [8]. Значительное количество ТМ накапливается в грунтах [12], которые могут быть вторичным источником загрязнения. Cd, Pb, Cu и Zn − одни из самых опасных в экотоксикологическом отношении элементов. При этом Cu и Zn − необходимые микроэлементы, в то время как Pb и Cd таковыми не являются. Попадая в организм рыб вместе с водой и пищей [14], они могут оказывать прямое и опосредованное влияние на морфологические и функциональные характеристики пищеварительного тракта [17].

Углеводы, несмотря на относительно низкое содержание в естественной пище большинства видов рыб, играют важную роль в энергетическом и пластическом обмене организма. Об эффективности начальных этапов переваривания углеводов можно судить по активности гликозидаз − ферментов, осуществляющих гидролиз ди- и полисахаридов в пищеварительном тракте. Влияние ТМ на активность пищеварительных гликозидаз рыб показано как в экспериментах in vivo [4, 17, 19, 20, 24, 25], так и in vitro [1, 5, 17]. Установлено, что чувствительность гликозидаз к действию Cu, Zn и Cd может меняться при действии разных факторов [17], в том числе и магнитного поля [16].

Исходя из того, что геомагнитное поле (ГМП) служит важным экологическим фактором, можно предположить, что при длительном пребывании в условиях ослабления ГМП возможно неблагоприятное воздействие на организм. Работы по влиянию ГМУ на животных свидетельствуют о биологической эффективности этого фактора. В частности, выявлено действие ГМУ на клеточные структуры разных органов и тканей [6, 22], на процессы развития и регенерации [9, 23]. В ряде работ описана высокая чувствительность эмбрионов некоторых видов животных к данному фактору [2, 7, 15, 21].

Поскольку закладка пищеварительной системы у рыб происходит в эмбриональном периоде, а ее формирование завершается к концу личиночного периода, представляет интерес оценка действия ГМУ на стадии свободного эмбриона (предличинки). Сведения об отдаленных последствиях влияния ГМУ в период раннего онтогенеза на активность пищеварительных гликозидаз и их чувствительность к действию ТМ отсутствуют.

Цель работы – изучить активность гликозидаз и их чувствительность к действию ионов ТМ (Cu²⁺, Zn²⁺, Cu²⁺ + Zn²⁺, Pb²⁺, Cd²⁺, Pb²⁺ + Cd²⁺) у сеголетков плотвы Rutilus rutilus (L.), подвергавшихся действию ГМУ на разных стадиях эмбриогенеза.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспозиции в ГМУ подвергали развивающиеся эмбрионы плотвы. Половые продукты были получены от трех самок и трех самцов, выловленных неводом на нерестилище Рыбинского водохранилища в мае 2014 г. Осемененную сухим способом икру (~3 тыс. шт. в каждом варианте опыта) помещали в кристаллизаторы с речной водой, которую меняли дважды в сутки. Эмбрионы развивались при температуре 16–19°С. Опыты проводили во время спокойной геомагнитной обстановки.

Схема эксперимента включала два варианта воздействия ГМУ: 1) от оплодотворения до вылупления предличинок (0–163 ч после оплодотворения (п.о.)), 2) от вылупления предличинок до появления у них плавательного пузыря (163–211 ч п.о.). Эмбрионы и предличинки из контрольного варианта находились в условиях естественного ГМП (интенсивность 51.7 мкТл, наклонение 72°05′). Для создания ГМУ использовали три пары взаимно ортогональных колец Гельмгольца (диаметр 0.5 м) и три источника постоянного тока (АКИП-1103, Manson Engineering Industrial Ltd., Китай). Перед каждым экспериментом с помощью трехкомпонентного магнитометра НВ0302А (НПО ЭНТ, Санкт-Петербург) определяли напряженность и направление вектора ГМП в месте проведения экспериментов. После этого систему колец Гельмгольца размещали таким образом, чтобы оси системы совпали с направлением трех компонент ГМП. Для создания ГМУ на обмотку каждой пары колец Гельмгольца подавали ток такой силы, чтобы генерируемое магнитное поле было равным по силе и противоположно направленным вектору ГМП по каждой компоненте. При этом генерируемое в центре системы колец Гельмгольца постоянное магнитное поле в значительной степени компенсировало ГМП за счет суперпозиции. Непосредственно перед экспериментом и после него ГМУ в центре системы колец Гельмгольца контролировали с помощью магнитометра НВ0302А (НПО ЭНТ). По результатам измерений неоднородность ГМУ в рабочем объеме колец Гельмгольца, занимаемом кристаллизатором с развивающимися эмбрионами, была 0 ± ± 200 нТл.

