Цитология, 2019, T. 61, № 7, стр. 564-570

Фармакокинетика двух форм рекомбинантного инсулиноподобного фактора роста 1 в крови мышей

И. В. Духовлинов 1, О. А. Добровольская 2, И. В. Евсюков 1*, Е. Г. Богомолова 2, Н. Н. Колмаков 2, А. А. Луковенко 3, Е. А. Фёдорова 3, С. А. Ищук 2, А. И. Орлов 4, Е. В. Воробейчиков 5, А. С. Симбирцев 2

1 ООО “АТГ Сервис Ген”
199034 Санкт-Петербург, Россия

2 Институт Экспериментальной Медицины
197376 Санкт-Петербург, Россия

3 ООО “Биохимический Агент”
190005 Санкт-Петербург, Россия

4 ООО “Дакра Медикал”
197101 Санкт-Петербург, Россия

5 ООО “Полифарм”
197101 Санкт-Петербург, Россия

* E-mail: evsyukov007@mail.ru

Поступила в редакцию 04.04.2019
После доработки 22.04.2019
Принята к публикации 24.04.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

В работе рассматривается фармакокинетика двух субстанций, содержащих в качестве активного вещества рекомбинантный инсулиноподобный фактор роста 1 (ИФР1). Первая субстанция (ИФР1) содержит собственно рекомбинантный ИФР1, вторая (ИФР2) – ИФР1, транслируемый с плазмидной ДНК, кодирующей ген этого белка IGF-1. Установлено, что при внутримышечном введении ИФР1 время задержки его поступления в кровоток составляет 1.5–2 ч, а ИФР2 – 24–25 ч. Это свидетельствует о наличии различных механизмов накопления данных веществ в системном кровотоке. Максимальное значение концентраций ИФР1 в крови определяется через 5 ч после введения, ИФР2 – через 125 ч после введения. Максимальные значения концентраций этих веществ сопоставимы между собой. Концентрация ИФР1 в крови снижается до исходного значения через 12 ч после его введения, а концентрация ИФР2 – через 216 ч. Параметры клиренса (Cl) и константы элиминации (Kel) рассматриваемых субстанций также имеют существенные различия, что подтверждает наличие быстрой и медленной динамики снижения их максимальных концентраций после внутримышечного введения. Различная динамика накопления субстанций в крови и их элиминация из кровотока после введения, а также различные значения параметров площади под фармакокинетической кривой (AUCt, AUC) демонстрируют, что ИФР2 более продолжительное время находится в системном кровотоке, чем ИФР1. Это имеет существенное значение для формирования и выраженности фармакодинамических эффектов.

Ключевые слова: фармакокинетика, инсулиноподобный фактор роста, рекомбинантный белок, плазмидная ДНК, ген IGF-1, внутримышечное введение

Способность чужеродной ДНК осуществлять синтез кодируемых ею белков применяется в фундаментальной науке, медицине и биотехнологии (Davis et al., 1996; Tsurumi et al., 1997; Romero et al., 2002). Например, при внутримышечном введении плазмидной ДНК, содержащей белок-кодирующий ген под контролем промотора, происходит поглощение ее мышечными клетками, которые индуцируют синтез этого белка (Wolff et al., 1990). В условиях in vivo процесс синтеза белка увеличивает время его накопления в системном кровотоке, что пролонгирует взаимодействие его молекул со специфическими рецепторами (Bonadio et al., 1999). Поэтому медленная кинетика изменений концентрации этого класса веществ в кровотоке представляется перспективной для терапии заболеваний, т.к. длительный процесс накопления и снижения активного вещества в крови повышает выраженность фармакодинамического эффекта.

Инсулиноподобный фактор роста 1 (ИФР1), является важным эндокринным медиатором действия гормона роста (Laviola et al., 2008; O’Kusky, Ping, 2012; Dyer et al., 2016). Этот белок воздействует на все виды клеток, в том числе на нейроны, стимулирует их пролиферацию, дифференцировку и выживаемость, способен проникать в головной мозг при интраназальном, внутривенном и внутримышечном путях введения (Reinhardt et al., 1994; Nishijima et al., 2010). Это демонстрирует возможность его применения для терапии нейродегенеративных заболеваний (Liu et al., 2001; Kooijman et al., 2009; Bake et al., 2014). Однако, ИФР1, при указанных путях введения, имеет быструю динамику поступления и выведения из кровотока, что может снижать его комплаентность и терапевтическую эффективность.

