Ботанический журнал, 2020, T. 105, № 3, стр. 300-309

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Цветки и бутоны на разных стадиях развития были собраны на территории Ботанического сада Петра Великого Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН, где этот вид произрастает в качестве интродуцента. Постоянные препараты готовили по общепринятой методике (Prozina, 1960). Материал фиксировали в ФАА, после проводки через серию спирто-хлороформовых смесей различной концентрации заливали в парафин, блоки резали на микротоме Microm 325 (фирмы Carl Zeiss). Срезы 12 мкм окрашивали гематоксилином по Эрлиху, с подкраской алциановым синим и сафранином. Препараты исследовали на микроскопе Axioplan-2 mot (Zeiss), с использованием камеры AxioCam MRc 5 (Zeiss) и программы AxioVision 4.8 (Zeiss).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Platycodon grandiflorus представляет собой травянистое многолетнее прямостоячее растение. Цветок обычно одиночный, верхушечный, в некоторых случаях их может быть от двух до десяти. Цветки собраны в верхушечное соцветие (табл. I , a, b, d), до 25 см длиной; цветоножки прямые. Соцветие, согласно классификации Федорова и Артюшенко (1979) – кистевидный тирс (дихазий) (табл. I , d), венчик широковоронковидный (ширококолокольчатый), синего цвета, пятилопастный (табл. I , а). Тычинок пять. Они свободные, нити треугольно расширены у основания (табл. I , c); пыльники 6.7–7.0 мм длиной. Столбик у основания утолщенный, завязь пятигнездная. Плод – прямая, яйцевидная, вверх торчащая коробочка. Семена эллиптические или яйцевидные, уплощенные, черные или темно-коричневые, блестящие, гладкие (Fedorov, 1957; Kozhevnikov, 1996; Olonova, 1996).

Таблица. I. Строение соцветия и цветка у Platycodon grandiflorus.

а – цветок, b – соцветие, с – тычинки, d – продольный срез соцветия, e – тека, состоящая из двух микроспорангиев, f – поперечный срез пыльника, g – пыльник на ранней стадии развития. 1 – связник, 2 – микроспорангий, 3 – первичная покровная ткань, 4 – пыльцевые зерна в полости пыльника, 5 – cпорогенная ткань. Масштабные линейки, мкм: b – 1000; d, f – 200; e – 100; g – 50.

Plate I . Inflorescence and flower structure in Platycodon grandiflorus.

a – flower, b – inflorescence, c – stamens, d – longitudinal section of inflorescence, e – theca composed of two microsporangia, f – transverse section of anther, g – anther at the early stage of development. 1 – connective, 2 – microsporangium, 3 – primary covering tissue, 4 – pollen grains in the anther, 5 – sporogenous tissue. Scale bars, μm: b – 1000; d, f – 200; e – 100; g – 50.

Пыльник у P. grandiflorus состоит из четырех микроспорангиев, расположенных симметрично и объединенных в две теки (табл. I , e). Связник сравнительно массивный, с плацентоидами – выростами стерильной ткани, вдающимися в каждое гнездо и обусловливающими дуговидную форму спорогенной ткани (табл. I , f).

Важное значение для формирования тетрад гаплоидных микроспор и пыльцевых зерен имеет стенка микроспорангия, в ходе развития которой происходят изменения в строении. Выделены три стадии ее формирования (Shamrov, 2015). Первая стадия – возникновение и дифференциация слоев стенки микроспорангия (от археспория до спорогенной ткани). Вторая стадия – окончательное формирование стенки микроспорангия, которая состоит из следующих слоев: эпидермы, эндотеция, среднего слоя и тапетума. Микроспороциты готовятся вступать в мейоз. Третья стадия – преобразование слоев стенки микроспорангия, формирование тетрад микроспор и созревание пыльцевых зерен (Shamrov et al., 2019).

