Ботанический журнал, 2020, T. 105, № 6, стр. 610-619

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал для формирования коллекции in vitro был получен в результате экспедиционных выездов и непосредственно сбора семян и растений в естественных местах обитания или из обменных фондов ботанических садов, играющих важную роль в поддержании, сохранении и пополнении коллекций.

Подготовку эксплантов и введение их в культуру in vitro проводили в стерильных условиях согласно методикам, принятым в лаборатории биотехнологии ГБС РАН (Butenko, 1999; Molkanova, 2009). В качестве исходного материала при введении в культуру in vitro были использованы семена или вегетативные части растений. При стерилизации семян и вегетативных частей использовали раствор фунгицида системного действия “Фундазол” в концентрации 2%, экспозиция составляла 30–60 мин и 15–30 мин соответственно. Далее семена и вегетативные части помещали в 70%-й этанол. Для семян экспозиция составляла 2 мин, для вегетативных частей – 0.5–1 мин. В качестве основного стерилизатора использовали 7%-й раствор гипохлорита кальция, экспозиция составляла 1–25 мин. В качестве детергента использовали TWEEN-20.

Рис. 1.

Таксономический состав коллекции in vitro редких и исчезающих видов растений в ГБС РАН.

Fig. 1. Taxonomic composition of in vitro collection of rare and endangered plant species in N.V. Tsitsin Main Botanical Garden of RAS.

На стадии микроразмножения использовали питательные среды: Murashige & Skoog, Anderso, Quorin & Lepoivre, Woody Plant Medium, Gamborg & Eleleig.

В качестве регуляторов роста в питательную среду добавляли: 6-бензиламинопурин (BAP) 0.2–12 мг/л, 2-изопентениладенин (2-ip) 1.0–5.0 мг/л и сочетание этих препаратов с 3-индолил-уксусной кислотой (IAA) 0.05 мг/л, альфа-нафтилуксусной кислотой (NAA) 0.1 мг/л и гиббереловой кислотой (GA) 0.1–1 мг/л.

Депонирование (до 24 месяцев) проводили на питательных средах MS и 1/2 MS, содержащих BA (0.1–1 мг/л) и сахарозу (20–60 г/л), при температуре 5–7°C и освещенности 500–1500 лк.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Генетический банк in vitro в ГБС РАН формировался с 1996 г. и в настоящее время является уникальным и наиболее представительным в России. Он содержит 1310 наименований. Особое внимание уделяется редким и исчезающим видам растений, коллекция которых насчитывает 82 вида, что составляет 17.3% от общего числа покрытосеменных растений Красной книги РФ. 54% коллекции in vitro редких и исчезающих видов растений составляют виды 1 и 2 категории редкости, 2 вида относятся к 0 категории. Большинство видов представлено образцами из разных популяций (Vetchinkina et al., 2012).

В ГБС РАН впервые разработаны методики клонального микроразмножения Gladiolus palustris Gaudin., имеющего статус 0 (Ex), Aristolochia manshuriensis Kom., Dioscorea caucasica Lipsky, Sanguisorba magnifica I. Schischk. et Kom., Euonymus nana Beib. – статус 1(E) (Krasnaya…, 2008).

В коллекции in vitro ГБС РАН редких и исчезающих растений России наиболее представлены следующие семейства: Liliaceae (10 видов), Iridaceae (8 видов), Amaryllidaceae (6 видов), Paeoniaceae (6 видов), Rosaceae (6 видов), Araliaceae (5 видов), Fabaceae (5 видов). Большинство видов (90.2% от общего числа) составляют травянистые растения.

Успех введения в культуру in vitro во многом зависит от выбора экспланта, эффективности стерилизации и подбора питательных сред. В ходе многочисленных исследований в лаборатории биотехнологии растений ГБС РАН были оптимизированы схемы стерилизации на этапе введения в культуру in vitro редких и исчезающих видов растений. В качестве основного стерилизатора использовали 7%-й раствор гипохлорита кальция. Семена помещались в раствор на 7–20 мин, вегетативные части – на 3–7 мин соответственно. Время экспозиции зависит от физиологической зрелости экспланта.

Нередко трудностью для получения стерильной культуры и дальнейшего успешного культивирования является побурение тканей первичных эксплантов и питательных сред за счет экссудации фенольных соединений. Среди изученных представителей родов Aralia, Dioscorea, Paeonia, Pulsatilla часто встречались виды растений, отличающиеся повышенным синтезом вторичных метаболитов, приводящим к снижению жизнеспособности или гибели растений-регенерантов. Целесообразно для снижения отрицательного воздействия полифенолов на развитие эксплантов на этапе собственно микроразмножения в качестве антиоксидантов добавлять в питательную среду аскорбиновую кислоту в концентрации 50–100 мг/л, глицин (4 мг/л), поливинилпирролидон (5000 мг/л), снижать освещенность до 500 лк и уменьшать период беспересадочного культивирования в 2 раза.

Помимо этого, рекомендуется добавлять в состав питательной среды активированный уголь в концентрации 100 мг/л, так как он способствует абсорбции продуктов метаболизма (Vetchinkina et al., 2012).