Одним из путей улучшения его фармакокинетических параметров, обеспечивающих медленную динамику изменений его концентраций в крови после введения, является применение субстанции ИФР2 (Духовлинов и др., 2017). Однако вид фармакокинетических моделей, которые с достаточной точностью описывают динамику изменений концентраций ИФР2, синтезируемого in vivo мышечными клетками, не определен, что не позволяет оценить его основные фармакокинетические параметры.

Целью настоящей работы является сравнительная оценка фармакокинетики субстанций ИФР1 и ИФР2 в крови мышей.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Для оценки фармакокинетических показателей использовали субстанцию ИФР2 представляющую собой ИФР1, транслируемый с плазмидной ДНК, кодирующей ген этого белка IGF-1. В качестве вещества сравнения использовали субстанцию на основе рекомбинантного ИФР1 (ИФР1).

Наработка очищенного раствора плазмидной ДНК. Музейная культура штамма Escherichia coli/pCIGF представляет собой ночную бульонную культуру, полученную трансформацией штамма E. coli DH10 B (Thermo Fisher Scientific, США) рекомбинантной плазмидной ДНК pCIGF и выращенную из отдельной колонии на среде Луриа−Бертани (LB) с добавлением ампициллина до конечной концентрации 100 мкг/мл. Культивирование вели при температуре 37°С и частоте вращения мешалки от 50 до 250 об./мин, обеспечивающей насыщение культуры кислородом не менее 30%, до достижения оптической плотности 20–40 ед., после чего осуществляли сепарирование биомассы, которая и являлась биологической субстанцией для выделения pCIGF.

Очистку плазмидной ДНК проводили по методу, предложенному Хорн с соавторами (Horn et al., 1995). Затем применяли только реактивы фармакопейной чистоты (pharmaceutical) и свободную от ЛПС деионизированную воду. Работу проводили в стерильных условиях. ДНК растворяли в буферном растворе для хроматографии, которую проводили на оборудовании ÄKTAexplorer (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция) при скорости протока жидкости 0.75 мл/мин. Фракции, содержащие не менее 50% суперскрученной формы плазмидной ДНК, объединяли. ДНК осаждали этанолом и повторно наносили на колонку SR 50/100 (Amersham Phаrmacia Biotech, Швеция), наполненную Sephacryl S-1000. Объединяли фракции, содержащие не меньше 90% суперскрученной формы плазмиды. ДНК осаждали этанолом и ресуспендировали в физиологическом растворе хлорида натрия.

Для оценки качества pCIGF использовали анализ изменения оптической плотности (А) в диапазоне длин волн 200–300 нм. Для этого проводили серию измерений оптической плотности с шагом 10 нм. Далее строили график зависимости оптической плотности от длины волны. При этом соотношения А260нм/А280нм и А260нм/А230нм характеризовали чистоту плазмидной ДНК и, соответственно, были не меньше 1.8–1.75.

Контроль структуры плазмидной ДНК оценивали при помощи электрофореза. При этом содержание суперскрученной формы плазмиды в растворе было не менее 95%, а присутствие РНК не детектировали. Контроль идентичности целевого гена проводили секвенированием. Содержание в растворе бактериального эндотоксина определяли LAL-тестом. Раствор плазмидной ДНК хранили при 4°С в защищенном от света месте.

Выделение и очистка рекомбинантного ИФР-1. Клетки E. coli BL21, трансформированные плазмидой pET28-IGF-1, выращенные в условиях индукции синтеза белка лактозой, осаждали центрифугированием при 10 000 g. Осадок ресуспендировали в однократном физиологическом растворе PBS в соотношении 5 мл на 1 г влажной биомассы, после чего клетки разрушали с помощью генератора ультразвуковых волн (Heidolph Sonik 100, Германия) и центрифугировали при 10  000 g в течение 12 мин при 4°С. Полученный осадок ресуспендировали в исходном объеме промывочного раствора, содержащего 2 М мочевины, 20 мМ Tris-HCl рН 7.6, инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем центрифугировали 10 000 g в течение 12 мин при температуре 4°С. Супернатант удаляли, осадок отмытых телец включения растворяли в солюбилизирующем растворе (8 М мочевина, 20 мМ Tris-HCl рН 8.0).