На ранних стадиях премейотического периода развития пыльника из археспория – группы клеток субэпидермального слоя лопасти пыльника – формируются спорогенная ткань и слои стенки микроспорангия. Клетки археспория отличаются более плотной цитоплазмой и крупным ядром с ядрышком. В меристематическом бугорке выделяется тяж археспориальных клеток (табл. I , g; II, а, b), которые после ряда периклинальных делений образуют первичный париетальный и спорогенный слои (табл. II, d). Клетки первичного париетального слоя делятся также периклинально, в результате чего формируются вторичные париетальные слои.

Таблица II. Формирование стенки пыльника у Platycodon grandiflorus.

a – поперечный срез бутона на ранней стадии развития, b – меристематический бугорок с археспориальными клетками, c – формирование слоев стенки пыльника на раннем этапе развития, d – формирование вторичного париетального слоя, e – формирование вторичного париетального слоя и тапетума. 6 – тяж археспориальных клеток, 7 – эпидерма, 8 – вторичный париетальный слой, 9 – наружный тапетум, 10 – спорогенная ткань, 11 – внутренний тапетум, 12 – клетки меристемы плацентоида, 13 – клетки первичного париетального слоя периклинально делятся, 14 – первичный и вторичный париетальные слои. Масштабные линейки, мкм: a – 200; b – 10; c, d, e – 20.

Plate II . Anther wall formation in Platycodon grandiflorus.

a – transverse section of the flower bud at the early development stage, b – meristematic primordium with archesporial cells, c – formation of the anther wall layers at the early development stage, d – formation of the secondary parietal layer, e – formation of the secondary parietal layer and tapetum. 6 – archesporial cells, 7 – epidermis, 8 – secondary parietal layer; 9 – outer tapetum, 10 – sporogenous tissue, 11 – inner tapetum, 12 – meristematic cells of placentoid, 13 – the primary parietal cells divide periclinally, 14 – primary and secondary parietal layers. Scale bars, μm: a – 200; b – 10; c, d, e – 20.

Клетки тапетума, вероятно, происходят из вторичного париетального слоя. Они имеют таблитчатую форму, расположены в ряд и отличаются крупными размерами, большими ядрами и сильной вакуолизацией. Эти клетки непрерывно делятся, их цитоплазма окрашивается сафранином более интенсивно по сравнению с окружающими клетками. Тапетум у P. grandiflorus – однослойный, окружает спорогенную ткань как с дистальной стороны, так и со стороны плацентоида. Часть тапетума, прилегающую к париетальному слою, мы условно называем “наружным” тапетумом, а ту, что прилегает к меристеме плацентоида, “внутренним”. Спорогенные клетки, окруженные с дистальной и проксимальной сторон пыльника тапетумом, также интенсивно делятся (табл. II, с). В клетках тапетума хорошо различимы два ядра, также встречаются клетки с четырьмя ядрами. Это свидетельствует об интенсивном метаболизме в тапетальных клетках, так как они снабжают питательными веществами клетки спорогенной ткани и способствуют, таким образом, их преобразованию в микроспороциты.

Клетки наружного париетального слоя делятся периклинально, в результате чего формируются средний слой и эндотеций (табл. III, а). Клетки эндотеция незначительно отличаются от соседних клеток. Клетки эпидермы вытянуты вдоль поверхности микроспорангия. По мере формирования стенки пыльника они постепенно увеличиваются в размерах, немного сплющиваются и становятся более крупными по сравнению с клетками эндотеция и среднего слоя. Клетки тапетума продолжают делиться антиклинально, местами тапетум становится иррегулярно-двуслойным (табл. II, e). Наружная часть тапетума формируется раньше, чем внутренняя. Ко времени вступления микроспороцитов в мейоз формирование всех слоев завершено (табл. II, e). Клетки среднего слоя существуют непродолжительное время, во время мейоза микроспороцитов они начинают разрушаться и к началу постмейотического периода полностью дегенерируют. В мейотический период клетки эпидермы, эндотеция и среднего слоя сильно вакуолизированы. В постмейотический период в стенке пыльника клетки эпидермы, покрытые тонким слоем кутикулы, лишаются своего содержимого (табл. III, d). Клетки эндотеция в постмейотический период увеличиваются в размерах. Со стадии двухклеточных пыльцевых зерен в них образуются фиброзные утолщения, которые, как правило, расположены перпендикулярно эпидермальному слою. Также были отмечены фиброзные утолщения в некоторых клетках плацентоидов (табл. III, d). У P. grandiflorus фиброзные утолщения окружают каждое гнездо пыльника. Фиброзные пояски отсутствуют на некоторых участках в местах будущего вскрывания гнезд. К моменту вскрывания пыльника ткань плацентоида сжимается и разрушается (Zhinkina, 1995).