В экспериментальной работе с семенами многих редких видов возникает такая проблема, как покой семян. В большинстве случаев метод культивирования in vitro позволяет значительно сократить срок выведения семян из покоя и оптимизировать семенное размножение. Необходимо учитывать биологию семян (тип покоя, гетероспермия, жизнеспособность, сезонные колебания в ритмах прорастания и т. д.) и другие характеристики размножаемых видов (жизненная форма, преобладающий способ размножения, устойчивость в культуре и др.) (табл. 1).

В ходе исследований для ряда таксонов определены оптимальные режимы стратификации, позволяющие получать жизнеспособные проростки. Так, для проращивания семян Globularia punctata Lapeyr., Matthiola fragrans Bunge, Papaver bracteatum Lindl., Iris pumila L., Allium regelianum A. Beck. достаточно использование теплой стратификации (1–1.5 месяца при температуре 20–25°С). Сочетание теплой и холодной стратификации (1–1.5 месяца при 20–25°С и 3–4 месяца при 3–5°С) необходимо для Bellevalia sarmatica (Georgi) Woronow, Belamcanda chinensis (L.) DC., Dioscorea caucasica Lipsky. Наиболее сложные схемы стратификации необходимы для прорастания таких видов, как Tulipa tarda Stapf, Iris acutiloba C.A. Mey., Pulsatilla vernalis (L.) Mill. (1–1.5 месяца при температуре 20–25°С, 3–4 месяца при 3–5°С, 1–2 месяца при 20–25°С), а также видов рода Fritillaria L. (1–1.5 месяца при температуре 20‒25°С, 3–4 месяца при 3–5°С, 1– 2 месяца при 20–25°С, 3–4 месяца при 3–5 °С). Самым длительным периодом прорастания (около 30–40 суток) характеризуются семена Atropa bella-donna L., Pulsatilla vernalis, Hyssopus cretaceus Dubjan.

Использование семян при клональном микроразмножении имеет ряд особенностей. Например, семена Iris pumila и Belamcanda chinensis требуют культивирования на среде с добавлением 1 мг/л гиббереловой кислоты(GA). Кроме того, использовали несколько способов предобработки семян: замачивание в растворе GA в концентрации 1 и 10 мг/л в течение суток, холодная стратификация в течение 1 и 3 месяцев. В то же время семена видов рода Fritillaria культивируют на безгормональной питательной среде и питательных средах с добавлением 1 мг/л BA и 1 мг/л GA в течение 2-этапной стратификации: 5–7 недель при температуре 20–22°С, 2–9–12 недель при температуре 3–5°С. Использование культуры изолированных зародышей позволяет частично или полностью снять необходимость стратификации и соответственно сократить период прорастания семян (Vetchinkina, 2010).

Растения, относящиеся к разным таксонам, различаются уровнем тотипотентности клеток и регенерационным потенциалом. Это обусловливает необходимость дифференцированного подхода к разработке методик клонального микроразмножения для различных таксонов. При выборе стратегии сохранения in vitro каждого вида необходимо учитывать его биологические особенности. Поскольку основной целью при длительном депонировании является сохранение гермоплазмы и поддержание ее в стабильном состоянии были выбраны методы микроразмножения, минимизирующие риск сомаклональных вариаций (Molkanova et al., 2018). К числу таких технологий относится, прежде всего, метод активации уже существующих меристем, который считается надежным в плане генетической стабильности полученных регенерантов (Butenko, 1999; Rani, 2000; Molkanova et al., 2016).

Для каждой жизненной формы характерна, в частности своя активность верхушечной меристемы в онтогенезе и сроки перехода растения от вегетативного состояния к репродуктивному (Rostovceva, 1963). Для успешной регенерации меристем большинства исследованных таксонов необходимо наличие изолированного апекса с 2–3 листовыми примордиями.

Следующий этап после успешной инициации культур in vitro – это индукция побегообразования и собственно размножение. Успех применения любого метода определяется изучением условий, необходимых для его реализации. Это является важным для культуры изолированных органов, тканей и клеток, которые очень чувствительны к малейшим изменениям внешних условий. Для определения оптимальных условий культивирования и управления морфогенезом того или иного объекта in vitro, необходимо оценить морфогенетический потенциал культивируемых тканей и определить факторы, влияющие на эффективность регенерации.

Основные факторы, определяющие процесс органогенеза: эпигенетические характеристики клеток экспланта, физиологическое состояние интактных растений, сроки изоляции экспланта, состав питательной среды и условия культивирования (Molkanova, 2009).

Тканевая принадлежность эксплантов, использованных для получения культуры тканей различных видов в значительной степени определяют морфогенетический потенциал формирующихся регенерантов. Экспланты из разных органов одного вида существенно различались по способности к регенерации в условиях in vitro. Результаты сравнительного анализа морфологических процессов у Aristolochia manshuriensis in vitro показали, что при использовании апикальной меристемы почек развитие de novo зачатков аксиллярных побегов, а впоследствии и растений-регенерантов, происходило более интенсивно по сравнению с использованием апикальной меристемы из проростков (Molkanova, Egorova, 2017).

