Физиология человека, 2019, T. 45, № 1, стр. 88-96

МЕТОДИКА

Сбор образцов плазмы крови. Образцы плазмы были собраны у 18 российских космонавтов (средний ± SD возраст: 44 ± 6 лет, все мужчины) в рамках программы “Протеом крови и мочи”. Все космонавты добровольно заполнили форму информированного согласия. Эксперимент был одобрен Комиссией по биомедицинской этике Института медико-биологических проблем РАН и международной многосторонней комиссией по экспертизе научных исследований с участием человека (Human Research Multilateral Review Board). Кровь отбирали из вены в локтевой ямке за 30 дней до старта (сокращенно L-30), через сутки после приземления (через 25.2 ± 0.1 ч после приземления) (R + 1) и через 7 дней после возвращения на Землю (R + 7). Кровь собирали в коммерческие пробирки SARSTEDT-Monovette®, содержащие EDTA, отделяли плазму центрифугированием и замораживали при –80°С. Ингибиторы протеаз или антимикробные агенты не добавляли.

Целевая белково-пептидная панель. Целевая панель для анализа с помощью хромато-масс-спектрометрии с мониторингом множественных реакций (ЖХ/МРМ-МС) состояла из белков, функционирующих во внеклеточной жидкости, чьи изменения наиболее часто встречаются на Земле как проявления метаболического синдрома, при котором наблюдается снижение чувствительности периферических тканей к инсулину и гипер-инсулинемия, что нарушает углеводный и липидный обмен. Метаболический синдром, характерный для воздействия условий КП на организм человека – не охарактеризован. Поэтому правомерно было начать с исследования панели белков, характерных для земного метаболического синдрома. Кроме того, углеводный и липидный обмены космонавтов также претерпевают изменения, что обуславливает интерес к данным белкам. Диапазон концентраций исследованных целевых белков находился в пределах от 33 до 44 нг/мл. В используемом количественном подходе MРM с SIS-пептидами протеотипические пептиды (обычно триптические) служат молекулярными представителями целевых белков. Для количественного определения белков плазмы в качестве внутренних стандартов использовали 13С/15N-меченые пептидные аналоги. Они были синтезированы и очищены (с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографией с обращенной фазой (RP-HPLC) с последующей оценкой на MALDI-TOF-MS) в Университете Виктории – Genome BC Proteomics Centre. Чистота SIS-пептидов составляла в среднем 94.2%. Детали метода пробоподготовки и анализа описаны ранее [3].

Анализ ЖХ/МРМ-МС. Все этапы приготовления растворов и образцов, а также параметры анализа ЖХ/МРМ-МС, описаны в статье [4]. Анализ ЖХ/МРМ-МС проводили с помощью колонки Zorbax Eclipse Plus RP-UHPLC в системе хроматографа UPLC 1290 Infinity (все от Agilent Technologies), который сопряжен с тройным квадрупольным масс-спектрометром (Agilent 6490) через источник Jet Stream ™ от Agilent в режиме электроспрейной ионизации положительными ионами. Данные мониторинга множественных реакций визуализировали и исследованли с помощью программного обеспечения MassHunter для количественного анализа (версия B.07.00, Agilent).

Биоинформационный анализ. Статистический анализ проводили в программном пакете Statistica 7 с использованием многофакторного дисперсионного анализа. Интернет-ресурс DA-VID (https://david.ncifcrf.gov) и поисковую систему PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed) использовали для определения молекулярных функций, биологических процессов и сигнальных путей. Дополнительную информацию о свойствах и молекулярной массе белков получали с помощью базы данных Uniprot (https:// www.uniprot.org).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Были исследованы образцы плазмы 18 российских космонавтов, собранной в трех временных точках: за 30 дней до полета на МКС, в первые сутки после приземления и на 7 сут после приземления. В результате идентификации были получены списки белков для каждого космонавта с указанием концентрации белка в плазме (фмоль/мкл). Всего были определены концентрации для 125 различных белков внеклеточной жидкости. С помощью программного пакета Statistica 7 был проведен многофакторный дисперсионный анализ (ANOVA), в результате чего был получен список белков, достоверно различающихся между точками эксперимента (p-value < 0.05). Туда вошли 19 белков, представленных в табл. 1.

