Цитология, 2019, T. 61, № 10, стр. 787-796

СЕРОТИПЫ У ИНФУЗОРИИ D. ANSER

Для D. anser получены данные о серотипах, их индуцированной трансформации и внутривидовом полиморфизме этого признака (Успенская, 1988, 1990; Uspenskaya, Yudun, 1992, 1998). Серотип инфузорий определяется иммунологическими методами и является результатом присутствия определенного класса поверхностных белков. Эти белки названы иммобилизационными антигенами (i-антигенами), поскольку при обработке клеток гомологичной иммуносвыороткой (ИС) инфузории обездвиживаются (иммобилизуются). В пределах морфологического вида D. anser обнаружен полиморфизм по серотипам, основу которого еще предстоит установить. Представляет несомненный интерес оценить уровень и характер изменчивости биохимических признаков (при помощи изозимного анализа) и выяснить, имеются ли виды-двойники в пределах морфологического вида D. anser.

В системе серотипов инфузорий наибольший интерес представляют механизмы регуляции активности генов поверхностных белков в норме и при трансформации серотипов. Этим вопросам посвящены многочисленные исследования (основную литературу см.: Вleyman, 1996). Тем не менее, до сих пор неизвестны механизмы, обеспечивающие весьма характерный для работы этой системы принцип взаимного исключения, когда в данной клетке в данный период времени экспрессируется лишь один ген из целой серии генов, которые кодируют альтернативные поверхностные белки. С этим принципом тесно связано явление трансформации серотипов, когда спонтанно, а чаще при различных воздействиях на клетку, происходит переключение активности с одного гена на другой и соответственно – смена одного поверхностного белка клетки другим. При этом нередко наблюдается явление “функциональной инерции” или “гистерезиса” серотипов – их тенденции к наследованию в ряду клеточных поколений, в силу чего несколько разных серотипов могут поддерживаться в клоне при одних и тех же условиях культивирования (Nanny, 1980; Caron, Meyer, 1989).

Таким образом, серотип у инфузорий оказывается (и таковым остается) интересным объектом для исследований регуляции активности генов как на клеточном, так и на молекулярном и биохимическом уровнях. Несмотря на большие достижения молекулярно-биологических исследований поверхностных антигенов и кодирующих их генов у инфузорий, фундаментальные особенности системы серотипов так и не получили объяснения, хотя экспериментально проверялись различные гипотезы (Preer, 1986; Schmidt, 1988, 1996; Forney et al., 1996; Meyer, Duharcourt, 1996).

Сведений о ядерном аппарате, конъюгации и конъюгационном цикле дилептуса D. anser немного. Ранние сведения приводятся в обширной сводке (Dragesco, 1963). Деление клетки начинается с митоза генеративных ядер – микронуклеусов Они всегда сферические, мелкие, число их может колебаться от 6 до 20. Сразу после микронуклеусов начинает делиться вегетативное ядро – макронуклеус, который состоит из большого числа фрагментов. Половой процесс представлен конъюгацией, которая может быть нескольких типов.

Из более поздних работ следует назвать работы (Винникова, 1974; Vinnikova, 1976; Karadzhan, 1985; Golinska, Afon’kin, 1993). Наблюдения Виннико-вой Н.В. позволили высказать предположение о том, что у дилептусов происходит обмен мигрирующими пронуклеусами по классической схеме. В большинстве случаев набор новых макронуклеусов эксконъганта образуется из нескольких зачатков в результате многократных последовательных делений надвое. Метагамные деления эксконъюгантов с распределением зачатков по дочерним клеткам, а также слияние зачатков у дилептусов не отмечены, поэтому допускается, что макронуклеусы в пределах клона могут быть неоднородными по происхождению (Винникова, 1974). Как и все инфузории, D. anser является диплонтом с гаметической редукцией числа хромосом, и мейоз проходит по классической схеме Metazoa (Raikov, 1972).

