1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Физиология человека
  4. T. 45, № 3, 2019

Физиология человека, 2019, T. 45, № 3, стр. 123-128

Дисбаланс гуморального звена антиэндотоксинового иммунитета как вероятный фактор патогенеза аутоиммунных заболеваний

А. И. Гордиенко 1, В. А. Белоглазов 1, А. В. Кубышкин 1, Н. В. Химич 1, М. Ю. Яковлев 2, *

1 ФГАОУ ВО Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского, Медицинская академия им. С.И. Георгиевского,
Симферополь, Россия

2 ФГБНУ Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии,
Москва, Россия

* E-mail: yakovlev-lps@yandex.ru

Поступила в редакцию 20.10.2018
После доработки 22.11.2018
Принята к публикации 04.02.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

Изучено содержание сывороточных антиэндотоксиновых антител (АТ-ЛПС) разных классов, а также аутоантител (ААТ) классов M и G к нативной высокополимерной ДНК и денатурированной однонитевой ДНК у 28 больных акантолитической пузырчаткой. У обследованных пациентов выявлены нарушения гуморального звена антиэндотоксинового иммунитета (АЭИ) в виде достоверного снижения уровней сывороточных АТ-ЛПС класса M в крови на фоне нормального содержания АТ-ЛПС классов A и G, что не связано с изменениями концентрации в крови общих иммуноглобулинов этих же классов. Около 30% больных акантолитической пузырчаткой характеризуются достоверным повышением уровней ААТ класса G к денатурированной однонитевой ДНК и нативной высокополимерной ДНК. У этой группы больных обнаружена сильная обратная корреляция между уровнями (АТ-ЛПС) классов M и G и содержанием в крови ААТ класса G к нативной высокополимерной ДНК. Результаты кластерного анализа свидетельствуют о наличии у больных акантолитической пузырчаткой тесных взаимосвязей между нарушениями АЭИ и активностью аутоиммунных процессов. Полученные результаты являются, по мнению авторов, важным косвенным доказательством участия ЛПС в формировании и прогрессии аутоиммунных нарушений.

Ключевые слова: антиэндотоксиновый иммунитет, эндотоксиновая агрессия, аутоиммунные заболевания, акантолитическая пузырчатка.

Кишечный эндотоксин или липополисахарид (ЛПС) и обусловленная им системная эндотоксинемия (СЭЕ), является облигатным фактором гомеостаза [1], что обеспечивается, в первую очередь, способностью ЛПС активировать врожденный иммунитет благодаря взаимодействию с его ключевым рецептором – TLR4 [2]. Роль СЭЕ в биологии человека двояка. С одной стороны, она крайне необходима и полезна для регуляции активности адаптивных систем, а с другой – зловредна, а порой и катастрофична, поскольку избыток ЛПС в общем кровотоке, получивший название эндотоксиновая агрессия (ЭА), индуцирует системное воспаление. ЭА является базисным элементом патогенеза самой разнообразной патологии, к числу которой относятся аллергозы, атеросклероз, воспалительная патология глаза, ДВС-синдром и послеоперационные осложнения в детской хирургии, женское бесплодие и нервная анорексия, хронические вирусные инфекции и СПИД, сахарный диабет 1 и 2 типа, неопластические процессы [1, 3–10]. В связи с этим мы сочли вполне вероятным участие ЭА в индукции аутоимунных заболеваний, среди которых особое место принадлежит акантолитической пузырчатке (АП), являющейся одной из наиболее тяжелых нозологических форм [11].