Как видно из табл. 1, концентрации большинства белков имеют тенденцию снижаться к первым суткам после полета относительно индивидуальных фоновых значений, кроме тенденции к повышению белка PAI-3 и значительного роста уровня белка S100A9.

Миелоидный белок S100A9 (рис. 1) представляет собой кальций- и цинк-связывающий белок, конститутивно экспрессирующийся в миелоидных клетках (нейтрофилах), который играет важную роль в регуляции провоспалительных реакций и иммунного ответа. Он преимущественно присутствует в виде гетеродимерного комплекса кальпротектина (S100A8/A9), который обладает широким спектром внутри- и внеклеточных функций. Внеклеточные его функции включают провоспалительную (рекрутирование лейкоцитов) стимуляцию продукции цитокинов и хемокинов, а также регуляцию лейкоцитарной адгезии, миграцию, в том числе – трансэндотелиальную миграцию. Он стимулирует клетки врожденного иммунитета посредством связывания с рецепторами, такими как Toll-подобный рецептор 4 (TLR4) и AGER, что активирует сигнальные пути MAP-киназы и NF-каппа-B, приводящие к амплификации провоспалительного каскада и секреции Il-6. Кальпротектин обнаруживают в высоких концентрациях в локальных очагах воспаления или в сыворотке пациентов с воспалительными заболеваниями. Метод транскрипционного профилирования у пациентов с острым коронарным синдромом идентифицировал S100A9 как новый предиктор инфаркта миокарда. Дальнейшие исследования показали, что повышенный уровень гетеродимера S100A8/9 в плазме предсказывает повышенный риск развития первых и рецидивных сердечно-сосудистых заболеваний [5]. Регулирующая роль гетеродимера S100A8/9 в атерогенезе также подтверждается недавним открытием, что уровни экспрессии S100A8/9 увеличиваются в атеросклеротических артериях человека, где статистический анализ образцов экспрессии генов выявил роль гетеродимера S100A8/9 в развитии атеросклеротических сосудистых заболеваний [6]. Таким образом, предполагают, что белок S100A9 служит сигналом повреждения эндотелиальных клеток сосудистого монослоя и индуцирования провоспалительных реакций в эндотелиальных клетках [4, 7].

Рис. 1.

Динамика концентраций белка S100A9 в плазме крови космонавтов за 30 дней до полета (L-30), на первые (R + 1) и седьмые сут (R + 7) после приземления. На рисунке указаны: средняя, стандартная ошибка и 95% доверительный интервал.

Значительное повышение уровня миелоидного белка S100A9 в плазме крови космонавтов на первые сутки после приземления, возможно, служит сигналом или маркером активации провоспалительных реакций, или повреждения эндотелиального слоя сосудов, которое может происходить в ответ на изменение напряжения сдвига в процессе приземления и после него. В любом случае, повышение данного белка может иметь неблагоприятное влияние на состояние сосудов космонавтов и иметь отдаленные негативные последствия.

Итак, при анализе динамики 19 достоверно различающихся белков мы обнаружили закономерность, указывающую на то, что концентрации большинства этих белков в плазме снижаются к первому дню после полета относительно фона (за исключением белков PAI-3 и S100A9), а затем увеличиваются к 7 сут относительно первого дня после полета (за исключением аполипопротеина А-II, серотрансферрина, кислой лабильной субъединицы белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста, и маннан-связывающей лектиновой сериновой протеазы, приближаясь к фоновым уровням или оставаясь чуть ниже их (табл. 1). И, таким образом, содержание этих белков в плазме восстанавливается.