Отдаленные последствия влияния ГМУ на активность гликозидаз и их чувствительность к действию ТМ оценивали у четырехмесячной молоди плотвы. Для биохимического анализа использовали по 30 экз. сеголетков из контрольной и экспериментальных групп. У рыб, обездвиженных ударом по голове, вскрывали брюшную полость, извлекали кишечники, помещали их на стекло ледяной бани и освобождали от химуса. Затем при помощи стеклянного гомогенизатора готовили суммарные гомогенаты медиального отдела кишечника от 6 экз. рыб каждой экспериментальной группы (которые считали за одну повторность) с добавлением охлажденного до 2−4°С раствора Рингера для холоднокровных животных (NaCl – 110 мМ, KCl – 1.9 мМ, CaCl₂ –1.3 мМ, рН 7.4) в соотношении 1 : 9. Его же использовали для растворов субстратов (растворимый картофельный крахмал в концентрации 18 г/л, а также мальтоза в концентрации 50 ммоль/л). Инкубацию гомогената и субстрата проводили в течение 20−30 мин при температуре 20°С, рН 7.4 и непрерывном перемешивании. При изучении влияния ТМ гомогенаты предварительно инкубировали в присутствии солей меди CuSO₄ ⋅ 5H₂O, цинка ZnSO₄ ⋅ 7H₂O, свинца Pb(NO₃)₂ или кадмия CdSO₄ в течение 1 ч, или их смесей в соотношении 1 : 1. Концентрация ионов Cu²⁺, Zn²⁺, Pb²⁺ и Cd²⁺, рассчитанная по общему содержанию металла в соли, была равна 25.0 мг/л. Такая концентрация металлов может встречаться в тканях рыб и объектов их питания [8].

Амилолитическую активность, отражающую суммарную активность ферментов, гидролизующих крахмал (α-амилазы КФ 3.2.1.1, глюкоамилазы КФ 3.2.1.3 и мальтазы КФ 3.2.1.20), оценивали по приросту гексоз модифицированным методом Нельсона [10]. Для определения активности мальтазы глюкозооксидазным методом применяли набор для клинической биохимии “Фотоглюкоза” (“Импакт”, Россия). Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре Lambda 25 (Perkin&Elmer, США) при длине волны 670 нм (амилолитическая активность) и 505 нм (активность мальтазы). Активность ферментов определяли в пяти повторностях с учетом фона (количества конечных продуктов реакции в исходном гомогенате) и выражали в микромолях продуктов реакции, образующихся за 1 мин инкубации в расчете на 1 г влажной массы ткани (мкмоль/(г · мин)).

Результаты представлены в виде средних значений и их ошибок (M ± m). Нормальность распределения исследуемых показателей проверяли с помощью теста Шапиро–Уилка. При сравнении результатов проводили однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующей оценкой достоверности различий при помощи LSD-теста, p ≤ 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Длина (8.10 ± 0.06 см) и масса (9.41 ± 0.17 г) сеголетков, подвергавшихся действию ГМУ на стадии эмбрионов, выше соответственно на 17 и 50%, чем у рыб, развивавшихся в условиях ГМП (6.90 ± 0.11 см и 6.29 ± 0.27 г). У рыб, подвергавшихся действию ГМУ на стадии предличинки, длина (5.39 ± 0.06 см) и масса (2.69 ± 0.08 г) тела, напротив, на 22 и 57% ниже, чем у особей, развитие которых проходило в ГМП.

Активность гликозидаз в отсутствие ионов металлов у рыб, развивавшихся в ГМП и подвергнутых действию ГМУ на стадии эмбриона, не различалась, однако, после воздействия ГМУ на стадии предличинки амилолитическая активность была ниже контроля на 18%, активность мальтазы − на 13% (табл. 1 и 2).