МЕТОДИКА

Группу больных АП составили 28 пациентов с диагнозом АП (12 мужчин и 16 женщин, средний возраст (48.3 ± 4.7) лет), находящихся на лечении в ГУ “Республиканский кожно-венерологический диспансер” (г. Симферополь). Контрольную группу составили здоровые люди (n = 32), которые по гендерным различиям и возрасту соответствовали группе больных АП. Материалом для исследований служила сыворотка венозной крови, которую получали общепринятым способом и хранили при −25°С. Уровни сывороточных антилипополисахаридных антител (АТ-ЛПС) классов A, M и G определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа. В качестве антигена использовали ЛПС Escherichia coli K30, который был получен из бактериальной биомассы методом водно-фенольного экстрагирования [12, 13]. Концентрацию общих иммуноглобулинов классов A, M и G в крови определяли микротурбидиметрическим методом [14]. Сывороточные аутоантитела (ААТ) классов M и G к высокополимерной нативной ДНК и денатурированной однонитевой ДНК определяли методом иммуноферментного анализа [15]. Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью программного пакета STATISTICA 6.0 (StatSoft, Inc., USA). Достоверность различий между одноименными показателями в независимых выборках оценивали с помощью непараметрического U-критерия Mann-Whitney. Различия считались статистически значимыми при p < 0.05. В качестве непараметрического критерия, характеризующего наличие и силу взаимосвязей между изучаемыми параметрами, использовали коэффициент ранговой корреляции К. Спирмена. При проведении кластерного анализа применяли агломеративно-иерархический алгоритм Варда (Ward’s method) и метрику City-block (Manhattan) в качестве матрицы расстояний, а также итерационный метод k-средних Мак-Кина.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведенного исследования было установлено (табл. 1), что у больных АП уровень АТ-ЛПС класса M в крови был в среднем в 1.95 раза ниже (p < 0.01), чем у здоровых людей, тогда как уровни АТ-ЛПС классов A и G в среднем достоверно не отличались от своих нормальных значений. При этом с помощью корреляционного анализа у больных АП обнаружена достоверная (p < 0.05) прямая корреляция средней силы (r = = 0.55) между уровнями АТ-ЛПС классов A и G.

Таблица 1.  

Уровни сывороточных антилипополисахаридных антител разных классов у больных АП (M ± m)

Группа Антилипополисахаридные антитела разных классов, усл. ед.
IgA IgM IgG
Больные АП, n = 28 0.456 ± 0.066    0.206 ± 0.027* 0.205 ± 0.032
Здоровые люди, n = 32 0.349 ± 0.053 0.402 ± 0.051 0.179 ± 0.019

Примечание: в табл. 1, 2 и 4 достоверность различий указана по сравнению с контрольной группой здоровых людей: * – p < 0.05; ** – p < 0.01.

Известно, что повышение уровней сывороточных аутоантител (ААТ) к нативной двунитевой ДНК и денатурированной однонитевой ДНК у пациентов с аутоиммунными заболеваниями являются важным диагностическим и прогностическим критерием [16]. Поскольку буллезные дерматозы, включая АП, относятся к аутоиммунной патологии, можно ожидать появления в крови больных АП антинуклеарных факторов и вовлечения их в патогенез основного заболевания. Тем не менее, в литературе были обнаружены лишь единичные работы, посвященные определению ААТ к ДНК у больных буллезными дерматозами [17]. В связи с этим у обследованных больных АП нами было изучено содержание сывороточных ААТ классов M и G, специфичных к денатурированной однонитевой ДНК и к нативной двунитевой ДНК. Результаты этих исследований представлены в табл. 2. Они свидетельствуют о том, что у больных АП уровни ААТ класса G к денатурированной однонитевой ДНК и нативной двунитевой ДНК были достоверно выше значений этих показателей у здоровых людей в среднем соответственно в 1.47 и в 1.28 раза (p < 0.05). В то же время уровни ААТ класса M к денатурированной однонитевой ДНК и нативной двунитевой ДНК у больных АП в среднем достоверно не отличались от своих нормальных величин. Корреляционный анализ показал, что у больных АП наблюдается достоверная сильная прямая корреляция между индивидуальными уровнями ААТ класса G к денатурированной однонитевой ДНК и нативной двунитевой ДНК (r = 0.92; p < 0.001). Кроме того, у больных АП была выявлена достоверная сильная прямая корреляция между уровнями ААТ класса G к денатурированной однонитевой ДНК в крови и содержанием сывороточных АТ-ЛПС классов M и G; а также достоверная сильная обратная корреляция между уровнями ААТ класса G к нативной двунитевой ДНК в крови и содержанием сывороточных АТ-ЛПС классов M и G (табл. 3).

Таблица 2.  

Уровни сывороточных аутоантител разных классов к нативной двунитевой ДНК и денатурированной однонитевой у больных АП (M ± m)

Группа Аутоантитела к денатурированной однонитевой ДНК, усл. ед. Аутоантитела к нативной
двунитевой ДНК, усл. ед.
IgM IgG IgM IgG
Больные АП, n = 28 0.073 ± 0.007     0.091 ± 0.009** 0.075 ± 0.006   0.086 ± 0.008*
Здоровые люди, n = 32 0.085 ± 0.005 0.062 ± 0.001 0.086 ± 0.003 0.067 ± 0.003

Примечание: обозначения см. табл. 1.