В наших ранних работах были определены серотипы 20 клонов инфузории D. anser c помощью антисывороток, полученных против двух из этих клонов инфузорий (Успенская, 1988). Всего было проверено 38 гетерологических комбинаций “клетка–сыворотка”. Обе иммуносыворотки (ИС) давали характерную реакцию иммобилизации при действии на гомологичные клетки, как это было показано при работе с парамециями и тетрахименами (см. обзоры: Beale, 1954, 1957), демонстрируя, что специфичность ИС связана именно с i-антигеном. По тесту иммобилизации в 33 комбинациях не наблюдали реакции клеток с гетерологичными ИС, что означало наличие другого серотипа, определяющегося другими поверхностными i-антигенами. Однако в четырех комбинациях с одной ИС и в одной комбинации с другой ИС обнаружили реакцию иммобилизации, которая говорила о сходстве своего серотипа с серотипом гомологичных клонов.

При культивировании в постоянных условиях серотип инфузорий D. anser оставался неизменным неопределенно долго в ряду клеточных агамных поколений. При тестировании клонов через 1 год и через несколько лет наблюдали почти 100%-ную иммобилизацию клеток гомологичными сыворотками и отсутствие реакции с гетерологичными клетками. В последующие годы протестировали множество новых клонов дилептусов и выявили всего 2–3 случая перекрестных реакций (Тавровская, 1989; Успенская, 1990). Таким образом, использование даже двух ИС выявляет в природных популяциях дилептусов полиморфизм клонов по серотипам, который сохраняется при культивировании в постоянных условиях.

При изменении условий культивирования дилептусов изменялся их серотип. Детально исследовано изменение серотипа в результате изменения температуры культивирования. Инфузорий, культивировавшихся при 25°С, переносили в среду с температурой 17°С и затем ежесуточно тестировали их серотип по реакции иммобилизации. Аналогично поступали с инфузориями, перенесенными из более холодной среды (17°С) в теплую (25°С). Было показано, что каждый из использованных клонов (6 и 5Ф) способен проявлять 2 серотипа – один при температуре культивирования 25°С (“тепловой”) и другой при температуре 17°С (“холодовой”). Исчезновение старого серотипа и появление нового происходило постепенно, но одновременно и с одинаковыми скоростями. Эти изменения были массовыми, полностью обратимы и, следовательно, происходили путем постепенной трансформации всех клеток в культуре (Uspenskaya, Yudin, 1992). Еще в двух клонах отмечены перекрестные реакции ИС с инфузориями из культур, содержащихся при другой температуре. Использовались клоны 28 и 29, субклоны каждого из которых культивировали при 25 и 17°С. Две ИС были получены против двух культур клона 5Д, культивировавшихся при тех же температурах. Каждая ИС обездвиживала только гомологичные клетки, но оказалось, что оба температурных субклона клона 29 реагировали с обеими ИС (5Д-25 и 5Д-17). Точно так же ИС 5Д-25 и 5Д-17 обездвиживали инфузорий клона 28, культивируемых при 25°С, то есть один и тот же серотип проявлялся при обеих температурах (Успенская, 1990). Такие перекрестные реакции описаны у парамеций. Известно, что их i-антигены, контролируемые разными (неаллельными) генами, как правило, не обнаруживают перекрестных реакций с антисыворотками. Антигены же, контролируемые аллелями одного гена, нередко обладают той или иной степенью иммунологического сходства (Beale, 1957; Bishop, 1963; Schmidt, 1988). Можно предположить, что вопреки принципу взаимного исключения клетки клонов 28 и 29 синтезируют два различных i-антигена, которые одновременно экспрессируются при той и другой температурах.

У D. anser выявлены три типа (I–III) спаривания. В обычных условиях конъюгация происходит только между особями комплементарных типов спаривания (Tavrovskaya, 1979). Предконъюгационные взаимодействия особей опосредуются специфическими сигнальными веществами – гамонами или феромонами спаривания (ФС), выделяемыми половозрелыми инфузориями в среду. Для каждого типа спаривания характерен свой тип ФС. Показано, что ФС II является термостабильным полипептидом с молекулярной массой около 3000 Да (Парфенова и др., 1988). Все три ФС оказались хемоаттрактантами для клеток комплементарных типов спаривания. Они замедляют движение инфузорий, индуцируют у них дополнительные конъюгационные клеточные деления, и тогда клетки способны к объединению в пары и прохождению полового процесса (Parfenova et al., 1989). Гамоны запускают половой процесс, и тип спаривания организма определяется тем, какие ФС инфузория экскретирует в среду и на какие ФС, экскретируемые другими клетками этого вида, она способна реагировать.