Рефолдинг проводили разбавлением солюбилизированного белка в 8 раз раствором, содержащем 20 мМ Tris-HCl рН 8.0, 0.01% Tween 20, после чего фильтровали через фильтр с размером пор 0.2 мкм. Полученный раствор наносили на металлохелатную колонку объемом 5 мл (His-Trap Chelating), уравновешенную стартовым буфером (20 мМ Tris рН 8.0, 0.01% Tween 20). Использовали хроматограф Discovery 100 (Bio Rad, США). После промывки колонки 10 объемами стартового буфера элюцию сорбированного белка проводили в градиенте имидазола (0–200 мМ) в стартовом буфере. Фракции, содержащие целевой белок, объединяли, доводили рН раствора белка до значения 8.8 добавлением 10 мМ NaOH и повторно фильтровали через фильтр 0.2 мкм. Раствор белка наносили на колонку с SP Sepharose Fast Flow GE Healthcare, уравновешенную стартовым буфером 2 (20 мМ Tris-HCl рН 8.8, 0.01% Tween 20). После нанесения и промывки колонки стартовым буфером 2 элюцию белка проводили в линейном градиенте NaCl. Фракции, содержавшие целевой белок, объединяли и диализовали против 1-кратного PBS. Содержание в растворе бактериального эндотоксина определяли LAL-тестом. Раствор белка хранили при температуре –20°С с добавлением глицерина до 10%.

Изучение фармакокинетики субстанций ИФР1, ИФР2 в крови мышей. В экспериментах использовали мышей линии Balb\C весом 16 г, которые были получены из питомника РАМН “Рапполово” Ленинградской области. Животных содержали в условиях вивария при искусственном освещении. Рацион животных состоял из гранулированного корма и питьевой воды ad libitum. Основные правила содержания и ухода соответствовали “Санитарным правилам по содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)”, утвержденным МЗ СССР 06.07.73 г. и Приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.77, а также правилам, принятым Европейской конвенцией по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986 г.). Номер ветеринарного регистрационного удостоверения 78-07095 от 31.05.2016. Эвтаназию мышей и взятие образцов крови проводили методом декапитации, когда животные достигали бессознательного состояния в результате их предварительного размещения в камере с СО2.

Животным группы 1 (32 животных) внутримышечно и однократно вводили препарат ИФР1 в дозе 100 мкг на мышь. Взятие образцов крови проводили до введения препарата (контроль) и после его введения через 1, 2, 4, 6, 8, 10 и 12 ч. В каждой временной точке взятие крови осуществляли у 4-х животных. Животным группы 2 (174 животных) внутримышечно и однократно вводили препарат ИФР2 в той же дозе, что и ИФР1 (100 мкг на мышь). Взятие образцов крови проводили до введения препарата (контроль) и после его введения в 57 временных точках, находящихся в интервале 216 ч. В каждой временной точке взятие крови осуществляли у 3-х животных.

В полученных образцах крови определяли концентрацию ИФР1 методом иммуноферментного анализа (Human IGF-I ELISA Kit, Sigma-Aldrich, США). Для оценки зависимости изменений концентрации ИФР1 и ИФР2 ([ИФР1] и [ИФР2] соответственно) в крови животных от времени (t), прошедшего после их введения, использовали некомпартментный подход на основе нелинейного регрессионного анализа (Draper, Smith, 2016). В этом случае фармакокинетический профиль исследуемых препаратов базируется на получении зависимостей в виде: [ИФР1](t) и [ИФР2](t) соответственно с последующим определением интеграла от начального момента времени до бесконечности, что соответствует площади под фармакокинетической кривой (AUCt, AUC) и позволяет рассчитать основные фармакокинетические параметры.

В работе использовали следующие реактивы: вектор рЕТ28а(+) (Novagen, США); электрокомпетентные клетки Escherichia coli DH10 B (Thermo Fisher Scientific, США) и электрокомпетентные клетки Escherichia coli BL21 Star (DE3) (Invitrogen, США); среду LB (Thermo Fisher Scientific, США); Sephacryl S-1000, имидазол, гидроксид натрия, фосфатный буфер PBS и Tween-20 (Sigma, США); ампициллин (Gibco, США); глицерин и трисгидрохлорид (Panreac, Испания); лактозу (AppliChem, Германия); мочевину (Вектон, Россия); металлохелатную колонку His-Trap Chelating и колонку SP Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, США); хлористый натрий (Вектон, Россия); LAL-тестовую систему (GeneScript, США), human IGF-I ELISA Kit (Sigma-Aldrich, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В табл. 1 и 2 представлены статистические характеристики коэффициентов для нелинейных регрессионных моделей, описывающих изменения концентрации ИФР1 в крови мышей после внутримышечного введения субстанций в равных дозах в виде:

(1)
$\left[ {{\text{И Ф }}{{{\text{Р }}}_{{\text{1}}}}} \right]\left( t \right) = {{A}_{0}} + {{A}_{1}}{{t}^{P}}{\text{exp}}\left( {--t/tau} \right)$
и
(2)
$\left[ {{\text{И Ф }}{{{\text{Р }}}_{{\text{2}}}}} \right]\left( t \right) = {{A}_{0}} + {{A}_{1}}{{\left( {t/tau} \right)}^{P}}^{1}{\text{exp}}\left( {--{{{\left( {t/tau} \right)}}^{P}}^{2}} \right),$
где: А0, А1, P, P1, P2 и tau – коэффициенты для выражений (1) и (2), полученные на основе методов нелинейной регрессии (Draper, Smith, 2016); t – время (ч), прошедшее после введения субстанции.

Таблица 1.  

Статистические параметры коэффициентов для выражения (1)

Коэффициент Значение
коэффициента
Ошибка
коэффициента
95%-ный доверительный интервал
нижняя граница верхняя граница
A0 0.185 0.019 0.124 0.246
A1 0.016 0.008 –0.009 0.042
P 5.307 0.661 3.204 7.410
tau 0.997 0.119 0.618 1.375
Таблица 2.

Статистические параметры коэффициентов для выражения (2)

Коэффициент Значение
коэффициента
Ошибка
коэффициента
95%-ный доверительный интервал
нижняя граница верхняя граница
A0 0.199 0.006 0.187 0.211
A1 0.897 0.057 0.783 1.010
P1 2.327 0.201 1.923 2.732
tau 147.234 3.648 139.910 154.559
P2 5.0 0.503 4.343 6.362

Коэффициент корреляции (r) между экспериментальными и расчетными значениями составил для [ИФР1] 0.998 (P < 0.01), а для [ИФР2] – 0.987 (P < 0.01). Результаты расчетов показывают, что между экспериментальными и расчетными значениями концентраций исследуемых субстанций установлены высокие и статистически значимые коэффициенты корреляции. Это означает, что для описания изменений в крови животных концентраций [ИФР1] и [ИФР2] при их внутримышечном однократном введении могут использоваться выражения (1) и (2), которые обладают достаточной информативностью. Графическая интерпретация выражений (1) и (2) представлена на рис. 1а и 1б соответственно.

Рис. 1.

Зависимость изменений концентрации субстанций ИФР1 (а) и ИФР2 (б) в крови мышей линии Balb/C после их внутримышечного введения. Сплошная линия – расчетные значения концентрации препарата, полученные на основе нелинейной регрессии. Квадраты – экспериментальные значения концентрации препарата.

Результаты на рис. 1 демонстрируют, что до введения ИФР1 и ИФР2 (при t = 0) в крови животных определяются фоновые значения инсулиноподобного фактора роста, концентрации которых не равны 0 и находятся на уровне 0.19–0.20 мкг/мл. Наличие в крови ненулевых концентраций инсулиноподобного фактора роста ограничивает применение традиционных камерных фармакокинетических моделей, которые базируются на предположении об отсутствии концентраций веществ в крови до их введения. Поэтому необходимо использовать нелинейные регрессионные модели в виде выражений:

(3)
$\left[ {{\text{И Ф }}{{{\text{Р }}}_{1}}} \right](t) = 0.185 + 0.016{{t}^{{5.307}}}{\text{exp}}(--t/0.997)$
и
(4)
$\begin{gathered} \left[ {{\text{И Ф }}{{{\text{Р }}}_{{\text{2}}}}} \right](t) = \\ = 0.199 + 0.897{{(t/147.234)}^{{2.327}}}{\text{exp}}(--{{(t/147.234)}^{{5.0}}}), \\ \end{gathered} $
где: [ИФР1] и [ИФР2] концентрации препаратов, мкг/мл; t – время (ч), прошедшее после введения препаратов.

Дальнейший анализ изменений в крови [ИФР1] показывает, что через 1 ч после введения ИФР1 значения концентраций остаются на уровне фона и только через 1.5–2 ч происходит увеличение концентрации субстанции в кровотоке, которая достигает максимума через 5 ч ([ИФР1]max = 0.728 мкг/мл). Это означает, что при внутримышечном введении ИФР1 в интервале 1.5–2 ч отмечается распределенная во времени задержка его поступления в кровоток. Анализ изменений в крови концентраций ИФР2 показывает, что распределенная во времени задержка его поступления в кровоток имеет более выраженные значения и находится в интервале 24–25 ч. Через 25 ч после введения ИФР2 наблюдается медленная динамика увеличения его концентрации в крови, которая достигает максимума через 125 ч ([ИФР2]max = = 0.576 мкг/мл).

