Ботанический журнал, 2020, T. 105, № 6, стр. 597-603

МОРФОМЕТРИЧЕСКИЙ И МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ ПОПУЛЯЦИИ CYPRIPEDIUM × VENTRICOSUM (ORCHIDACEAE) В НОВОСИБИРСКОЙ ОБЛАСТИ

А. Ю. Набиева 1*, Е. В. Жмудь 1, И. Н. Кубан 1, О. В. Дорогина 1

1 Центральный сибирский ботанический сад СО РАН
630090 Новосибирск, ул. Золотодолинская, 101, Россия

* E-mail: sibflower05@gmail.com

Поступила в редакцию 20.11.2019
После доработки 10.03.2020
Принята к публикации 17.03.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Проведено сравнительное исследование морфометрических параметров и молекулярно-генетических маркёров у совместно произрастающих в пределах одной и той же популяции видов рода Cypripedium (Orchidaceae) – C. calceolus и C. macranthon, а также их гибрида, в Новосибирской области. Выявлены ISSR-праймеры, позволяющие изучать генетический полиморфизм у видов рода Cypripedium из родства C. calceolus и C. macranthon. Подтверждено произрастание гибридов C. calceolus и C. macranthon в Искитимском районе Новосибирской области.

Ключевые слова: Cypripedium, гибридизация, микросателлитная ДНК, ISSR, Новосибирская область

Cypripedium calceolus L. и C. macranthon Sw. (Orchidaceae) – виды, редкие практически по всему ареалу на территории России, внесены в Красную книгу РФ со статусом 2а. Указывается, что они сокращаются в численности в результате изменения условий существования и разрушения местообитаний (Krasnaya…Rossiiskoi, 2008). Они также занесены практически во все Красные книги территорий, расположенных в Сибири и на Дальнем Востоке.

В области перекрывания ареалов C. calceolus и C. macranthon изредка встречается их гибрид – C. ventricosum. Согласно литературным данным, особи C. × ventricosum имеют морфологические признаки, промежуточные между родительскими видами (Averyanov, 1999; Knyazev et al., 2000; Filippov, Andronova, 2011; Andronova et al., 2016). Известно, что для гибрида характерен значительный полиморфизм по окраске и размерам цветков (Averyanov, 1999; Andronova et al., 2017). На территории Сибири и Дальнего Востока данный вид указан как редкий в Красных книгах Амурской и Еврейской автономной областей и Республики Саха (Якутия) (Krasnaya… Amurskoi…; Red… Jewish, 2006; Krasnaya… Respubliki Sakha, 2017).

Все виды башмачков очень декоративны, и в селитебных ландшафтах страдают от сбора в букеты и выкапывания куртин. На территории Новосибирской области у C. calceolus, C. macranthon и С. × ventricosum нами проведено сравнительное исследование морфометрических признаков, изучение кариотипов для определения числа хромосом и полиморфизма ДНК с использованием метода ISSR-маркирования. К преимуществам данного метода относится возможность обнаружения значительного количества полиморфных локусов, так как ISSR-маркеры обладают большой вариабельностью (Nybom, 2004), что и объясняет его широкое применение в популяционных и таксономических исследованиях. Согласно литературным данным, исследование ISSR полиморфизма используется у представителей рода для выявления внутривидовой генетической дифференциации (Qian et al., 2014; Opitz, 2016; Tian et al., 2018), но исследуемые нами таксоны, насколько нам известно, ранее в эти исследования не включались.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследуемая популяция находится в Искитимском районе, в окр. с Линёво, в пойме р. Койниха (Новосибирская область); абсолютная высота 190 м над уровнем моря, N 54°27'42''; E 83°20'42''. В 2019 г. нами проведены морфометрические исследования выборочно взятых генеративных побегов (по одному из каждого парцеллярного куста) у видов рода Cypripedium на занимаемой ценопопуляцией площади (более 1 тыс. кв. м). Обилие видов дано по шкале Друде (Shennikov, 1964).