Для исследования характера наследования серотипов у инфузории D. anser использовали два независимых клона из нашей лабораторной коллекции – Б и Д, которые относились к комплементарным типам спаривания (I и III) и активно вступали в конъюгацию. К этим клонам были получены ИС, после чего были проведены скрещивания. Эксконъюгантные клоны F₁ тестировали по реакции иммобилизации клеток ИС, полученными против клеток Б и Д, через 30 сут после конъюгации и через 4 мес, т.е. по достижении ими половой зрелости (Успенская, Юдин, 2000; Yudin, Uspenskaya, 2000). Инфузории всех клонов F₁, протестированных в возрасте 1 мес, реагировали с обеими ИС, то есть имели гибридный фенотип. Поверхностные антигены обоих родительских типов присутствовали не в равных количествах. Например, у 33 из 46 клонов доля клеток, обездвиженных под действием той и другой ИС, была разной. Однако закономерного преобладания какого-то одного i-антигена не наблюдали: 14 клонов сильнее реагировали с ИС-Б, а 19 – с ИС-Д. Гибридный фенотип сохранялся и при дальнейшем культивировании этих клонов вплоть до их созревания. Но не было обнаружено ни материнского наследования изучаемого признака (как у Paramecium primaurelia), ни ситуации, которую можно было бы описать как аллельное исключение, ни ситуации, которая походила бы на вегетативную рассортировку серотипов в гетерозиготных клонах Tetrahymena thermophila. Картина была такой же, как и при наследовании аллельных серотипов у гетерозигот P. tetraurelia, когда имеет место коэкспрессия аллелей (Beale, 1954, 1957; Preer 1968; Sommerville, 1970; Finger, 1974; Nanny, 1980; Bleyman, 1996).

Тестирование созревших эксконъюгантных клонов показало, что они все относились ко II типу спаривания. Поэтому для получения потомства F₂ клоны скрещивали не друг с другом, а с каждым из родительских клонов (возвратные скрещивания). Были поставлены возвратные скрещивания 5 разных клонов F₁(БxД) с родительскими клонами Б и Д. От них удалось вырастить и протестировать по серотипу соответственно 25 и 26 клонов F₂. Результат оказался неожиданным – все клоны имели тот же гибридный фенотип, что и клоны F₁, т.е. полностью отсутствовали расщепления во втором гибридном поколении, что говорило о неменделевском наследование признака. Некоторые клоны F₂ от разных скрещиваний были протестированы значительно позже (через 6 и 9 мес.), и они стабильно сохраняли свой гибридный фенотип (Успенская, Юдин, 2000).

В экспериментах с парамециями температурная трансформация серотипов явилась важным вспомогательным фактором гибридологического анализа (Beale, 1954). В связи с отсутствием расщепления среди клонов F₂ дилептусов, не было ясно, контролируются ли серотипы родительских клонов Б и Д аллелями одного локуса или разных. В этой связи предприняты эксперименты по температурной трансформации серотипов у клонов F₂. Такое временное “выключение” могло дать возможность оценить степень стабильности произошедших эпигенетических изменений, выразившихся в отсутствии расщепления и сохранения гибридного фенотипа всеми клонами F₂ . У клонов F₂ вызывали трансформацию серотипа изменением температуры среды с 25 на 17°С. Затем их тестировали по реакции иммобилизации спустя 7 и 20 сут после возвращения клонов в прежний температурный режим (25°С), в котором они находились около 2 нед. Оказалось, что каждый клон без исключения реагирует как с одной, так и с другой ИС, обнаруживая гибридный фенотип или совместную экспрессию поверхностных i-антигенов того и другого родителя (Успенская, Юдин, 2001).