Как уже отмечено, во время полета в среднем на 10–17% уменьшается объем циркулирующей плазмы, затем следует снижение числа эритроцитов на 10% в течение первой недели космического полета [2]. Затем концентрации белков снижаются для поддержания онкотического гомеостаза, установленного в условиях невесомости. Известно, что на первые сутки после полета, наблюдается увеличенное водопотребление и снижение экскреции осмотически активных веществ [8]. Исследования регуляторных реакций показали, что после окончания продолжительных космических полетов выявляются: активация ренин-альдостероновой системы, снижение эффективности действия антидиуретического гормона, дисбаланс простагландинов прессорного/депрессорного класса [9]. Так, по сравнению с предполетным уровень антидиуретического гормона увеличивается почти в три раза, активность ренина в плазме возрастает почти в четыре раза, уровень альдостерона в плазме увеличивается на 50%, а концентрация натрийуретического пептида в плазме снижается на 33% [10]. В первые дни после приземления отмечается относительно высокое потребление жидкости космонавтами [8], а объем мочи по сравнению с предполетными значениями уменьшается [2]. Т.е. временно устанавливается положительный частичный водный баланс. Он нормализуется в течение 1 нед. после возвращения из краткосрочного космического полета [10], долгосрочные космические полеты, возможно, могут потребовать более длительных периодов восстановления. Содержание волюморегулирующих гормонов в плазме крови в начальный период реадаптации увеличено, что вызывает снижение почечной экскреции осмотически активных веществ и положительный водный баланс, способствующий увеличению объема плазмы. Таким образом, после космического полета развиваются адаптивные реакции, направленные на восполнение потерь внеклеточной жидкости, поэтому в раннем послеполетном периоде кровь “разбавлена” дополнительной жидкостью, т.е. наблюдается гемодилюция, и это приводит к снижению концентрации белков плазмы, исследованных на первые сутки после приземления.

В данном эксперименте наблюдалось уменьшение, хотя и незначительное, концентрации основного белка плазмы крови – альбумина, что подтверждает нашу гипотезу. Известно, что при заболеваниях, сопровождающихся уменьшением концентрации в крови белков (особенно альбуминов), онкотическое давление снижается, и это может явиться одной из причин накопления жидкости в межклеточном пространстве, и развития отeков. Таким образом, в послеполетный период организму крайне важно восполнить белки крови и восстановить онкотическое давление. Поэтому организм, как мы полагаем, целенаправленно синтезирует ингибиторы протеаз, такие как PAI-3, для уменьшения активности протеолиза. Было показано, что ингибиторы протеаз активируются в ответ на гипопротеинемию. Так, гипопротеинемия как следствие сепсиса, приводит к 2–5-кратному снижению активности эндогенных протеиназ, в то время как активность ингибиторов протеаз: α1-антихимотрипсина и ингибитора трипсина оказывается выше на 20–30% [11]. Хотя физиологическое значение увеличения концентрации ингибитора протеаз PAI-3 можно рассматривать и с другой стороны, что будет обсуждаться далее.

Таким образом, необходимо проводить анализ содержания белков в плазме космонавтов с учетом гемодилюции. К сожалению, за отсутствием конкретных данных об изменениях объема циркулирующей плазмы на этой группе космонавтов в те же периоды, когда изучались изменения белков, не можем оценить, уменьшались ли уровни отдельных белков пропорционально модификации ОЦП (при гемодилюции), или их превосходили. Только в последнем случае следует говорить об истинном снижении концентрации белка в плазме крови. Итак, несмотря на разведение плазмы, можно выделить белки, которые уменьшились в большей степени, чем другие. Таких белков было обнаружено два – цистатин-С и α2-HS-гликопротеин, оба являющиеся ингибиторами цистеиновых протеаз, средняя концентрация которых на первые сутки после полета уменьшилась на 41.8 и 40% соответственно. Таким образом, динамика ингибиторов протеаз неоднозначна, но изменения в этой системе могут быть четко прослежены.