Экспланты, взятые с молодых растений A. manshuriensis (не старше 4–6 лет), характеризовались более высокой способностью к образованию побегов по сравнению с растениями, достигшими 12 лет. С увеличением возраста интактного растения A. manshuriensis жизнеспособность и органогенный потенциал меристемных комплексов in vitro резко падает, что согласуется с данными, полученными для представителей семейств Oleaceae, Rosaceae, Actinidiaceae (Molkanova, 2018).

Известно, что одним из существенных факторов, влияющих на поддержание устойчивой пролиферирующей культуры, является состав питательной среды.

Для оптимизации стадии размножения используют различные питательные среды, подбирают комбинации и концентрации регуляторов роста. В ходе исследований для модельных видов редких и исчезающих растений установлены оптимальные тип и концентрации фитогормонов, а также длительность беспересадочного выращивания (табл. 2).

Темпы развития эксплантов при культивировании разных видов существенно различаются. Выявлено, что регенерационная способность даже в пределах одного рода в культуре in vitro обусловлена видовыми особенностями и носит индивидуальный характер. Например, процесс выращивания из семян до взрослых особей длительный и занимает от 2–3 лет (например, Lilium regale) до 6–8 (например, L. martagon), в культуре in vitro этот период для L. martagon сокращается до 6 месяцев (Mamaeva, 2008).

Одним из эффективных способов сохранения генофонда растений является культивирование регенерантов в условиях замедленного роста. Хранение в условиях замедленного роста позволяет поддерживать биологический материал от нескольких месяцев до 2–3 лет без пересадки на питательную среду в зависимости от используемой технологии и вида растения (Cruz-Cruz et al., 2013). Замедление роста достигается за счет модификации сред или условий культивирования. Модификации сред включают снижение минеральной основы, содержания углеводов, изменение концентраций или подбор комбинаций регуляторов роста, добавление осмотически активных веществ, а также снижение температуры и интенсивности освещения (Molkanova et al., 2016). Сроки и специфика условий хранения растительного материала определяются биологическими особенностями таксонов. В процессе исследований показано, что совместное использование интенсивности освещения, состава питательной среды, концентрации осмотиков и ретардантов значительно увеличивало как беспересадочный период, так и жизнеспособность эксплантов в процессе хранения in vitro. Оптимальными условиями сохранения для большинства изученных редких и исчезающих видов являются: питательная среда, содержащая 1/2 MS, дополненая 0.3 мг/л BAP, пониженная температура (3–7°С) и слабая освещенность (500 лк) (Vetchinkina et al., 2012; Novikova, 2013).

Для растений разных жизненных форм на основе комплекса показателей определены оптимальные типы эксплантов для длительного сохранения в условиях in vitro. Для древесных и полудревесных растений – это фрагменты побегов, содержащие один-два метамера, для травянистых – почки возобновления. Для луковичных растений (представители семейств Alliaceae, Amarilidaceae, Hyacinthaceae, Liliaceae) – пазушные луковички или их сегменты.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные в настоящей статье материалы основаны на многолетнем опыте работы и направлены на то, чтобы раскрыть возможности биотехнологии в области сохранения редких и исчезающих видов растений.

Применение комплексного подхода к сохранению растений ex situ, когда редкие и исчезающие таксоны содержатся в дублирующих коллекциях (банках семян, живых коллекциях, банках культур in vitro), существенно повышает надежность сохранности генофонда. В ГБС РАН сформирована и сохраняется коллекция in vitro из 82 видов, что составляет 17.3% от общего числа покрытосеменных растений Красной книги РФ. 54% коллекции in vitro редких и исчезающих видов растений составляют виды 1 и 2 категории редкости, 2 вида относятся к 0 категории.

В каждом случае при выборе стратегии сохранения таксона in vitro необходимо учитывать его биологические особенности, оценивать возможности используемых подходов. При формировании коллекций in vitro необходимо обеспечивать представительность вида максимально возможным количеством образцов, происходящих из различных точек ареала.

Разработаны общие рекомендации на этапах введения в культуру in vitro исходного материала, собственно микроразмножения, укоренения и депонирования. При этом следует учитывать, что каждый вид имеет свои особенности при размножении in vitro. С учетом этих особенностей необходимо разрабатывать индивидуальные технологии клонального микроразмножения.

Биотехнологические методы позволяют с использованием небольшого количества исходного материала в короткие сроки получить большое число выровненного посадочного материала. Полученные растения можно использовать для пополнения живых коллекций, реинтродукции и усиления ослабленных природных популяций редких видов.

Особое внимание следует уделять выбору объектов для включения в состав коллекций in vitro. В первую очередь в национальном масштабе нужно выделить виды 1 и 2 категорий Красной книги Российской Федерации не обеспеченные мерами охраны in situ. Следует выделять также таксоны со сложными трофическими связями и характеризующиеся узкой экологической амплитудой.

Актуальной задачей является объединение существующих в РФ банков in vitro растений в единую сеть, работающую по единой программе. Это позволит избежать дублирования в работе и наладить обмен опытом и растительным материалом.