Итак, изучая серотипы у D. anser мы получили данные, что в системе серотипов этих инфузорий обнаруживаются особенности, описанные в литературе при изучении систем серотипов классических объектов – инфузорий Paramecium и Tetrahymena. В то же время столкнулись со случаями нарушения правила взаимного исключения при экспрессии i-антигенов. У одного из клонов D. anser обнаружено длительное совместное проявление двух i-антигенов при промежуточных температурах между теми, которые вызывают полную трансформацию одного антигенного типа в другой. Кроме того, у D. anser наблюдали отсутствие расщепления в F₂. Однако в большинстве случаев в данное время и в данных условиях экспрессируется только один тип поверхностного i-антигена (действует правило взаимного исключения), значит контроль серотипов у дилептусов имеет эпигенетическую составляющую.

На основе таких примеров была сформулирована концепция эпигена в 70-х годах прошлого века (Чураев, 1975). Эпигеном была названа циклическая система из двух или нескольких генов, которая имеет не менее двух режимов функционирования, сохраняемых в последовательном ряду клеточных поколений. Выбор режима функционирования зависит от регуляторных молекул белков и РНК, которые челночно циркулируют между ядром и цитоплазмой и обеспечивают обратные связи. Все последующие годы разрабатывалась гипотеза о эпигене, а примеры генетических явлений, связанных с эпигенетической изменчивостью, постоянно увеличивались (Tchuraev, 2010). Идеи об эпигенах и функциональной наследственной памяти получили подтверждение и развитие у ряда зарубежных авторов (Holliday, 1987; Jorgensen, 1993; Holliday, Ho, 2002). Серьезным подтверждением существования эпигенов послужил их синтез, осуществленный Чураевым с сотрудниками (Tchuraev et al., 2000) – впервые спроектирован и сконструирован двухкомпонентный стационарный эпиген с заданными и управляемыми наследуемыми динамическими свойствами и функционирующий in vitro. В США вышла коллективная сводка по эпигенетическим механизмам генной регуляции (Russo at al., 1996). К настоящему времени можно утверждать, что доказано существование нового класса наследственных единиц – эпигенов, которые обуславливают наблюдаемые феномены наследования приобретенных признаков и могут служить основой недарвиновских путей эволюции (Jablonka, Lamb, 1999).

ТИПЫ СПАРИВАНИЯ У ИНФУЗОРИИ D. ANSER

Изучали еще один классический для генетики инфузорий признак – типы спаривания (ТС). Со времени открытия Соннеборном типов спаривания у Paramecium aurelia (Sonneborn, 1937) в исследования этого признака вовлекались все новые и новые виды инфузорий. В результате накоплено большое количество данных о физиологии, биохимии и молекулярной биологии половых процессов и типов спаривания у инфузорий (см. обзор Miyake, 1996). Тип спаривания у инфузорий, их генетический контроль и способы наследования оказались весьма разнообразны. Есть варианты, где ТС непосредственно и однозначно определяется генами и их аллелями. Напротив, обнаружены примеры, где мультипотенциальный локус ТС претерпевает эпигенетическую дифференцировку, в результате которой фенотипически реализуется лишь одна из нескольких наследственных генотипических потенций (обзоры: Сигел, 1970; Sonneborn, 1977; Афонькин, 1991; Bleyman, 1996; Miyake, 1996). Конкретные механизмы эпигенетической дифференцировки по ТС у инфузорий остаются все еще неизвестными, их начинают исследовать на молекулярном уровне лишь в последнее время (Cervantes et al., 2013; Singh et al., 2014; Vallesi et al., 2014).

Особи D. anser, различающиеся по ТС, способны конъюгировать (вступать в половой процесс). После конъюгации два конъюганта расходятся, начинают питаться и размножаться делением надвое (агамное или вегетативное размножение) и образуют эксконъюгантные клоны, по два от каждой пары конъюгантов – синклон. Некоторое время у дилептусов эксконъюгантного клона, как и у многих инфузорий, клетки обычно являются сексуально незрелыми – они не способны спариваться с клетками комплементарных ТС и вступать в следующую конъюгацию (Bleyman, 1971, 1972; Nanney, 1980; Takagi, 1988). У них имеет место период незрелости (adolescent), когда они неспособны повторно вступать в половой процесс. Поэтому по классификации Соннеборна (Sonneborn, 1975) инфузория D. anser должна быть отнесена к тем видам инфузорий, основная стратегия которых – аутбридинг. У D. anser по нашим данным период незрелости длится в среднем около 15 нед (от 10 до 21 нед у разных клонов, т.е. приблизительно 50–70 клеточных делений), после чего, наступает кратковременный период частичной зрелости, а затем зрелость, когда клетки любого из трех ТС конъюгируют с клетками двух других комплементарных ТС (Тавровская 1977; Tavrovskaya, 1979; Успенская, Юдин, 2003). Как было отмечено выше, половой процесс запускают феромоны спаривания. То есть, дифференцировка по ТС у дилептусов связана с экспрессией генов, контролирующих выработку ФС и их рецепторов (Юдин и др., 1990). Сигнальная роль ФС, их роль в экспрессии генов, их взаимоотношения с другими сигнальными системами интенсивно изучаются на инфузориях Euplotes (Luporini et al., 2014a, 2014b).