Установленные различия во времени задержки поступления ИФР1 и ИФР2 в кровоток и различия в динамике повышения их концентраций до максимальных значений достаточно очевидны, что свидетельствует о существовании различных механизмов накопления этих субстанций в крови животных после введения. Однако полученные максимальные значения концентраций [ИФР1]max и [ИФР2]max сопоставимы между собой.

Снижение значений [ИФР1] происходит через 6 ч после введения субстанции и достигает почти исходных значений через 12 ч эксперимента. Снижение значений [ИФР2] отмечается через 127 ч после введения субстанции и достигает фоновых значений через 216 ч эксперимента. Соответственно продолжительность временного интервала снижения максимальных значений составляет lkz [ИФР1] 6 ч, а для [ИФР2] – 89 ч. Это указывает на наличие значительно более медленной динамики элиминации ИФР2, чем ИФР1, из крови животных после внутримышечного введения.

В табл. 3 представлены отдельные фармакокинетические параметры ИФР1 и ИФР2 после их однократного внутримышечного введения.

Таблица 3.

Фармакокинетические параметры препаратов ИФР1 и ИФР2 после однократного внутримышечного введения в дозе 100 мкг

Параметр Значение параметра
ИФР 1 ИФР 2
AUCt, мкг/мл/ч 5.156 42785.21
AUC, мкг/мл/ч 11.03 93035.21
MRT, ч 2.139 2.174
Сl (клиренс), мл/ч 19.39 0.002
Vd, мл 497.51 505.05
Kel (константа элиминации) 0.039 0.000004

Примечание. AUCt, AUC – площадь под фармакокинетической кривой, MRT – среднее время удержания субстанций в крови животных, Vd – кажущийся объем распределения субстанций.

Результаты расчетов фармакокинетических параметров в табл. 3 показывают, что среднее время удержания субстанций в крови животных (MRT) и кажущийся объем распределения субстанций (Vd) имеют сходные значения, которые не зависят от способа их получения и механизма их накопления в системном кровотоке.

Параметры клиренса (Сl) и константы элиминации (Kel) ИФР1 имеют более высокие значения, чем аналогичные характеристики ИФР2. Это означает, что выведение ИФР2 из кровотока происходит значительно медленнее, чем ИФР1 и указывает на наличие различных механизмов их элиминации. Вместе с тем, быстрая и медленная динамика элиминации исследуемых субстанций демонстрирует отсутствие выраженного эффекта их накопления в системном кровотоке после однократного внутримышечного введения.

Параметры площади под фармакокинетической кривой (AUCt, AUC) ИФР2 значительно превосходят аналогичные показатели ИФР1 – в 8557 раз и в 8457 раз соответственно. Это подтверждает наличие различных механизмов накопления исследуемых субстанций в крови и их элиминации. Несмотря на сопоставимые значения параметра MRT, полученные достаточно высокие значения показателей AUCt и AUC у ИФР2 указывают на его более продолжительное время нахождения в системном кровотоке и, соответственно, более продолжительное время его контакта с определенными рецепторами. Это может иметь весьма существенное значение для развития и поддержания специфических фармакодинамических эффектов, выраженность которых предполагается определить на следующем этапе исследования.

Выводы. 1) Различия во времени задержки поступления в кровоток субстанций ИФР1 и ИФР2 после их внутримышечного введения указывают на различные механизмы накопления данных субстанций в системном кровотоке. 2) Максимальное значение концентрации ИФР1 определяется через 5 ч после внутримышечного введения, а ИФР2 – через 125 ч. Максимальные значения концентрации ИФР1 (0.728 ~ 0.70 мкг/мл) и ИФР2 (0.576 ~ 0.60 мкг/мл) сопоставимы между собой. 3) После внутримышечного введения снижение концентрации ИФР1 происходит через 5 ч и достигает исходных значений через 12 ч, а ИФР2 – через 127 ч после введения и достигает исходных значений через 216 ч. Параметры клиренса (Сl) и константы элиминации (Kel) исследуемых субстанций также имеют существенные различия, что подтверждает наличие быстрой и медленной динамики снижения их максимальных концентраций после внутримышечного введения. 4) Различная динамика накопления исследуемых субстанций в крови и их элиминации из кровотока, а также различные значения параметров площади под фармакокинетической кривой (AUCt, AUC) показывают, что субстанция, содержащая ИФР1, транслируемый с плазмидной ДНК, более продолжительное время находится в системном кровотоке, чем субстанция, содержащая в чистом виде рекомбинантный ИФР1. Это имеет существенное значение для формирования и выраженности фармакодинамических эффектов.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выпонена при финансовой поддержке компании ООО “Дакра Медикал”.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Все эксперименты с животными выполнены в соответствии “Санитарными правилами по содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)”, утвержденным МЗ СССР 06.07.73 г. и Приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.77, а также правилам, принятым Европейской конвенцией по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986 г.). Номер ветеринарного регистрационного удостоверения 78-07095 от 31.05.2016.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Список литературы