Для исследования морфологических особенностей в данной ценопопуляции проведены измерения параметров у зрелых генеративных особей видов этого рода (n = 10). Изучали некоторые метрические показатели генеративной сферы, а также изменчивость ряда характеристик продуктивности особей в данном местообитании. Это размеры губы у цветков и второго сверху листа (длину и ширину). Также изучали изменчивость длины генеративного побега, числа цветков на побеге, побегов у особи (вегетативных и генеративных), и плодозавязывание (отношение завязавшихся плодов к общему числу сформированных, %), в том числе для выявления наличия признаков, возможно, подверженных гетерозису. В статье обсуждаются только статистически достоверно отличавшиеся значения признаков при уровне значимости не ниже 95% (Р = 95%). Достоверность отличий средних значений признаков оценивалась по непараметрическим критериям (Mann, Whitney, 1947).

Для подсчета числа хромосом изученных трех видов р. Cypripedium использовали кончики корней растений, которые были зафиксированы в смеси Карнуа без выкопки растений. Подсчет хромосом делящихся клеток на стадии метафазы проводили на временных давленых препаратах (Krasnikov, 2004).

Для изучения полиморфизма ISSR-маркеров ДНК выделяли из высушенных в лабораторных условиях листьев C. calceolus, C. macranthon, C. × ventricosum, собранных в фазе цветения у трех особей каждого вида. Экстракция ДНК проводилась на основе СТАБ с некоторыми модификациями (Doyle, Doyle, 1987). Для предварительного тестирования использовали 11 ISSR-праймеров, а после апробации были отобраны 4 наиболее информативных, которые характеризовались четким, воспроизводимым, полиморфным паттерном: 17898А, 17899A, HB-10, M-1 (табл. 1). ПЦР проводили на амплификаторе С – 1000 (Вio-Rad, USA) в объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала: 1.5 ед.Taq ДНК-полимеразы (Medigen, Russia); 2.7 мМ MgCI2; 0.8 мМ ISSR-праймер (Medigen, Russia); раствор ДНК – 2 мкл; вода mQ H2O – 2 мкл. Программа амплификации состояла из этапа денатурации ДНК в течение 90 сек при 94°С и 35 циклов, каждый из которых включал 40 сек при 94°С, 45 сек – отжиг праймера (табл. 1) и 90 сек при 72°С. Заключительный этап пролонгирования нуклеотидной цепи длился 5 мин при 72°С. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации проводили в 1.5% агарозном геле в 1x TAE буфере при напряжении 4 В/см. Для статистической обработки данных использовали пакет программ TREECON (Peer, Wachter, 1994). Каждый ISSR-маркер рассматривался как доминантный, и отмечалось его наличие (1) либо отсутствие (0), по результатам чего была построена бинарная матрица. Генетические дистанции рассчитывали по Нею (Nei, Li, 1979). Уровень полиморфизма (P, %) каждого праймера рассчитывали по формуле P = 100 * Np/N, где Np – число полиморфных фрагментов, N – общее число фрагментов.

Таблица 1.

Характеристика использованных в работе ISSR-праймеров Table 1. Characteristics of the ISSR primers used in the work

Нуклеотидная последовательность
Nucleotide sequence 5'-3'
Название праймера
Primer
Температура отжига
Temperature °С
Число амплифицированных (полиморфных) фрагментов
Total (polymorphic) fragments
Уровень полиморфизма, %
Polymorphism, %
(СА)6АС 17898А 42 23 (21) 91.3
(CA)6AG 17899A 47 15 (14) 93.3
(GA)6CC HB-10 44 12 (10) 83.3
(AC)8CG M-1 56 9 (8) 88.9