Мы провели гибридологический анализ признака ТС у D. anser. Принадлежность клона к тому или иному ТС определяли, скрещивая этот клон с тремя зрелыми клонами-теcтерами (типы I, II и III), поддерживаемыми в лаборатории. В ходе агамного (вегетативного) размножения ТС клонов оставался неизменным. Например, клон 7С при ежемесячном тестировании на протяжении 24 мес. всегда проявлял ТС-I, клон 14 при тех же условиях – ТС-II, клон 155 на протяжении 19 мес. – ТС-III. Есть наблюдения за группой изолированных из природы клонов на протяжении 7 лет, которые свидетельствовали о сохранении за это время исходного ТС (Тавровская, 1989). Проведено 20 скрещиваний, и получены двоякого рода результаты. В некотором количестве скрещиваний наблюдали: 1) синклональное наследование признака в половых поколениях; 2) доминирование ТС-I над ТС-II и ТС-III, а ТС-II – над ТС-III; 3) расщепление по ТС, не отличающееся существенно от расщепления 1 : 1. То есть имело место более или менее очевидное менделирование монофакториального признака.

На этом основании была ранее предложена гипотеза о механизме генетического контроля признака ТС у D. anser (Юдин, Афонькин, 1987). Согласно этой гипотезе, признак ТС у инфузорий D. anser в половых поколениях контролируется одним локусом (обозначим его mat) с тремя аллелями, обнаруживающими по отношению друг к другу серийное доминирование: mat¹ > mat² > mat³. Синклональное наследование и менделирование в скрещиваниях свидетельствует о прямом генном контроле признака (Сигел, 1970). Подобные результаты были описаны при изучении наследования и генетической детерминации ТС у инфузории Tetrahymena pigmentosa (Orias, 1963; Simon, 1980). Итак, оказалось, что системы генетической детерминации и наследования ТС для “нормальных” эксконюгантных клонов у T. pigmentosa и для “нормальных” клонов D. anser выглядят весьма сходными. В обоих случаях у вида имеются три ТС, наследующихся при конъюгации синклонально и таким образом, как если бы они контролировались одним локусом с тремя аллелями, обнаруживающими серийное доминирование. Однако в упомянутых данных имелись оставшиеся без объяснения отклонения от этой схемы, которые выражались, в частности, в избытке сегрегантов типа II в скрещиваниях и в наличии небольшой фракции клонов-селферов (Orias, 1963).

Вместе с этим мы наблюдали в ряде проведенных скрещиваний более или менее существенные отклонения от предложенной схемы – обнаружены аномальные особенности эксконъюгантных клонов, которые заключалась в следующем. При исследовании потомства F₁ и F₂ двух клонов: клона Б (TС-I) и клона Д (TC-III) зарегистрирована задержка созревания по сравнению с другими клонами. Наблюдался временный возврат из зрелого состояния в незрелое, либо в частично зрелое – “юношеское” состояние, т.е. наблюдалась нестабильность состояния зрелости. Параллельно отмечали смену ТС (иногда неоднократную) у одного и того же недавно созревшего клона, в результате у него мог появиться ТС, вообще не ожидавшийся в потомстве от данного скрещивания, а у отдельных клонов поочередно проявлялись даже все три ТС. Причины, определяющие нестабильность дифференцировки ТС у D. anser могут иметь очень разную природу, нельзя исключить и эпигенетическую компоненту наследственного контроля ТС, предположенную ранее (Nanney, 1958, 1980; см. также: Jablonka, Lamb, 1999; Meyer, Chalker, 2007).