Чувствительность ферментов, гидролизующих крахмал, к действию ионов Cu²⁺, Zn²⁺, Pb²⁺ и Cd²⁺ у сеголетков плотвы, как правило, увеличивалась при действии ГМУ как на стадии эмбриона, так и предличинки (табл. 1). Исключение составляли варианты опыта с ионами Zn²⁺ и Pb²⁺ после действия ГМУ на эмбрионы. Так, амилолитическая активность в присутствии ионов Cu²⁺ была ниже таковой в отсутствие металла соответственно на 93 и 95% после действия ГМУ на стадии эмбриона и предличинки (у рыб, развивавшихся в условиях ГМП, ниже на 84%). Ионы Zn²⁺ вызывали меньшее снижение амилолитической активности (до 56%), чем ионы Cu²⁺, а их совместное действие не оказывало кумулятивного эффекта. Торможение амилолитической активности в присутствии ионов Pb²⁺ составило 15 и 27% от таковой в отсутствие металла, ионов Cd²⁺ – 23 и 25% соответственно у рыб, развивавшихся в ГМУ на стадии эмбриона и предличинки. Совместное действие Pb²⁺ и Cd²⁺ не превышало суммы эффекта отдельных ионов.

Чувствительность мальтазы к действию ионов Zn²⁺ и Pb²⁺ усиливалось при действии ГМУ на стадии эмбриона и предличинки, ионов Cd²⁺ и Pb²⁺ + Cd²⁺ – лишь на стадии эмбриона (табл. 2). При действии ГМУ на эмбрионы активность мальтазы снижалась в присутствии ионов Zn²⁺ на 17%, ионов Cu²⁺ + Zn²⁺ на 13%, ионов Pb²⁺ на 20%, ионов Cd²⁺ на 30%, ионов Pb²⁺ + Cd²⁺ на 16% от таковой в отсутствие металла. В присутствии ионов Cu²⁺ активность мальтазы не изменялась ни в одном из вариантов опыта.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Ранее установлено, что пребывание в ГМУ приводит к нарушению ряда морфологических и физиолого-биохимических показателей организма [2, 6, 13, 15, 21, 22]. Выявлено, что ГМУ негативно влияют на эмбриональные клетки и на процессы раннего эмбриогенеза у млекопитающих [2, 7, 15] и земноводных [13, 21] в целом.

При действии ГМУ на эмбрионы в период от оплодотворения до вылупления предличинок (0–163 ч п.о.) не зарегистрированы изменения активности пищеварительных гликозидаз. Однако, пребывание в ГМУ на стадии предличинки (163–211 ч п.о.) приводит к снижению амилолитической активности и активности мальтазы в кишечнике сеголетков. Возможно, это связано с влиянием ГМУ на развитие гепатопанкреаса и щеточной каймы клеток кишечного эпителия во время формирования необходимого набора ферментов для переваривания углеводов к концу стадии предличинки.

Экспозиция эмбрионов плотвы в ГМУ, как правило, повышает чувствительность гликозидаз в кишечнике молоди к действию ионов Cu²⁺, Zn²⁺, Pb²⁺ и Cd²⁺. Чувствительность ферментов, гидролизующих крахмал, к действию ионов указанных металлов, и мальтазы к действию Zn²⁺ и Pb²⁺ усиливается после действия ГМУ как на эмбрионы, так и на предличинки. Чувствительность мальтазы к ионам Cd²⁺ и комбинации ионов Pb²⁺ и Cd²⁺ была выше лишь после воздействия ГМУ на эмбрионы.

Установлено, что чувствительность кишечных гликозидаз к действию ТМ может меняться при действии ряда биотических и абиотических факторов [16, 17]. Устойчивость гликозидаз к действию ионов Cd²⁺ повышается с возрастом рыб и при переходе от сытого состояния к голодному.