Таблица 3.  

Корреляционные связи между уровнями сывороточных антилипополисахаридных антител разных классов и аутоантител класса G к денатурированной однонитевой ДНК и нативной двунитевой ДНК у больных АП

Показатель Коэффициент ранговой корреляции (r)
антилипополисахаридные антитела разных классов
IgA IgM IgG
Аутоантитела класса G
к денатурированной однонитевой ДНК 		–     0.70     0.89
Аутоантитела класса G
к нативной двунитевой ДНК 		0.78 –0.93 –0.76

Примечание: – отсутствие достоверной корреляции (p > 0.05).

Для более полной характеристики В-клеточного звена иммунитета у больных АП было изучено содержание общих IgA, IgM и IgG в крови. Анализ этих показателей представляется целесообразным еще и потому, что при лечении больных АП применяют высокие дозы кортикостероидов, которые оказывают выраженный иммуносупрессивный эффект [18]. Проведенные исследования показали, что у больных АП на фоне практически нормального содержания общих IgM и IgG (p > > 0.05) концентрация общего IgA в крови достоверно (p < 0.05) превышала значение этого показателя у здоровых людей в среднем на 34.8% (табл. 4). С помощью корреляционного анализа выяснено, что у обследованных пациентов отсутствовала достоверная корреляция между концентрацией в крови общих IgA, IgM и IgG, уровнями сывороточных АТ-ЛПС этих же классов и уровнями ААТ разных классов к денатурированной однонитевой ДНК и нативной двунитевой ДНК. Это свидетельствует о том, что изменения уровней указанных антител не связаны с изменением концентрации общих иммуноглобулинов этих же классов.

Таблица 4.  

Концентрация общих иммуноглобулинов разных классов в крови больных АП (M ± m)

Группа Общие иммуноглобулины разных классов, г/л
IgA IgM IgG
Больные АП, n = 28   2.98 ± 0.23* 1.71 ± 0.10 10.94 ± 0.49
Здоровые люди, n = 32 2.21 ± 0.16 1.77 ± 0.15 10.73 ± 0.16

Примечание: обозначения см. табл. 1.

С помощью кластерного анализа установлено, что обследованная выборка больных АП представлена двумя кластерами (условно обозначенными как АП-1 и АП-2), в пределах которых прослеживаются определенные ассоциативные связи между уровнями сывороточных АТ-ЛПС разных классов и содержанием в крови ААТ класса G к денатурированной однонитевой ДНК и нативной двунитевой ДНК (рис. 1 и табл. 5). В АП-1 вошло 8 больных АП (28.6% от общего числа обследованных пациентов), у которых уровни ААТ класса G к денатурированной однонитевой ДНК были в среднем соответственно в 1.97 и в 2.03 раза выше, чем у больных АП-2 и здоровых людей, а уровни ААТ класса G к нативной двунитевой ДНК – в среднем соответственно в 2.16 и в 2.28 раза выше, чем у больных АП-2 и здоровых людей. При этом уровень АТ-ЛПС класса A у больных АП-1 был выше, чем у больных АП-2 и здоровых людей в среднем соответственно в 2.80 (p < 0.05) и в 2.42 раза (p < 0.05, а уровень АТ-ЛПС класса G был выше, чем у больных АП-2 и здоровых людей в среднем соответственно в 2.87 и в 2.02 раза. Вместе с тем у больных АП-1 содержание АТ-ЛПС класса M было в среднем в 2.23 раза ниже, чем у здоровых людей и достоверно не отличалось от величины данного показателя у больных АП-2. В АП-2 вошло 20 больных АП (71.4% от общего числа обследованных пациентов), у которых уровни ААТ класса G к денатурированной однонитевой ДНК и нативной двунитевой ДНК в крови, а также содержание АТ-ЛПС классов A и G достоверно не отличались от своих нормальных значений. В то же время уровни ААТ-ЛПС класса M у больных АП-2 были в среднем в 1.82 раза ниже, чем у здоровых людей. Определенный разброс по некоторым показателям АЭИ и ААТ у пациентов с АП может быть проявлением волнообразности течения заболевания, как это ранее отмечалось у больных ВИЧ-инфекцией и СПИД [4], когда периоды острой ЭА сменяются “эндотоксиновой недостаточностью” (частичная утрата иммунной системы реагировать на ЛПС) с циклическим течением. Последнее может явиться предметом отдельного исследования, протокол которых должен быть расширен: определением концентрации ЛПС в общем кровотоке и маркеров системного воспаления в динамике развития заболевания.