Таблица III. Строение стенки гнезда пыльника и пыльцевого зерна у Platycodon grandiflorus.

а – формирование среднего слоя и эндотеция, b – фрагмент стенки пыльника на стадии мейоза, с – стадия образования тетрад, d – гнездо пыльника с пыльцевыми зернами, е – пыльцевое зерно с генеративной клеткой линзовидной формы (временный препарат с окраской ацетокармином), f – генеративная клетка вблизи ядра вегетативной в центре пыльцевого зерна, g – генеративная клетка перемещается к периферии пыльцевого зерна, h – шипики и борозды на поверхности зрелых пыльцевых зерен, i – зрелые пыльцевые зерна, j – аномальное пыльцевое зерно. 15 – средний слой, 16 – эндотеций, 17 – микроспороциты, вступившие в мейоз, 18 – 2-ядерный тапетум, 19 – тетрады, 20 – клетки тапетума с признаками деградации, 21 – ткань связника, 22 – клетки стенки пыльника с фиброзными утолщениями. Масштабные линейки, мкм: a, b, f–i – 10; c–e – 20.

Plate III . Structure of anther wall and pollen grain in Platycodon grandiflorus.

a – formation of the middle layer and endothecium, b – fragment of anther wall at the meiosis, c – phase of tetrad formation, d – anther loculus with pollen grains, e – lenticular generative cell of in the pollen grain (temporary slide stained by acetocarmine), f – generative cell close to the nucleus of vegetative cell in the center of pollen grain, g – generative cell moves to the periphery of pollen grain, h – spinules and sulculi on the surface of mature pollen grains, i – mature pollen grains, j – anomalous pollen grain. 15 – middle layer, 16 – endothecium, 17 – microsporocytes in meiosis, 18 – tapetum cells with two nuclei, 19 – tetrads, 20 – degenerating tapetal cells, 21 – connective tissue, 22 – cells of anther wall with fibrous thickenings. Scale bars, μm: a, b, f–i – 10; c–e – 20.

Таблица IV. Нормальные и аномальные пыльцевые зерна у Platycodon grandiflorus.

а – нормально сформированные многочисленные пыльцевые зерна в зрелом пыльнике, b – дегенерирующая аномальная пыльца и гипертрофированные клетки тапетума. 23 – зрелые пыльцевые зерна, 24 – тапетум, 25 – аномальные пыльцевые зерна. Масштабные линейки, мкм: a, b – 20.

Plate IV . Normal and abnormal pollen grains in Platycodon grandiflorus.

a – normal and abnormal pollen grains in mature anther, b – abnormal degenerating pollen grains, hypertrophied cells of tapetum. 23 – mature pollen grains, 24 – tapetum, 25 – abnormal pollen grains. Scale bars, μm: a, b – 20.