Резкое повышение температуры воды, ацидификация водоема и хроническое действие метилртути повышают чувствительность гликозидаз к действию ионов Cd²⁺ [16]. Изменение локального магнитного поля на величину 500 нТл в период до гаструляции (в течение первых шести часов п.о.) повышает чувствительность мальтазы и ферментов, гидролизующих крахмал, у сеголетков плотвы к действию ионов Cu²⁺, Zn²⁺, Cu²⁺ + Zn²⁺ (25 мг/л) [11]. Действие имитации магнитной бури, воспроизведенной в диапазоне частот 0−5 Гц в период 48−72 ч п.о., не меняло амилолитическую активность и активность мальтазы в кишечнике сеголетков плотвы, но повышало чувствительность гликозидаз к действию ионов Cu²⁺ (исключая мальтазу) и Zn²⁺ в концентрации 0.1−25 мг/л [17]. Большая чувствительность ферментов, гидролизующих крахмал, к действию ионов Cu²⁺ и Zn²⁺ по сравнению с мальтазой, выявленная авторами и в работе [16], согласуется с данными о большей чувствительности к действию антропогенных факторов панкреатических ферментов по сравнению с собственно мембранными [16]. Это может быть связано с разным влиянием факторов среды на процессы синтеза панкреатических (α-амилаза) и собственно кишечных ферментов. Поскольку существует несколько изоформ α-амилазы, глюкоамилазы и мальтазы, нельзя исключить и молекулярную разнокачественность гликозидаз, функционирующих в кишечнике сеголетков плотвы контрольной и опытных групп.

Эффект совместного действия ионов Cu²⁺ и Zn²⁺, а также Pb²⁺ и Cd²⁺ на активность гликозидаз в кишечнике сеголетков плотвы после действия ГМУ в период эмбриогенеза не превышал суммы эффектов отдельных металлов или даже эффекта одного из металлов, что согласуется с ранее полученными данными [17]. Усиление совместного действия ионов Cu²⁺ и Zn²⁺ в концентрации 25 мг/л на амилолитическую активность и активность мальтазы показано лишь у сеголетков, развивавшихся в условиях ГМП. Токсичность смеси металлов зависит от синергизма и антагонизма входящих в ее состав ионов. Синергический тормозящий эффект Cd²⁺ и Zn²⁺ (в концентрации 0.06 + + 0.06 мг/л) in vivo был выявлен при изучении амилазной активности у индийского карпа Cirrhinus mrigala Bloch [24]. На примере мозамбикской тиляпии Oreochromis mosambicus Peters показано, что сочетание Cu²⁺ и Zn²⁺, а также Cd²⁺ и Cu²⁺ более токсично вследствие синергического эффекта этих металлов [18]. Полагают, что взаимовлияние ионов ТМ на токсичность связано со способностью конкурентно занимать определенные сайты в биологически значимых макромолекулах, приводя к изменению их функционирование. При этом токсичность определяется ионами, обладающими наибольшим сродством. Механизм токсического действия Cu, Zn, Pb и Cd на пищеварительные ферменты до сих пор не изучен, и, по-видимому, неспецифичен. Общее токсическое действие ТМ заключается в блокировании различных биохимических реакций посредством связывания функциональных –SH-групп белков или вытеснения микроэлементов из активных центров ферментов [16]. Торможение активности кишечных гликозидаз в присутствии ионов Cu²⁺, Zn²⁺, Pb²⁺ и Cd²⁺ может приводить к снижению утилизации пищи, уменьшая скорость метаболизма и, как следствие, скорость роста рыб.

Выводы. Активность гликозидаз в кишечнике сеголетков плотвы и чувствительность этих ферментов к действию ионов ТМ зависит от магнитных условий, в которых проходило эмбриональное развитие рыб. Снижение активности пищеварительных гликозидаз отмечено после воздействия ГМУ на стадии предличинки, но не на стадии эмбриона. Усиление чувствительности ферментов, гидролизующих крахмал, к действию исследованных металлов выявлено после экспозиции эмбрионов в ГМУ как на стадии эмбриона, так и предличинки. Торможение активности гликозидаз при действии ГМУ в период раннего эмбриогенеза, сопровождающееся усилением негативного действия ТМ, снижает скорость начальных этапов ассимиляции углеводов в кишечнике рыб, приводя к уменьшению эффективность усвоения пищи.

Работа выполнена и в рамках государственного задания № АААА-А18-118012690102-9.