Рис. 1.

Ассоциативные связи между уровнями сывороточных антилипополисахаридных антител разных классов и содержанием в крови аутоантител класса G к денатурированной однонитевой ДНК и нативной двунитевой ДНК для обследованной выборки больных АП (итерационный метод k-средних Мак-Кина). а – Кластер АП-1; б – кластер 2; ssДНК – однонитевая денатурированная ДНК; dsДНК – нативная двунитевая ДНК.

Таблица 5.  

Уровни сывороточных антилипополисахаридных антител разных классов и аутоантител класса G к денатурированной однонитевой ДНК и нативной двунитевой ДНК у больных АП, отнесенных к разным кластерам (M ± m)

Показатель, усл. ед. Больные АП Здоровые люди
(n = 32)
АП-1
(n = 8; 28.6%) 		АП-2
(n = 20; 71.4%)
Антилипополисахаридные антитела класса A 0.843 ± 0.121
p < 0.001
p2 < 0.001 		0.301 ± 0.043
p > 0.05 		0.349 ± 0.053
Антилипополисахаридные антитела класса M 0.180 ± 0.035
p < 0.001
p2 > 0.05 		0.221 ± 0.035
p < 0.001 		0.402 ± 0.051
Антилипополисахаридные антитела класса G 0.361 ± 0.080
p < 0.001
p2 < 0.01 		0.126 ± 0.008
p > 0.05 		0.179 ± 0.019
Аутоантитела класса G
к денатурированной однонитевой ДНК 		0.126 ± 0.010
p < 0.001
p2 < 0.001 		0.064 ± 0.002
p > 0.05 		0.062 ± 0.001
Аутоантитела класса G
к нативной двунитевой ДНК 		0.153 ± 0.018
p < 0.001
p2 < 0.001 		0.071 ± 0.003
p > 0.05 		0.067 ± 0.003

Примечание: p – достоверность различий по сравнению с контрольной группой здоровых лиц; p2 – достоверность различий по сравнению с АП-2.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенного лабораторного исследования позволяют констатировать наличие у больных с аканталитической пузырчаткой (одной из наиболее тяжелых нозологических форм аутоиммунных заболеваний) нарушений гуморального звена антиэндотоксинового иммунитета, часть из которых прямо коррелирует с активностью аутоиммунного процесса, что косвенно подтверждает участие эндотоксина в патогенезе изучаемой патологии. Характерный для всех больных дефицит анти-ЛПС антител класса М свидетельствует о наличии у пациентов “эндотоксиновой недостаточности”, т.е. частичной утраты способности иммунной системы реагировать на ЛПС – относительной недостаточности антиэндотоксинового иммунитета. Свойственный пациентам с аканталитической пузырчаткой разброс иных изучаемых показателей может быть проявлением волнообразного течения заболевания и требует дальнейшего изучения в формате расширенного протокола, включающего в себя определение маркеров системного воспаления и концентрации ЛПС в общем кровотоке. Таким образом, результаты этих исследований существенно дополнят общепринятые представления о патогенезе аутоиммунных заболеваний и позволят значительно повысить эффективность лечебного процесса.

Этические нормы. Все исследования проведены в соответствии с принципами биомедицинской этики, сформулированными в Хельсинской декларации 1964 года и ее последующих дополнений, и одобрены локальным биоэтическим комитетом Крымского федерального университета (Симферополь).

Информированное согласие. Каждый участник исследования представил добровольное письменное информированное согласие, подписанное им после разъяснения ему потенциальных рисков и преимуществ, а также характера предстоящего исследования.

Финансирование работы. Работа выполнена при финансовой поддержке сторонних организаций.

Благодарности. Авторы выражают благодарность сотрудникам Центральной научно-исследовательской лаборатории Крымского федерального университета.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией данной статьи.

Список литературы

  1. Яковлев М.Ю. Кишечный эндотоксин и воспаление. Дерматовенерология. Национальное руководство. Краткое издание. М.: Издательство “ГЭОТАР-Медиа”, 2013. С. 70.