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В исследуемой ценопопуляции нами найдены 15 цветущих особей Cypripedium calceolus, 25 – C. macranthon, и 12 – C.× ventricosum (рис. 1а, 1б). Ценопопуляция находится в лесостепной зоне и приурочена к разреженному березовому лесу с участием подроста черемухи, калины и клена. Древостой состоит из Betula pendula Roth. (cop 1) и подроста Acer negundo L. (sp.) и Padus avium Mill. (sp.). Кустарниковый ярус представлен Viburnum opulus L. (sp.), Ribes rubrum L., Rosa rugosa Thunb. (sp.). Проективное покрытие травянистого яруса составляло 80–90%. В данном сообществе отмечены 19 видов травянистых многолетников, в том числе Cypripedium calceolus L. (sp), С. macranthon Sw. (cop 1), C. × ventricosum Sw. (sp), Dactylis glo-merata L. (cop 1), Equisetum pratense Ehrh. (cop1), Filipendula ulmaria (L.) Maxim. (sp), Galium boreale L. (sp), Trollius asiaticus L. (cop 1), Paris quadrifolia L. (sp), Sanguisorba officinalis L. (cop 1), Iris ruthenica Ker-Gawl. (sp), Veratrum lobelianum Bernh. (sp), Phlomis tuberosa (L.) Moench (sp), Pulmonaria mollissima Wulfen ex Hornem. (cop 1) и др.

Рис. 1.

Представители Cypripedium ventricosum в Новосибирской области (2019 г.): а – парциальный куст; б – цветки.

Fig. 1. Plants of Cypripedium ventricosum in the Novosibirsk Region (2019): а – partial bush; б – individual flowers.

Три изученных в данной ценопопуляции вида Cypripedium качественно отличались по характеру опушенности побегов, что является их общеизвестным отличительным признаком (Averyanov, 1999). Согласно морфометрическим исследованиям, средние размеры губы цветка у особей Сcalceolus были достоверно меньше, чем у представителей С. macranthon и C. × ventricosum (Р = 95%) (рис. 2а), а размеры второго сверху листа меньше у С. macranthon по сравнению с двумя другими изученными видами этого рода в данной ценопопуляции (Р = 95%) (рис. 2б). Длина побегов у особей С. calceolus и C. × ventricosum была больше, чем у С. macranthon (соответственно, 35.8 ± 1.9, 34.2 ± 1.6 и 24.5 ± 0.4 см). У большинства особей С. calceolus на каждом генеративном побеге было сформировано по 2 цветка (1.7 ± 0.2), а у С. macranthon – только один. У C. × ventricosum отмечено промежуточное значение этого признака (1.2 ± 0.1).

Рис. 2.

Варьирование морфологических признаков у видов рода Cypripedium в Новосибирской области: а – размеры (длина и ширина) губы, см; б – размеры (длина и ширина) второго листа, см. С.с. – Cypripedium calceolus; C.m. – C. macranthon; C.v. – C. ventricosum.

Fig. 2. Variation of morphological characters in Cypripedium species in the Novosibirsk Region: а – dimensions (length and width) of the lip, cm; б – dimensions (length and width) of the second leaf, cm. C.c. – Cypripedium calceolus; C.m. – C. macranthon; C.v. – C. ventricosum.

По сравнению с особями двух других изученных видов, представители C.× ventricosum отличались высокой потенциальной продуктивностью, которая выражалась в формировании крупных куртин с более высоким числом генеративных и вегетативных побегов. Так, у особей C. × ventricosum отмечено, в среднем, 21.2 ± 7.6 генеративных и 5.0 ± 1.2 вегетативных побегов, что достоверно выше, чем у С. calceolus и С. macranthon (7.2 ± 2.2, 0.9 ± 0.4 и 3.7 ± 0.8 и 2.2 ± 0.8, соответственно) (Р = 95%). То есть, для представителей C.×ventricosum (в данной популяции) характерно развитие крупных куртин, что ранее также выявлено при изучении C.× ventricosum на Среднем Урале. Можно согласиться с тем, что это явление может быть следствием эффекта гетерозиса (Knyazev et al., 2000).