Исходя из этих данных, была предложена гипотеза о том, что локус mat, контролирующий три ТС у дилептусов, имеет сложную комплексную природу, т.е. содержит генетические потенции для всех трех ТС (Yudin, Uspenskaya, 2007). В ходе созревания эксконъюгантного клона этот сложный локус претерпевает в макронуклеусе эпигенетическую дифференцировку, в результате которой экспрессируется та или иная из трех генетических потенций этого локуса, т.е. возникает та или иная эпиаллель этого локуса, определяющая тот или иной ТС. Эти предположения объясняют изменения ТС у молодых эксконъюгантных клонов, а также те или иные отклонения от менделевского поведения признака в скрещиваниях.

Менделевское же поведение признака ТС, очевидно, возможно лишь в тех случаях, если сложный локус mat способен дифференцироваться в генеративном ядре микронуклеусе, в результате чего возникает та или иная микронуклеальная аллель (или в зависимости от механизма дифференцировки, эпиаллель) этого локуса: mat¹, mat² или mat³. Каковы бы ни были в нашем случае конкретные молекулярные механизмы эпигенетических изменений и их наследования, можно представить себе, что ТС у дилептусов находятся под контролем сложного локуса, кодирующего потенции для всех трех ТС, встречающихся у этого вида. Этот локус наследуется как целое и сохраняет свою сложность в макронуклеусе. Однако он способен претерпевать эпигенетическую дифференцировку по принципу взаимного исключения (Nanney, 1958), в результате которой активируется только одна из трех закодированных в нем генетических потенций, а две другие остаются неактивными. В результате такой дифференцировки возникают три эпиаллели этого сложного локуса, определяющие ТС-I, ТС-II или ТС-III.

Степень стабильности такой дифференцировки может по непонятным причинам варьировать. Если дифференцировка стабильна, эпиаллели функционально ведут себя как обычные аллели генетического локуса, возникающие мутационным путем – имеет место обычное менделирование признака с серийным доминированием, монофакториальным расщеплением и др. Если же эпигенетическая дифференцировка локуса более или менее нестабильна, то возможно переключение активности сложного локуса с одной потенции на другую – своего рода эпимутации. При этом может нарушаться картина обычного менделирования – отношения доминантности и рецессивности между эпиаллелями, характер расщепления и т.п. Нарушение контроля дифференцировки в силу не совсем понятных причин приводит к нестабильности экспрессируемого ТС у созревающих эксконъюгантных клонов и нарушениям регулярного менделирования.

АКТИНОМИЦИН D КАК ЭПИМУТАГЕН У ПРОТИСТОВ

Возникал естественный вопрос – как долго сохраняется нестабильное состояние молодых эксконъюгантных клонов. Нельзя было исключить, что эти клоны, заканчивая процесс дифференцировки своего макронуклеуса, утрачивают все генетические потенции по ТС, кроме одной, стабилизируются и далее стабильно наследуют свой ТС. В этом случае макронуклеусы молодых эксконъюгантных клонов и макронуклеусы зрелых клонов в отношении признака ТС генетически различны, и зрелые клоны дилептусов не способны дестабилизироваться и изменять свой ТС в ряду вегетативных поколений. Напротив, если детерминация ТС имеет эпигенетическую природу, зрелые клоны могут сохранять в своих макронуклеусах генетические потенции для всех трех ТС и способны изменить свой ТС.

Подтверждением этого предположения явилась возможность вызвать изменения ТС у старых, давно ведущихся в лаборатории клонов, воздействием антибиотика актиномицина D. Ранее было установлено, что актиномицин D является индуктором наследуемой нестабильности по целому ряду контролируемых ядром признаков у другого вида простейших – у амеб Amoeba proteus, имеющих по многим критериям эпигенетическую природу (Калинина, 1968; Оленов, 1970; Юдин, 1979, 1982). Известно, что этот антибиотик не является мутагеном в общепризнанном смысле (см. обзор: Koba, Konopa, 2005). В экспериментальной клеточной биологии актиномицин D широко известен как ингибитор транскрипции. Подавление происходит вследствие образования стабильного комплекса его с ДНК и нарушения ДНК-зависимого синтеза РНК (Hollstein, 1974; Sobell, 1985). Данных о мутагенной активности актиномицина D почти нет; если он и является мутагеном, то очень слабым (Fishbein, et al., 1970; Fishbein, 1979; Koba, Konopa, 2005).