В целом, “разбавление” плазмы крови маскирует картину и затрудняет определение белков, которые в ответ на условия космического полета изменяют свою концентрацию. Поэтому особого внимания заслуживают белки, концентрация которых хотя и не достоверно, но имела тенденцию к повышению на первые сутки после полета, несмотря на гемодилюцию. Таких протеинов было выделено 29. Изменения концентраций данных белков не подтверждены статистически, и поэтому мы называем их лишь тенденцией к повышению.

С помощью интернет-ресурса DAVID был проведен функциональный анализ данных протеинов. Единственный достоверно представленный путь (p-value с поправкой Бенджамини–Хогберга – 0.05) – это каскад комплемента и коагуляции. Система комплемента — это каскадная система протеолитических ферментов, предназначенная для гуморальной защиты организма от действия чужеродных агентов, она участвует в реализации иммунного ответа организма, являясь важным компонентом как врожденного, так и приобретeнного иммунитета. В то же время в результате активации системы комплемента под действием различных протеаз может повреждаться эндотелий. В каскаде комплемента и коагуляции участвуют 10 обнаруженных нами белков, 8 из которых (компоненты комплемента С2, С3, С4В, α-, β- и γ-субъединицы фибриногена, витамин К-зависимый белок С и PAI-3) продолжали увеличиваться и на 7 сут. Можно предположить, что возросший синтез данных белков вызван действием факторов космического полета.

Пять белков системы комплемента являются протеазами (фактор коагуляции XI, компоненты комплемента С2, С3, С4В и белок С). Кроме них на первые сутки после приземления в плазме крови увеличилась концентрация гаптоглобина. Все эти протеазы являются сериновыми эндопептидазами. Однако, наряду с сериновыми протеазами, также увеличивались на первые сутки после приземления и ингибиторы сериновых протеиназ, такие как α1-антихимотрипсин, α1-микроглобулин, тироксин-связывающий глобулин и PAI-3, а также белки, принимающие участие в отрицательном регулировании эндопептидазной активности: витронектин и С3 компонент комплемента. Таким образом, довольно большую часть белков, концентрация которых в плазме увеличилась или значимо уменьшилась на первые сутки после полета, составляли протеазы и их ингибиторы, а также регуляторы ингибирования. Такое перераспределение активности протеаз и их ингибиторов имеет физиологический смысл – оно необходимо для быстрого обеспечения потребности организма в новых белках. “Старые” белки разрезаются протеазами, и полученные аминокислоты используются для срочного ресинтеза новых, необходимых в адаптационном процессе, белков. Так как поступление аминокислот с пищей – это долгий процесс, как и их синтез в организме, обеспечение аминокислотного пула крови системами протеаз – приобретает характер срочной реакции. В первые дни после полета в остром периоде реадаптации организм остро нуждается в пластических ресурсах (белках) для восстановления мышечной ткани и, возможно, восстановления онкотического давления крови. Известно, что концентрация свободных аминокислот (лизина, треонина, валина, лейцина, изолейцина, фенилаланина) в крови снижена [12]. Таким образом, быстро восполнить банк нужных белков можно ресинтезом с использованием аминокислот, полученных из “старых” белков, с помощью протеаз.