  2. Cochet F., Peri F. The role of carbohydrates in the lipopolysaccharide (LPS)/Toll-Like Receptor 4 (TLR4) signalling // Int. J. Mol. Sci. 2017. V. 18. № 11. P. 2318.

  3. Аниховская И.А., Кубатиев А.А., Яковлев М.Ю. Эндотоксиновая теория атеросклероза // Физиология человека. 2015. Т. 41. № 1. С. 89.

  4. Аниховская И.А., Кубатиев А.А., Хасанова Г.Р., Яковлев М.Ю. Эндотоксиновый компонент патогенеза хронических вирусных заболеваний // Физиология человека. 2015. Т. 41. № 3. С. 118.

  5. Гордиенко А.И., Белоглазов В.А., Кубышкин А.В. Дисбаланс показателей гуморального антиэндотоксинового иммунитета и низкоинтенсивное воспаление при сахарном диабете 1 и 2 типа // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2016. Т. 60. № 3. С. 61.

  6. Гордиенко Ан.И., Кубышкин А.В., Гордиенко Ал.И., Кубышкин В.А. Нарушения антиэндотоксиновой защиты у больных лейкемией и миелодиспластическим синдромом // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2017. Т. 61. № 3. С. 83.

  7. Мешков М.В., Гатауллин Ю.К., Иванов В.Б., Яковлев М.Ю. Эндотоксиновая агрессия как причина послеоперационных осложнений в детской хирургии (новые перспективы профилактики). М.: Издательство “Московские учебники – СиДиПресс”, 2007, Серия: Новые лечебно-диагностические технологии. Книга 2. 143 с.

  8. Окороков П.Л., Аниховская И.А., Яковлева М.М и др. Алиментарный фактор как вероятный индуктор воспаления или липидный компонент механизма транспорта кишечного эндотоксина // Физиология человека. 2012. Т. 38. № 6. С. 105.

  9. Окороков П.Л., Аниховская И.А., Волков И.Э., Яковлев М.Ю. Кишечный эндотоксин в индукции сахарного диабета 1 типа // Физиология человека. 2011. Т. 37. № 2. С. 138.

  10. Чижиков Н.В., Лиходед В.Г., Светухин А.М., Яковлев М.Ю. Эндотоксин кишечной микрофлоры в клинике и патогенезе хронической ишемии нижних конечностей. Пенза: Издательство ПГПУ им. В.Г. Белинского 2002. 169 с.

  11. Alpsoy E., Akman-Karakas A., Uzun S. Geographic variations in epidemiology of two autoimmune bullous diseases: pemphigus and bullous pemphigoid // Arch. Dermatol. Res. 2015. V. 307. № 4. P. 291.

  12. Гордиенко А.И. Новый подход к повышению специфичности определения антител к липополисахаридам грамотрицательных бактерий методом твердофазного иммуноферментного анализа // Укр. биохим. журн. 2004. Т. 76. № 6. С. 130.

  13. Гордиенко А.И. Оптимизация технологии выделения и очистки липополисахаридов энтеробактерий // Імунологія та алергологія. 2006. № 1. С. 39.

  14. Гордиенко Ан.И., Белоглазов В.А., Гордиенко Ал.И. Микротурбидиметрический метод определения IgG, IgM, IgA человека // Iмунологiя та алергологiя. 2000. № 1. С. 12.

  15. Lacy M.J., Voss E.W. Direct adsorbtion of ssDNA to polystyrene for characterization of the DNA/anti-DNA interaction, and immunoassay for anti-DNA auto-antibody in New Zealand white mice // J. Immunol. Meth. 1989. V. 115. № 1. P. 87.

  16. Eggert M., Zettl U.K., Neeck G. Autoantibodies in autoimmune diseases // Curr. Pharm. Des. 2010. V. 16. № 14. P. 1634.

  17. Ochsendorf F.R., Schöfer H., Milbradt R. Pemphigus erythematosus – Nachweis ton Anti-DNA Antikörpern // Hautarzt. 1987. V. 38. № 7. P. 400.

  18. Han A. A practical approach to treating autoimmune bullous disorders with systemic medications // J. Clin. Aesthet. Dermatol. 2009. V. 2. № 5. P. 19.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Физиология человека

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал