Физиология человека, 2021, T. 47, № 4, стр. 91-102

МЕТОДИКА

Объектами исследования являлись образцы плазмы крови, собранные у 13 российских космонавтов до и после КП на российском сегменте МКС. Длительность полетов составляла 5.5–6.5 мес. Биологические образцы собирали в рамках утвержденного космического эксперимента российской национальной научной программы, перед полетом, а также на 1-ые и 7-ые сут после приземления, оформленного и одобренного в установленном порядке. После получения плазмы, пробы сохраняли до масс-спектрометрического исследования. Вслед за пробоподготовкой выполняли хромато-масс-спектрометрический анализ (ВЭЖХ – МС/МС) на комплексе, состоящем из хроматографа Dionex Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, США) в сочетании с Tims TOF Pro (Bruker Daltonics, Германия) с использованием источника ионов наноспрея (режим положительных ионов, 1600 В) (Bruker Daltonics, Германия).

Количественную оценку изменений уровня белков крови космонавтов проводили безметочным методом (label-free), как это описано в работе [6]. Анализ МС/МС спектров проводили с помощью программного комплекса Peaks Studios [7] с использованием прямой и обратной базы SwissProt [8] с максимальной ошибкой для дочерних ионов менее 10 ppm. Для определения локуса образования белков использовали базу данных Tissue-specific Gene Expression and Regulation (TiGER) (http://bioinfo.wilmer.jhu.edu/tiger). Молекулярные функции и биологические процессы базы данных GO для анализируемых белков определяли по разделу базы данных UniProt-GOA [9]. Сверхпредставленность биологических процессов для полученных списков белков оценивали программой BiNGO (Biological Network Gene Ontology tool).

Статистический анализ и определение молекулярных функций и биологических процессов, в которых участвуют белки, выполняли с использованием программного пакета Perseus (version: 1.5.5.3). Для статистического анализа использовали программный пакет Statistica 10. Функциональный анализ белков проводили с помощью веб-ресурсов DAVID, String и программы Cytoscape. Статистически значимыми считали корректированные данные с p-value < 0.05 (точный критерий Фишера с поправкой на множественность сравнения Бенджамини-Хокберга). Для выявления в спектрах изменений в массе пептидов, соответствующих определенным PTMs, было просканировано 299 215 MS-спектров и 4 MS/MS-спектров, статистика отфильтрованных результатов представлена в соответствующем разделе I части настоящей статьи [5]. Там же представлено подробное изложение аналитических приемов и методов анализа результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Как было отмечено в I части [5] настоящей статьи, в структуре 131 белка из послеполетных образцов крови выявляются различные посттрансляционные модификации. Среди них были отобраны и в дальнейшем проанализированы только белки с оксидативными PTMs (ox-PTMs). Отбор был выполнен программными средствами, из 9060 отчетов по сканированию спектров. Уровень окислительных модификаций каждого белка, индуцированных КП, устанавливался при сравнении соотношения оксидативных PTMs того же протеина в образцах “после” vs “до полета”. Для составления статистической таблицы относительно динамики числа ox-PTMs в белках устанавливали фильтр, отсекающий результаты выявления данного типа модификаций лишь в 1 или 2-х пептидах данного белка (табл. 1).

Статистика числа PTMs в белках крови космонавтов до совершения ими КП показывает, что ox-PTMs являются наиболее распространенным их типом (оксидативные модификации составляют 72% от общего числа). В то же время после выполненного полета дополнительно у значительной части белков крови выявляются окислительные модификации. К ним относятся как протеины с достоверно возросшим уровнем ox-PTMs после полета, по сравнению с таковым в предполетных образцах крови (p < 0.05), так и белки, в которых перед полетом окислительные модификации не обнаруживались (табл. 2, 3).

В другой группе белков оксидативные модификации выявлялись исключительно в протеинах послеполетных образцов (табл. 3).

Были обнаружены и устойчивые к данному виду модификаций белки, уровень окисления которых в послеполетных образцах оставался на том же уровне, что и перед полетом. Анализ возможных причин их устойчивости к окислению и ее значения для физиологических систем организма выходит за рамки данной статьи и не приводится.

Учитывая, что, согласно биоинформатическому анализу, 106 протеинов из общего списка являются белками, функционирующим во внеклеточной жидкости (с FDR 7.33e-81), можно предположить, что в процессе осуществления своих функций они тесно взаимодействуют с внеклеточным матриксом (ВКМ).

В настоящее время является общепризнанным, что структурные компоненты ВКМ и ассоциированных с ним во внеклеточной жидкости соединений оказываются своеобразным сложным молекулярным хабом, связывающим в один “распределительный узел” функции иммунитета, сосудистые компетенции, контроль воспаления, протеазно-контр-протеазный баланс, гемостаз. И с этой точки зрения оказывается невозможным рассматривать компоненты этих систем в качестве действующих изолированно, в рамках “своей” функциональной системы.

Предваряя анализ окисленных в послеполетных образцах плазмы белков, следует уделить внимание некоторым аспектам, касающимся функций ВКМ, в том числе – его взаимодействия с клеточным окружением.

С одной стороны, недавние исследования показали, что ВКМ чрезвычайно восприимчив к окислительному повреждению из-за его значительной представленности во внеклеточной жидкости, низкой скорости метаболизма (что приводит к накоплению повреждений) и относительно низких уровней внеклеточных антиоксидантов и компонентов репаративных систем [2, 10, 11]. В литературе представлен значительный объем данных, демонстрирующих, что оксиданты, генерируемые активированными лейкоцитами (нейтрофилами, моноцитами, тканевыми макрофагами), могут вызывать структурные и функциональные изменения компонентов ВКМ, в т.ч. протеогликанов [12–14]. Показано, что оксидативное повреждение ВКМ по сайтам метионина происходит вследствие ферментативного действия миелопероксидазы (MPO), высвобождаемой активированными лейкоцитами [15]. Активированные лейкоциты генерируют супероксидные радикалы (${\text{O}}_{2}^{{ \bullet {\kern 1pt} - }}$) и перекись водорода (H₂O₂) с помощью ферментов НАДФН-оксидазы (NOX), а нейтрофилы, моноциты и тканевые макрофаги высвобождают миелопероксидазу (МPО) из внутриклеточных гранул [3]. В присутствии хлорид-ионов (Cl-) MPO использует H₂O₂ для образования мощного окислителя, хлорноватистой кислоты (HClO), реагирующего со многими биологическими мишенями, но в основном – из-за их большого количества и высокой реактивности – с белками [3, 15].

Показано, что ВКМ первично (т.е. непосредственно) чувствителен к механическим воздействиям [16]. Поэтому на экспрессию компонентов ВКМ может влиять механическое напряжение [17], создаваемое гравитацией, одним из наиболее важных физических факторов, влияющих на все виды жизни на Земле. И поскольку является общепризнанным фактом развитие оксидативного стресса в организме человека во время КП [1, 18], интерес к изучению оксидативных модификаций компонентов ВКМ в условиях микрогравитации становится обоснованным и неизбежным.

Кроме того, большинством исследователей признается, что ВКМ и его реорганизация (ремоделирование) имеют первостепенное значение в формировании и контроле иммунного микроокружения, а также для взаимодействия иммунная клетка – ВКМ [19, 20]. Сопряжение функций иммунитета и внеклеточного матрикса в последнее время достаточно документировано. Показано, что в механизмы ответа на окислительный стресс, факторы роста и провоспалительную активацию вовлечены как иммунные клетки, так и ВКМ, а также лизилоксигеназы (LOX) [21]. За счет внеклеточного сигнального пути, ERK (одного из каскадов МАРК) продукты метаболизма ВКМ способны контролировать стресс эндоплазматического ретикулума [22, 23]. Белки-компоненты ВКМ принадлежат к молекулярным паттернам, связанным с опасностью (DAMP), индуцирующим провоспалительное состояние и активирующим врожденную иммунную систему [24, 25]. Также, недавние следования показали роль гиалуронана (HA) и его рецепторов в адаптивном иммунитете, особенно в отношении эффекторной и регуляторной функции Т-клеток [26]. Поэтому в нашем исследовании было важно обратить внимание на оксидативные модификации белков иммунной системы. Так, было показано значимое повышение уровня окисления фрагментов иммуноглобулинов (табл. 4).

Как показывает анализ данных, полученных в гравитационной физиологии при моделировании условий микрогравитации и после пилотируемых КП, в тканях человека создается гипоксическая среда [18]. Следует рассмотреть возможные изменения функций белков, собранные в табл. 4. Показано, что при гипоксии в эндотелиальных клетках терминального сосудистого русла человека транскрипция белка ITGB3 активируется с помощью индуцированного гипоксией фактора 1A (HIF1A) [27, 28]. Кроме того, данные продемонстрировали, что в гипоксической среде и при доступности витронектина рецептор эпидермального фактора роста vIII (EGFRvIII) и ITGB3 имеют тенденцию к формированию комплексов [29].

Показано, что интегрины могут также стимулироваться внеклеточным кислым pH. Более того, кислое микроокружение также способствует активности матриксных металлопротеаз, которые связываются с интегринами β3 [30]. Анализ нескольких наборов данных показывает, что транспортер глюкозы 3 типа (GLUT3) устойчиво положительно коррелирует с ITGB3. Таким образом, ITGB3 активирует экспрессию GLUT3, поглощение глюкозы, продукцию лактата и уровень гликолиза. ITGB3 связывается с ВКМ через свой лиганд витронектин и матриксные металлопротеиназы (MMPs), позволяя MMP2 ремоделировать внеклеточный матрикс, что способствует активации эндотелиальных клеток [31]. Подавление функции ITGB3, в результате его оксигенации, приводит к потере молекулы адгезии эндотелиальных клеток (ECAM), вызывая интернализацию VEGFR-2 [32]. В свою очередь, ингибирование фосфорилирования и инактивация VEGFR-2 угнетает миграцию эндотелиальных клеток [33].

Космический полет изменяет фенотип иммунных клеток в костном мозге, лимфоидном органе, в котором происходит гемопоэз [34], а во время модельного эксперимента с вывешиванием грызунов количество предшественников B-клеток в костном мозге снижается [35]. Реакция популяции В-клеток на КП не исследована столь тщательно, как это делается для Т-клеток. Только в отдельных работах исследовали влияние КП на репертуар Ig. Стимуляция человеческих В-клеток in vitro во время КП приводила к более низким концентрациям секретируемых Ig [36]. Достоверной разницы в уровнях Ig до и после полета в периферической крови космонавтов, летавших на борту МКС, не наблюдалось [37]. Измерение общего репертуара Ig селезенки мышей, экспонированных на МКС в течение 3 нед., показало, что не было влияния КП на использование сегмента B-гена [38]. Исследования эффектов КП на модели иммунизированных амфибий показали измененное семейство VH-генов и использование класса Ig [39, 40].

Известно, что при созревании B-клеток в костном мозге экспрессия иммуноглобулинов претерпевает ряд изменений. Предшественники зрелых В-клеток, пре-B-клетки, синтезируют только мембранные формы тяжелых цепей класса μ. Также незрелые и зрелые B-клетки синтезируют легкие цепи классов κ и λ, которые, соединяясь с тяжелыми цепями класса μ, образуют антитела IgM. Зрелые B-клетки экспрессируют мембранные формы IgM и IgD, которые служат распознающими антигены рецепторами и запускают активацию B-клеток. Рецепторы незрелых и зрелых B-клеток нековалентно связаны с интегринами, сигнальные функции которых необходимы для экспрессии поверхностных форм IgM и IgD [38]. Когда B-клетки активируются антигенами и другими стимулами, они превращаются в плазматические клетки, секретирующие антитела. В это же время переходит переключение классов антител, и клетка перестает синтезировать IgM и IgD, но начинает – IgA, IgE или IgG.

Нами выявлена повышенная, в 2 и более раз, интенсивность окислительных модификаций цепей как мембранных, так и секреторных форм иммуноглобулинов (табл. 2). И поскольку окисление по дисульфидным мостикам, как наиболее вероятным сайтам окисления, ведет к их разрывам, можно предполагать фатальное изменение структуры и функции иммуноглобулинов, как минимум, классов М и G. Обращает на себя внимание состав окисленных фрагментов иммуноглобулинов – цепи (κ, γ1, γ2, γ4 и µ) константных доменов Ig. Поскольку каждая тяжелая цепь Ig имеет С-концевую константную (С) область, кодируемую отдельным геном С-области, которая определяет изотип антитела, окислительные модификации этой области выражено изменяют эффекторные или сигнальные функции этих молекул.

Как следует из табл. 5, группа аполипопротеинов (АПО) так же, как и фрагменты иммуноглобулинов, оказалась подвержена избыточному окислению в послеполетных образцах, по сравнению с их состоянием перед полетом (APOA1, APOA2, APOA4, APOL1, APOE). Липопротеины высокой плотности (ЛПВП), с входящими в их состав АПО, представляют собой соединения, обладающие васкулопротекторными свойствами. Окисление считается наиболее распространенной посттрансляцинной модификацией в аполипопротеинах, особенно в APOA1 (что обнаружено и нами). Так, окислительные модификации по остатку Trp в APOA1, обнаруженные в ткани и плазме, тесно связаны с потерей васкулопротекторных свойств ЛПВП у пациентов с абдоминальной аневризмой аорты [41]. Показано также, что окислительная модификация различных остатков APOA1 присутствует в атеросклеротических бляшках и связана с дисфункцией ЛПВП [4, 42, 43]. Окисленные формы циркулирующего APOA1 были выявлены в исследованиях у пациентов с различными сердечно-сосудистыми заболеваниями [44, 45].

Мощными источниками окислительного стресса во внеклеточной жидкости, за счет высвобождения миелопероксидазы (МПО), и потенцирования процесса окислительно-восстановительным действием Fe²⁺ из свободного гемоглобина, являются нейтрофилы и эритроциты. В основном МПО выделяется активированными нейтрофилами, затем фермент катализирует реакцию между перекисью водорода и ионами хлорида с образованием хлорноватистой кислоты в качестве основного окислителя. MPO связан с ЛПВП, причем подтверждено, что ЛПВП от пациентов с аневризмой аорты несет более высокие уровни MPO, по сравнению с ЛПВП в образцах от здоровых лиц [46]. Среди окислительных модификаций, происходящих под действием МПО, выделяется окисление сайта Trp72 [44], что подтверждено in vitro и in vivo. Кроме оксидантов, полученных из нейтрофилов, важную роль в окислении APOA1 могут играть другие источники АФК, такие как двухвалентное железо [47] или ферменты нейтрофилов, вышедшие из внеклеточных микрочастиц: никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФН) оксидазы [48]. Остатки Trp являются ключевыми локусами, регулирующими MPO-опосредованную потерю акцепторной активности холестерина APOA1 [49], следовательно, их окислительные модификации, могут объяснить снижение способности оттока холестерина из клеток [41].

Анализ основных функций сверхокисленных белковых компонентов аполипопротеинов дает представление о функциях и биологических процессах, которые могут быть вследствие этого нарушены. Кроме влияния на метаболизм холестерина, клиренс остатков хиломикронов и ЛПОНП, провоспалительную активацию [50, 51], липопротеины входят в единую молекулярно-клеточную сеть, объединяющую функции иммунитета, регуляции комплемента, гемостаз, ремоделирование ВКМ [2, 16, 52].

Для прояснения и наглядного представления возможных механизмов, с помощью которых осуществляется влияние ВКМ на различные функции, с помощью программы ANDsystem были найдены связи некоторых “сверхокисленных” белков крови космонавтов после КП с процессами внеклеточного матрикса (рис. 1), в том числе – реализующимися через сигнальный путь ERK (рис. 2).

Рис. 1.

Ассоциативная связь белков крови, с повышенным содержанием окислительных модификаций после космического полета (КП), с внеклеточным матриксом.

Рис. 2.

Участие белков крови с повышенным содержанием окислительных модификаций после космического полета (КП) в сигнальном пути ERK.

Участниками сети взаимодействий, воссозданной на рис. 1, оказались не только сверхокисленные белки, но и протеины, подвергшиеся de novo оксидативной модификации после полета. В целях упрощения схем взаимодействия мы ограничились воссозданием молекулярных цепочек без молекул-посредников (т.е. сети прямых взаимодействий). Однако в действительности молекулярные сети многозвенны. Так, рис. 1 иллюстрирует, как могут быть многообразны пути воздействия на ВКМ оксидативно измененных белков. Можно отметить, что в схему связей белков с внеклеточным матриксом вошли не все сверхокисленные белки. Кроме того, у некоторых белков связь оказалась не прямой (гаптоглобин-связывающий протеин – HPR, маннан-связывающая лектин-сериновая протеаза 1 – MASP1, кератин 1 типа, цитоскелетный 9 – KRT9), а через одного посредника из числа анализируемых белков. В то же время прямые связи с ВКМ были показаны для 8 белков: P01023|A2MG_HUMAN – альфа-2-макроглобулина, P02787|TRFE_HUMAN – серотрансферрина, P01009|A1AT_HUMAN – альфа-1-антитрипсина, P04264|K2C1_HUMAN – кератина 2 типа, цитоскелетного, P00738|HPT_HUMAN – гаптоглобина, P02788|TRFL_HUMAN – лактотрансферрина, Q12805|FBLN3_HUMAN – EGF-содержащего фибулин-подобного белка 1 внеклеточного матрикса, P11226|MBL2_HUMAN – коллектина-1.

Сигнальным путем, через который белки с окислительной модификацией могут воздействовать на внутриклеточные события, по-видимому, является ERK, один из каскадов МАРК (рис. 2). Сопряжение функций иммунитета и внеклеточного матрикса отражено в работах [23–27], показывающих многообразие и сложность диалога клетка – внеклеточный матрикс. Интересно, что 2 белка из выше представленных (лактотрансферрин и EGF-содержащий фибулин-подобный белок 1 внеклеточного матрикса) напрямую участвуют в сигнальном пути ERK. Все остальные анализируемые белки были связаны с этим каскадом через молекулярных посредников.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, можно считать установленным, что посттрансляционные модификации белковых компонентов основного внеклеточного хаба (в который входит ВКМ), в т.ч. окислительные, индуцируются продолжительным пребыванием человека на борту космического объекта. При этом окисление белков, компонентов такой сложной сети взаимодействий, сказываются на функциях, осуществляемых как внеклеточно, так и внутри клеток. В перспективе особенное внимание предстоит уделить взаимодействию этой молекулярной сети внеклеточной жидкости с эндотелиальными и гладкомышечными компонентами сосудов, поскольку приспособление к условиям КП сердечно-сосудистой системы лежит в основе многих интегративных функций, таких как физическая работоспособность, ортостатическая устойчивость, водно-электролитный баланс, терморегуляция.

Этические нормы. Исследования с участием Российских космонавтов проведены в рамках космического эксперимента “Протеом”, в соответствии с принципами биомедицинской этики, сформулированными в Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующих обновлениях, и одобрены комиссией по биомедицинской этике Института медико-биологических проблем РАН (Москва).

Информированное согласие. Каждый участник исследования представил добровольное письменное информированное согласие для участия в исследовании.

Финансирование работы. Исследования поддержаны программой фундаментальных научных исследований РАН 65.3. Исследование ПТМ белков плазмы крови с использованием масс-спектрометрии высокого разрешения проводилось в рамках проекта РНФ № 19-14-00306.

Благодарности. Авторы статьи выражают искреннюю благодарность космонавтам, принимавшим участие в исследовании.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией данной статьи.