В то же время C.× ventricosum имел, по нашим данным, более низкую плодопродуктивность: среднее число плодов у C.× ventricosum составило 25.2 ± 8.4, тогда как у С. calceolus и С. macranthon – соответственно 74.8 ± 5.6 и 82.6 ± 8.7. Возможной причиной этого может быть пониженная фертильность пыльцы, что было отмечено у C.× ventricosum при исследованиях причин низкой завязываемости плодов у данных гибридов на Среднем Урале (Knyazev et al., 2000).

Таким образом, выявленные достоверные различия C.× ventricosum с двумя другими видами Cypripedium, совместно произрастающими в данной популяции в Новосибирской области, заключаются в следующем: у представителей C.× ventricosum выявлено формирование мощных куртин с наиболее высоким числом генеративных побегов, вызванное, вероятно, эффектом гетерозиса, но при этом отмечена самая низкая завязываемость плодов в расчете на особь.

У C.× ventricosum формировалось промежуточное число цветков на генеративном побеге. Сходство особей C.× ventricosum с С. calceolus выражалось в формировании более длинных побегов и крупных размеров 2-го сверху листа (рис. 2а), а с С. macranthon – в более крупных размерах губы (рис. 2б) (P = 95%). Выявленное нами число хромосом 2n = 20 для С. macranthon и С. calceolus соответствует диплоидному числу хромосом, известному для данных видов из других регионов России и Китая (http://www.tropicosorg/project/IPCN; Stepanov, 1994; Averyanov, 1999), а также Европы и Британских островов (Kull, 1999). Известны случаи анеуплоидии у С. macranthon при исследовании флоры Японских островов – 2n = 21 (Karasawa, Aoyama, 1986) и Командорских островов – 2n = 22 (Volkova et al., 2003). Соматическое число хромосом C.× ventricosum соответствует диплоидному набору хромосом родительских видов 2n = 20. Такое же число хромосом для этого вида известно для растений из Приморского края (Probatova, Sokolovskaya, 2006).

Анализ молекулярно-генетических маркеров показал следующее. На четырех полученных электрофореграммах нами выявлено 59 фрагментов, 53 из которых были полиморфными. Число фрагментов, амплифицируемых одним праймером, варьировало от 9 (М-1) до 23 (17898А). Уровень полиморфизма при амплификации варьировал от 83.3% (HB-10) до 93.3% (17899A) (рис. 3). На электрофореграммах у гибридной особи № 1 присутствуют 3 компонента от С. calceolus; на спектре особи № 2 четко проявляются компоненты как от С. calceolus (3 компонента), так и от С. macranthon (2 компонента). На электрофореграмме гибридной особи № 3 присутствуют 3 компонента от С. calceolus и 3 – от С. macranthon. Таким образом, в каждом из трех изученных гибридов присутствуют компоненты от С. calceolus, а у двух из них четко видны компоненты от обоих родительских видов (рис. 3).

Рис. 3.

Электрофоретические спектры ДНК у видов рода Cypripedium в Новосибирской области (2019 г.). 1–3 – Cypripedium ventricosum; 4–6 – C. calceolus; 7–9 – C. macranthon.

Fig. 3. Electrophoretic spectra of DNA in Cypripedium species in the Novosibirsk Region (2019). 1–3 – Cypripedium ventricosum; 4–6 – C. calceolus; 7–9 – C. macranthon.

Анализ данных ISSR показал, что в изученной симпатрической популяции наименьшее генетическое сходство выявлено между тремя исследованными видами (табл. 2). Особи С. calceolus характеризовались наиболее высокой генетической однородностью, а C. × ventricosum – наиболее низкой, по сравнению с двумя другими видами (табл. 2). Полученные нами результаты по внутрипопуляционной изменчивости (71–97%) соответствуют данным других исследований, полученных при изучении популяций С. calceolus в Восточной Европе (Opitz, 2016) и С. japonicum в Восточной Азии (Qian et al., 2014; Tian et al., 2018) с использованием метода ISSR. Согласно этим литературным данным, у С. calceolus в Восточной Европе внутрипопуляционная генетическая дифференциация составляла 80.5%, что выше, чем в изученной нами популяции этого вида. Внутрипопуляционная генетическая изменчивость С. japonicum в трех районах Восточной Азии (Китай, Япония, Корея) имела значения генетической дивергенции, составившие 71‒89%, что сопоставимо с полученными нами данными для трех видов рода.

Таблица 2.

Взаимосвязь видов рода Cypripedium (Orchidaceae) на основе ISSR Table 2. The relationship of species of the genus Cypripedium (Orchidaceae) based on ISSR

Источник вариации
Source of variation
Df* Генетическое расстояние**
Genetic distance
P-value***
Между видами
Between species
2 0.569 <0.001
Внутри видов
Within species
С. сalceolus 2 0.03 <0.05
С. macranthon 2 0.225 <0.05
C. ventricosum 2 0.29 <0.05

Примечание. Статистические параметры: Df* – степени свободы; ** – генетическое расстояние (по Nei, Li, 1979); ***P-value – уровень достоверности отличий.

Note. Statistical parameters: Df* – degrees of freedom; ** – genetic distance (Nei, Li, 1979); ***P-value – level of significance of differences.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в исследованной симпатрической популяции в Новосибирской области нами подтверждено наличие гибрида С. × ventricosum. Число таких гибридных особей сопоставимо с числом особей у малочисленного C. calceolus. Наиболее многочисленны в данном местообитании представители C. macranthon, число особей которого сопоставимо с числом С. × ventricosum и C. calceolus, вместе взятых. По числу цветков на генеративном побеге гибрид занимает промежуточное положение, а размеры губы цветка сопоставимы с таковыми у C. macranthon. По размерам листовой пластинки С. × ventricosum имел сходство с C. calceolus. Зрелые генеративные особи C. × ventricosum формировали наиболее крупные куртины по сравнению с родительскими видами, что, вероятно, обусловлено эффектом гетерозиса и может способствовать укреплению его ценотической роли.

Анализ межмикросателлитных последовательностей ДНК (ISSR-маркеров) показал, что в исследованной популяции внутривидовая изменчивость была более низкой, чем межвидовая. Разработаны праймеры, позволяющие эффективно выявлять генетический полиморфизм у представителей рода Cypripedium.

Список литературы

  1. [Andronova et al.] Андронова Е.В., Мачс Э.М., Филиппов Е.Г. 2016. Генетический полиморфизм Cypripedium calceolus, C. macranthon, C. shanxiense, C.× ventricosum (Orchidaceae) по данным пиросеквенирования. – В сб.: Материалы XV Международной научно-практической конференции “Молекулярные методы в исследовании растений и хемосистематика таксонов”. Сб. науч. ст. по материалам XV Междунар. науч-практ. конф “Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии” (Барнаул, 23–26 мая 2016 г.). Барнаул. С. 95–100.

  2. [Andronova et al.] Андронова Е.В., Мачс Э.М., Филиппов Е.Г., Райко М.П., Янг-Ай Ли, Аверьянов Л.В. 2017. Филогеография таксонов рода Cypripedium (Orchidaceae) на территории России. – Бот. журн. 102(8): 1027–1059. https://doi.org/10.1134/S0006813617080014

  3. [Averyanov] Аверьянов Л.В. 1999. Род башмачок – Cypripedium (Orchidaceae) на территории России. – Turczaninovia. 2(2): 5–40.

  4. Doyle J.J., Doyle J.L. 1987. A rapid DNA isolation of fresh leaf tissue. – Phytochemistry Bull. 19: 11–15.

  5. [Filippov, Andronova] Филиппов Е.Г., Андронова Е.В. 2011. Генетическая дифференциация представителей рода Cypripedium России по данным изоферментного анализа. – Генетика. 47(5): 615–623.

  6. Karasawa K., Aoyama M. 1986. Karyomorphological studies on Cypripedium in Japan and Formosa. – Bull. Hiroshima Bot.Gard. 31: 1–22.

  7. [Knyazev et al.] Князев М.С., Куликов П.В., Князева О.И., Семериков В.Л. 2000. О межвидовой гибридизации (Orchidaceae) и таксономическом статусе C. ventricosum. – Бот. журн. 85(5): 94–102.

  8. [Krasnaya… Amurskoy…] Красная книга Амурской области https://cicon.ru/krasnaya-kniga-amurskoiobl.html (дата обращения: 11. 2019.)

  9. [Krasnaya… Respubliki Sakha] Красная книга Республики Саха (Якутия). 2017. Редкие и находящиеся под угрозой исчезновения виды растений и грибов. М. 412 с.

  10. [Krasnaya… Rossiiskoi…] Красная книга Российской Федерации (растения и грибы). 2008. М. 855 с.

  11. [Krasnikov] Красников А.А. 2004. Методика приготовления временных давленых препаратов для подсчета хромосом растений. – В сб.: Проблемы кариологии, кариосистематики и молекулярной систематики растений. Новосибирск. 10 с.

  12. Kull T. 1999. Cypripedium calceolus L. – J.Ecol. 87: 913–924.

  13. Mann H.B., Whitney D.R. 1947. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. – Ann. Math. Stat. P. 50–60.

  14. Nei M., Li W.H. 1979. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. – Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 76(10): 5269–5273.

  15. Nybom H. 2004. Comparison of different nuclear DNA markers for estimating intraspecific genetic diversity in plants. – Mol. Ecol. 13: 1143–1155.

  16. Opitz A. 2016. Populationsgenetische Untersuchungen an hessischen Populationen von Cypripedium calceolus L. Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) am Fachbereich 08: Biologie und Chemie der Justus-Liebig-Universität Gießen Institut für Botanik AG Spezielle Botanik vorgelegt von Diplom-Biologe. Wissemann eingereicht im November 2016. 115 p. http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2017/12491/pdf/OpitzAndreas_2017_02_14.pdf

  17. Peer V.Y., Wachter R.D. 1994. TREECON for Windows: A software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment. – Comput. Appl. Biosci. 10: 569–570.

  18. [Probatova, Sokolovskaya] Пробатова Н.C., Соколовская A.П. 2006. – В кн.: Флора российского Дальнего Востока. Дополнения и изменения к изданию “Сосудистые растения советского Дальнего Востока”. Т. 1–8 (1985–1996). Владивосток. С. 283.

  19. Qian X., Li Q.-J., Liu F., Gong M.-J., Wang C.-X., Tian M. 2014. Conservation Genetics of an Endangered Lady’s Slipper Orchid: Cypripedium japonicum in China. – Int J Mol Sci. 2014 Jul; 15(7): 11578–11596. Published online 2014 Jun 30. https://doi.org/10.3390/ijms150711578

  20. [Red… Jewish…] Красная книга Еврейской автономной области. Растения и грибы. 2006. Новосибирск. 247 с.

  21. [Shennikov] Шенников А.П. 1964. Введение в геоботанику. Изд-во ЛГУ. 446 с.

  22. [Stepanov] Степанов Н.В. 1994. Числа хромосом некоторых таксонов высших растений флоры Красноярского края. – Бот. журн.79(2): 135–139.

  23. Tian H.Z., Han L.X., Zhang J.L., Li X.L., Kawahara T., Yukawa T., López-Pujol J., Kumar P., Chung M.G., Chung M.Y. 2018. Genetic diversity in the endangered terrestrial orchid Cypripedium japonicum in East Asia: Insights into population history and implications for conservation. – Scientific Reports. 8 (6467). https://www.nature.com/articles/s41598-018-24912-z Accessed: 12-2019

  24. [Volkova et al.] Волкова С.А., Горовой П.Г., Ткаченко К.Г. 2003. Числа хромосом представителей некоторых семейств флоры Командорских островов. – Бот. журн. 88(8): 115–116.

Дополнительные материалы отсутствуют.