Тапетум секреторного типа, однослойный, гетероморфный. На ранних стадиях развития его клетки относительно мелкие, правильной формы, на протяжении мейотического периода они разрастаются, значительно увеличиваются в размерах и вытягиваются. В них происходят деления ядер, и тапетальные клетки становятся дву- и четырехъядерными (табл. III, b). Тапетум существует относительно долго. Первые признаки деградации отмечаются после стадии тетрад (табл. III, c). Клетки тапетума деформируются. Они сильно вакуолизированы, причем вакуоли в них достаточно крупные, ядра начинают дегенерировать. В постмейотический период тапетальные клетки уплощаются, сильно деформируются, их ядра окончательно дегенерируют. К моменту созревания пыльцевых зерен тапетум практически полностью исчезает (табл. III, d).

У Platycodon клетки спорогенной ткани располагаются в один или несколько рядов (табл. II, c; III, b). Ее формирование завершается одновременно со стенкой гнезда пыльника. Клетки спорогенной ткани заметно крупнее окружающих клеток, и их цитоплазма более плотная. После завершения митозов спорогенные клетки увеличиваются в размерах и преобразуются в микроспороциты – клетки, которые вступают в мейоз, в результате чего из каждой клетки с диплоидным набором хромосом образуются четыре гаплоидные клетки, образующие особую структуру – тетраду микроспор. Тетрады покрыты каллозной оболочкой и располагаются в гнезде пыльника вплотную к тапетуму. Объединенные в тетрады микроспоры, располагавшиеся в один слой в тесном контакте с тапетумом, в дальнейшем размещаются рыхло в увеличившемся пространстве гнезда пыльника (табл. III, с). Микроспорогенез в пыльнике проходит асинхронно. Тетрады микроспор тетраэдральные. После распада тетрад в каждой микроспоре происходит деление, в результате чего она преобразуется в пыльцевое зерно. У Platycodon оно двухклеточное. Ядро вегетативной клетки находится вблизи генеративной клетки. Впоследствии оно заметно увеличивается в объеме, его форма становится лопастной. Генеративная клетка первоначально прилегает к оболочке пыльцевого зерна и имеет линзовидную форму (табл. III, e). В дальнейшем она отходит от оболочки пыльцевого зерна и перемещается в направлении ядра вегетативной клетки, при этом ее форма становится округлой (табл. III, f). Некоторое время генеративная клетка располагается в непосредственной близости от ядра вегетативной клетки, а затем постепенно отходит от него (табл. III, g). Цитоплазма зрелого пыльцевого зерна плотная, заполнена запасными питательными веществами в виде липидных глобул, а также крахмала и белков, необходимых для роста пыльцевой трубки. Пыльцевые зерна по результатам световой микроскопии сфероидальные, на поверхности наблюдаются крупные борозды (табл. III, h, i; IV, a). Скульптура поверхности пыльцевого зерна шиповатая, шипы конические, расположены по поверхности достаточно равномерно, их высота немного превышает толщину экзины (табл. III, h).

В ряде случаев у Platycodon нами была отмечена массовая дегенерация и гибель пыльцы, при этом пыльцевые зерна часто деградировали на поздних стадиях. В таких случаях наблюдалось отклонение от нормального развития стенки гнезда пыльника. Если при нормальном ходе развития на стадии формирования пыльцевых зерен тапетальные клетки деформированы, их ядра окончательно дегенерировали, а к моменту созревания пыльцевых зерен тапетум практически полностью исчезал, то в случаях с абортивной пыльцой тапетальные клетки приобретали вытянутую форму и значительно увеличивались в размерах. Ядра тапетальных клеток сохранялись. Клетки среднего слоя и эндотеция также были деформированы. Фиброзные утолщения не образовывались. Сами пыльцевые зерна имели неправильную форму, их оболочка утолщалась, цитоплазма сжималась, кое-где сохранялись ядра, вероятно, вегетативных клеток (табл. III, j; IV, b). В случаях, когда пыльцевые зерна погибали на более поздних стадиях, иногда на поверхности таких дегенерирующих пыльцевых зерен могли образовываться поры. Такое явление, как массовая гибель пыльцы, отмечалось, как правило, в бутонах, расположенных на боковых осях соцветия, но и в пыльниках некоторых цветков, завершающих главную ось соцветия, также встречалась аномальная пыльца, и ее количество в некоторых образцах было примерно равно количеству нормальных пыльцевых зерен. Подобный факт описан у Chrysanthemum morifolium (Asteraceae) (Fei et al., 2016). У одного культивара со вскрывающимися пыльниками эндотеций с фиброзными утолщениями, а у другого культивара пыльники не вскрываются, так как в эндотеции не формируются фиброзные утолщения. Кроме того, у последнего долго сохраняются жизнеспособными клетки тапетума. Как было показано при изучении форм растений с ЦМС, при длительном существовании тапетума наблюдается абортирование пыльцы, клетки эндотеция не переходят к формированию фиброзных поясков, и пыльники не вскрываются (Chauhan, Gupta, 2006).

ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительный анализ признаков мужских эмбриональных структур Platycodon grandiflorus и других видов сем. Campanulaceae выявил их сходство. Однако имеются и различия. Развитие мужских репродуктивных структур наиболее подробно было изучено у следующих представителей: Ostrowskia magnifica (Zhinkina, 1995; Kamelina, Zhinkina, 1989), Azorina vidalii, Gadellia lactiflora (Zhinkina, Shamrov, 1997).

У всех исследованных видов пыльники интрорзные, четырехгнездные, гнезда попарно объединены в две теки. Перегородки между гнездами у некоторых видов разрушаются, но у Platycodon grandiflorus и Ostrowskia magnifica сохраняются. У Ostrowskia и Platycodon в пыльнике развиваются специфические структуры – плацентоиды, при этом формирующаяся спорогенная ткань и тапетум на поперечном срезе имеют подковообразную форму (Zhinkina, 1995, Kamelina, Zhinkina, 1989). У представителей сем. Campanulaceae формирование стенки гнезда пыльника проходит в премейотический период развития пыльника. В меристематическом бугорке под эпидермой выделяется тяж археспориальных клеток, которые после ряда периклинальных делений образуют париетальный и спорогенный слои. За счет делений клеток внутреннего париетального слоя образуется сначала тапетум с наружной стороны. У Platycodon grandiflorus одновременно с этим, за счет непрерывно делящихся клеток меристемы плацентоида, примыкающих к спорогенному слою, дифференцируется внутренняя часть тапетума. При периклинальном делении клеток наружного париетального слоя формируются средний слой и эндотеций. Сходным образом происходит формирование этих слоев пыльника и у Ostrowskia magnifica (Zhinkina, 1995, Kamelina, Zhinkina, 1989). Таким образом, формирование стенки гнезда пыльника у этих видов происходит по типу двудольных, согласно классификации Davis (1966).

Сформированная стенка пыльника состоит из эпидермы, эндотеция, среднего слоя и тапетума. Клетки эпидермы на ранних стадиях небольшие, по мере формирования стенки гнезда пыльника они постепенно разрастаются. Их оболочки заметно утолщаются. Со стадии двуклеточного пыльцевого зерна клетки эпидермы теряют правильную форму и сплющиваются. В стенке зрелого пыльника эпидерма представлена вытянутыми клетками. Сходным образом этот слой выглядит у O. magnifica (Zhinkina, 1995, Kamelina, Zhinkina, 1989). У Azorina vidalii и Gadellia lactiflora наружная стенка клеток эпидермы значительно кутинизирована и имеет зубчатую форму (Zhinkina, Shamrov, 1997). В эндотеции со стадии двуклеточных пыльцевых зерен образуются фиброзные утолщения. В зрелом пыльнике присутствует один или два слоя крупных клеток с фиброзными утолщениями, которые также формируются в двух-трех слоях плацентоида, примыкающих к гнезду. Подобный факт отмечен у O. magnifica (Kamelina, Zhinkina, 1989). Клетки среднего слоя постепенно уплощаются и в начале постмейотического периода полностью дегенерируют. Тапетум – клеточный (секреторный), однослойный. Его клетки вначале некрупные, правильной формы, затем разрастаются. Со стороны плацентоида клетки тапетума вытянутые. У O. magnifica эти клетки со стороны плацентоида имеют папиллообразную форму (Kamelina, Zhinkina, 1989). У P. grandiflorus клетки тапетума сильно вытягиваются и в них образуются крупные вакуоли. Как правило, клетки тапетума содержат 2–4 ядра. К моменту образования двуклеточного пыльцевого зерна тапетум почти полностью дегенерирует. У O. magnifica тапетум гетерогенный, незначительно гетероморфный, однослойный, представлен многоядерными клетками (Kamelina, Zhinkina, 1989). У Campanula ranunculoides он представлен двуядерными клетками, а у Azorina vidalii в клетках встречается 3 ядра (Zhinkina, 1995).

Спорогенная ткань является производным археспория. Ее формирование завершается одновременно с формированием гнезда пыльника. У Platycodon ее клетки располагаются в один или несколько рядов. У O. magnifica формируется однослойная, дуговидно изогнутая с утолщениями на концах многоклеточная спорогенная ткань, а у других исследованных видов клетки спорогенной ткани делятся и заполняют всю центральную часть пыльника (Zhinkina, 1995). Формирование тетрад микроспор у всех исследованных видов происходит по симультанному типу, тетрады микроспор тетраэдральные (Korobova, Zhinkina, 1987). У O. magnifica и P. grandiflorus тетрады микроспор распадаются довольно быстро (Zhinkina, 1995). Пыльцевые зерна этих двух видов характеризуются наличием борозд: у Platycodon их может быть четыре и более (Fedorov, Artyushenko, 1975). По данным Полевовой и Золала (Polevova, Zolala, 2008) у Platycodon grandiflorum пыльцевые зерна относительно крупные и в среднем имеют следующие размеры: полярная ось – 56 (52–61) мкм, экваториальный диаметр – 56 (53–63) мкм. Борозды короткие. Экзина толстая, 2.4 (1.8–3.0) мкм. Скульптура поверхности шипиковато-ямчатая, шипы достигают высоты 1.5 мкм. У представителей сем. Campanulaceae пыльцевые зерна могут быть поровыми, бороздными и бороздно-оровыми. Бороздные – в трибах Сodonopsideae и Platycodoneae, а также у Ostrowskieae, поровые – в трибе Campanuleae. Бороздные пыльцевые зерна также могут иметь 3 или большее количество апертур (Zolala et al., 2011).

ВЫВОДЫ

1. Развитие мужских эмбриональных структур у P. grandiflorum в целом такое же, как и у остальных представителей семейства Campanulaceae: наличие четырехгнездного пыльника, центробежное формирование стенки гнезда пыльника, клеточный секреторный тапетум с 2–4-ядерными клетками, симультанное образование тетрад микроспор, двуклеточные пыльцевые зерна.

2. Отличительными признаками, характерными для рода Platycodon, являются: отсутствие орбикул в тапетуме, двуслойный эндотеций, мощно развитые плацентоиды, массивный связник с многочисленными пучками, дуговидно расположенная спорогенная ткань, крупная генеративная клетка в пыльцевом зерне. Подобными признаками обладает и Ostrowskia magnifica, что позволяет сделать вывод о близости этих двух родов. Большинство этих отличительных признаков (наличие плацентоидов, массивного связника с сильно разветвленной проводящей системой и надсвязником) являются примитивными. Формирование и расположение фиброзных слоев в эндотеции пыльника можно рассматривать как черты специализации.

3. Отмеченная массовая гибель пыльцы на поздних стадиях развития, возможно, приводит к недоопылению и, как следствие этого, к низкой семенной продуктивности у P. grandiflorum. Однако для выяснения причин этого явления необходимы дополнительные исследования.