По нашим данным, в плазме крови космонавтов на первые сутки после полета увеличились уровни 9 белков острой фазы, концентрации 7 из них продолжали подниматься и на 7-е сут восстановительного периода (комплемент С3, α1-антихимотрипсин, α-, β- и γ-субъединицы фибриногена, гаптоглобин ицерулоплазмин). Белки острой фазы представляют собой класс белков, концентрация которых в плазме увеличивается (положительные белки острой фазы) или уменьшаются (отрицательные белки острой фазы) в ответ на воспаление. Некоторые из них обладают антипротеазной активностью. Важно отметить, что некоторые отрицательные белки острой фазы (серотрансферрин, α2-HS-гликопротеин) значительно уменьшились на первые сутки после полета. Существуют работы, подтверждающие увеличение белков острой фазы после космического полета. В работе [13] показано увеличение уровня липополисахарид-связывающего белка в плазме 20 членов экипажа через 3–4 ч и через 15 дней после приземления. Имеются данные, что на первые сутки периода восстановления после космического полета выявлено достоверное увеличение (на 13.2%) концентрации фибриноген [14]. Даже после кратковременных космических полетов продолжительностью 4–7 сут наблюдали явление фибриногенемии (увеличение концентрации фибриногена) [15]. В работе T.P. Stein et al. было продемонстрировано увеличение скорости синтеза фибриногена на 1-ый день после окончания 16-сут полета [16]. Однако увеличение концентрации фибриногена наблюдается не только при активации провоспалительных реакций в организме, но также при стрессе [17], и снижении уровня физической активности [18].

Имеются другие работы, подтверждающие наши результаты. Так, после 49-суточной космической экспедиции было показано увеличение содержания α2-глобулинов – церулоплазмина и гаптоглобина, концентрация которых была максимальна на 14-ые сут периода реадаптации [19]. Авторы указывают на развитие реакции “острой фазы” после окончания полета. Наблюдались значительные сдвиги β1-глобулиновых фракций, проявляющиеся в уменьшении трансферрина и увеличении С3- и С4-факторов комплемента на 1-ые послеполетные сутки. Эти изменения являются признаком развития реакции “острой” фазы, которая в данном случае могла быть обусловлена как воздействием ускорений при спуске с орбиты и приземлении, так и возвращением в условия земной гравитации.

У всех млекопитающих синтез белков острой фазы регулируется воспалительными цитокинами, такими как интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-1 (IL-1) и фактор некроза опухоли (TNF). Например, IL-6 cпособен регулировать гаптоглобин, фибриноген и α1-антихимотрипсин. Имеются данные, что эндотелиальные клетки человека (HUVEC) после воздействия условий космического полета увеличивали секрецию IL-6 [20]. T.P. Steen и M.D. Schluter [21] сообщили об увеличении экскреции IL-6 и кортизола с мочой в первый день космического полета, что говорит о развитии острофазной реакции в результате стресса. В день приземления также было зарегистрировано значительное увеличение уровня IL-6 в моче у некоторых космонавтов в исследовании [22]. Однако экскреция кортизола с мочой соответствовала фоновому уровню, что понижает значение эмоционального стресса в индукции ответа острой фазы. Значит ли это, что после приземления развивается ответ острой фазы или нет, еще предстоит выяснить.

IL-6 обладает широким спектром биологических функций; он поддерживает системный ответ на стресс и травматические повреждения и способствует восстановлению гомеостаза. IL-6 играет роль медиатора в реакциях острой фазы. Многие стрессы способны инициировать острофазный ответ: инфекция, ожоги, операции, некроз и неоплазия. Поскольку острофазная реакция является неспецифическим компонентом любого стресса, а не его определенного типа, невозможно однозначно определить, какое из изменений (сдвиг жидкостей организма, вестибулярные, сердечно-сосудистые, опорно-двигательные изменения), несет ответственность за модуляцию экскреции IL-6, связанную с КП. Другие авторы наблюдали повышение экскреции IL-6 после очень интенсивных упражнений и предположили, что длительные силовые упражнения могут вызвать воспалительную реакцию из-за локального повреждения тканей, приводящего к острофазному типу ответа. Так, увеличение концентрации IL-6, маркера воспаления, наблюдали после тренировок скелетных мышц [23]. В работе [24] показано, что IL-6 необходим для гипертрофического роста мышц in vivo и является главным регулятором пролиферации клеток-сателлитов и увеличения объема мышц. Что еще более важно, ось IL-6/STAT3 признана критическим механизмом, опосредующим пролиферацию гипертрофированных мышц. Известно, что путь STAT3 является основным сигнальным путем, активируемым IL-6 [25], который ведет к синтезу белков острой фазы и развитию воспаления. Мы предполагаем, что подобное явление может иметь место после космического полета, так как некоторое повреждение мышечной ткани возникает, когда ослабленные или атрофированные мышцы нагружаются в условиях земной гравитации.