При постановке экспериментов нами была выбрана рабочая концентрация актиномицина D 15 мкг/мл, при которой выживали 75% обработанных клеток при 100% выживаемости в контрольный условиях (Успенская, Юдин, 1996; Юдин, Успенская, 2009). Использовали три клона, ведущихся в лаборатории – 3 (ТС-I), 13 (ТС-II) и 153 (ТС-III). Дилептусы находились в растворе антибиотика 3 сут, затем их отмывали, рассаживали поодиночке и далее культивировали субклоны как обычно. Всего было выращено по 20 субклонов каждого клона, которые затем тестировали по ТС с клетками исходных клонов еженедельно на протяжении 4 мес. В ходе тестирования устанавливали ТС субклона, либо его незрелость (отсутствие mating-реакции с любым из клонов-тестеров), либо частичную зрелость (mating-реакция только с одним каким-либо клоном-тестером). Результаты показали, что субклоны всех трех клонов вели себя сходным образом. У части клонов возникало временное, более или менее длительное состояние незрелости, некоторые клоны обнаруживали ТС, не свойственный исходному клону, а также переключение в процессе наблюдения на все возможные у дилептусов ТС (Uspenskaya, Yudin, 2017). Результаты этих экспериментов доказывают, что у дилептусов, стабильно воспроизводящих в ходе вегетативного размножения один какой-то ТС, в макронуклеусах сохраняются генетические потенции для проявления двух других известных у этого вида ТС – потенции, которые в определенных условиях или после определенных воздействий могут активироваться. Механизм такой активации остается неизвестным. С другой стороны, весьма вероятно, что актиномицин D, подавляя синтез РНК и соответственно белков, может нарушать нормальные регуляторные связи в эпигенетических контурах и тем самым приводить к наследуемым изменениям, в частности, “эпимутациям”, к дестабилизации эпигенетически контролируемых признаков. В таких случаях актиномицин D может рассматриваться как эпимутаген, по аналогии с другими агентами, индуцирующими наследуемые изменения немутационной природы (Holliday, Ho, 2002; Малецкая и др., 2006; Lamparska et al., 2012; Arai et al., 2015). Интересно также, что у двух совершенно разных видов простейших – амеб и инфузорий – актиномицин D с высокой частотой вызывает эпигенетические изменения (Юдин, Успенская, 2009; Uspenskaya, Yudin, 2017).

Что касается возможных молекулярных механизмов эпимутагенного действия актиномицина D, то этот вопрос очевидно связан с вопросом о молекулярных механизмах эпигенетической дифференцировки и трансдифференцировки по ТС у D. anser, которые пока остаются неизвестными. Тот факт, что у давно культивируемых в лаборатории клонов D. an-ser, неизменно экспрессирующих один из возможных ТС, в определенных условиях могут обратимо экспрессироваться и другие ТС, свидетельствует по нашему мнению, что у дилептусов в период созревания дифференцировка макронуклеусов по ТС не может происходить по механизму делеций и сплайсинга ДНК сложного локуса mat (Orias, 1981; Cervantes et al., 2013). В целом картина генетического контроля ТС у инфузории D. anser оказалась достаточно сложной и нуждается в дальнейшей разработке. Наш анализ наследования серотипов и ТС во многом не отвечает строгим требованиям генетического анализа. Это, к сожалению, неизбежно при работе с видом, который не стал широко известной лабораторной моделью. Однако попытка воспроизвести на этом объекте эффекты, полученные ранее на других инфузориях, оказалась оправданной, поскольку получены новые, не описанные ранее явления (Uspenskaya, 2018). Можно утверждать с полным основанием, что имеется еще одна очень полезная и удачная модель – инфузория Dileptus anser – для исследования эпигенетической изменчивости и наследственности у инфузорий.