Показано, что вышеописанный белок S100A9 в составе гетеродимеракальпротектина способен индуцировать продукцию Il-6 в фибробластах десны человека [26] и в эндотелиальных клетках человека, предварительно обработанных AGE-альбумином [27]. Имеются данные, что помимо участия в воспалительном ответе, белок S100A9 в относительно низких концентрациях участвует в ангиогенезе за счет усиления пролиферации, миграции и формирования трубчатой структуры из эндотелиальных клеток [28]. Известно, что ангиогенез усиливается при воспалении. Вышеописанное свойство белка S100A9 могло бы способствовать активации ангиогенеза, происходящей при провоспалительной активации.

Некоторые белки, концентрация которых на первые сутки после полета имела тенденцию к увеличению, также имеют важное значение для ангиогенеза, ключевыми участниками которого являются эндотелиальные клетки. Белок, богатый лейцином, положительно регулирует пролиферацию эндотелиальных клеток. Комплемент С3 стимулирует продукцию фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), а витронектин положительно регулирует сигнальный путь VEGF. Напомним, что VEGF стимулирует ангиогенез, рост сосудов, рост эндотелиальных клеток, а также их пролиферацию и миграцию, необходимую для ангиогенеза. По-видимому, комплекс наших находок указывает на то, что в первые сутки после приземления космонавтов активируются процессы ангиогенеза, связанные с восстановлением мышечной массы и необходимостью обеспечения их адекватного кровоснабжения. В работе [29] подтверждается, что тренировка скелетных мышц оказывает сильное ангиогенное воздействие. Можно предположить, что в острый период реадаптации космонавтов реализуется воспалительный ответ, и активация провоспалительных реакций физиолоигически необходима, чтобы запустить неоваскуляризацию в мышцах, которые в первые дни после приземления гипотрофированы.

ВЫВОДЫ

1. Использование метода количественной протеомики на основе масс-спектрометрии при исследовании плазмы крови космонавтов позволило расширить представления о механизмах адаптивного процесса, происходящего в продолжительном космическом полете, что послужит основой дальнейших исследований с целью разработки профилактических мер.

2. Снижение ОЦП, свойственное полету, а затем активизация ретенции жидкости на завершающем этапе полета – маскируют изменения концентраций белков в плазме крови в первые сутки после приземления.

3. При сравнении концентраций белков перед полетом и на первые сутки после него было выявлено достоверное увеличение концентрации белка S100A9, который играет важную роль в функционировании эндотелия и может служить маркером активации воспалительных реакций.

4. В первые сутки после приземления в плазме крови космонавтов отмечена тенденция к увеличению концентрации белков системы комплемента и острой фазы, среди которых преобладают протеазы и их ингибиторы. Большинство этих белков продолжают увеличивать свою концентрацию и на 7 сут после полета. Таким образом, наблюдается сдвиг равновесия протеолитических – контр-протеолитических систем крови, который необходим для быстрого восполнения пула свободных аминокислот (для восстановления массы мышечной ткани) и поддержания осмотического гомеостаза.

5. Мы предполагаем, что после космического полета гипотрофированные мышцы нагружаются в условиях земной гравитации, что приводит к повреждению мышечной ткани и инициации про-воспалительных реакций.

6. Белки, увеличившие свою концентрацию на первые сутки после полета, позволяют предположить активацию процессов ангиогенеза, происходящую в результате нагрузки гипотрофированных мышц.

Работа была выполнена при поддержкегранта РФФИ № 18-34-00524. Материалы подготовлены в рамках базовой тематики РАН 65.3.