  1. Духовлинов И.В., Богомолова Е.Г., Добровольская О.В., Федорова Е.А., Кляус А.М., Ищук С.А., Климов Н.А., Симбирцев А.С. 2017. Продукция in vivo инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1), кодируемого плазмидной ДНК. Мед. академ. журнал. 17(3) : 47–52. (Dukhovlinov I.V., Bogomolova E.G., Dobrovolskaya O.A., Fedorova E.A., Klyaus A.M., Ischuk S.A., Klimov N.A., Simbirtsev A.S. 2017. Production of insulin-like growth factor 1 (IGF-1) encoded by plasmid DNA in vivo. Med. Acad. J. (Russ.) 17(3) : 47–52).

  2. Bake S., Selvamani A., Cherry J., Sohrabji F. 2014. Blood brain barrier and neuroinflammation are critical targets of IGF-1-mediated neuroprotection in Stroke for Middle-Aged Female Rats. PLoS ONE. 9 : e91427. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091427

  3. Bonadio J., Smiley E., Patil P., Goldstein S. 1999. Localized, direct plasmid gene delivery in vivo: Prolonged therapy results in reproducible tissue regeneration. Nat. Med. 5 : 753–759.

  4. Davis H.L., McCluskie M.J., Gerin J.L., Purcell R.H. 1996. DNA vaccine for hepatitis B: Evidence for immunogenicity in chimpanzees and comparison with other vaccines. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 : 7213–7218.

  5. Draper N.R., Smith H. 2016. Applied regression analysis. Wiley. 3rd ed. 736 p.

  6. Dyer A.H., Vahdatpour C., Sanfeliu A., Tropea D. 2016. The role of insulin-like growth factor 1 (IGF-1) in brain development, maturation and neuroplasticity. Neurosci. 325 : 89–99.

  7. Horn N.A., Meek J.A., Budahazi G., Marquet M. 1995. Cancer gene therapy using plasmid DNA: purification of DNA for human clinical trials. Hum Gene Ther. 6 : 565–573.

  8. Kooijman R., Sarre S., Michotte Y., De Keyser J. 2009. Insulin-like growth factor I a potential neuroprotective compound for the treatment of acute ischemic stroke? Stroke. 40 : e83–e88. https://doi.org/10.1161/STROKEAHA.108.528356

  9. Laviola L., Natalicchio A., Perrini S., Giorgino F. 2008. Abnormalities of IGF-I signaling in the pathogenesis of diseases of the bone, brain, and fetoplacental unit in humans. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 295 : E991–E999.

  10. Liu X.F., Fawcett J.R., Thorne R.G., Frey W.H. 2001. Non-invasive intranasal insulin-like growth factor-I reduces infarct volume and improves neurologic function in rats following middle cerebral artery occlusion. Neurosci. Letters. 308 : 91–94.

  11. Nishijima T., Piriz J., Duflot S., Fernandez A.M., Gaitan G., Gomez-Pinedo U., Verdugo J.M., Leroy F., Soya H., Nuñez A., Torres-Aleman I. 2010. Neuronal activity drives localized blood-brain-barrier transport of serum insulin-like growth factor-I into the CNS. Neuron. 67 : 834–846.

  12. O’Kusky J., Ping Y. 2012. Neurodevelopmental effects of insulin-like growth factor signaling. Front. Neuroendocrinol. 33 : 230–251.

  13. Reinhardt R.R., Bondy A. 1994. Insulin-like growth factors cross the blood-brain barrier. Endocrinol. 135 : 1753–1761.

  14. Romero N.B., Benveniste, O., Payan C., Braun S., Squiban P., Herson S., Fardeau M. 2002. Current protocol of a research phase I clinical trial of full-length dystrophin plasmid DNA in Duchenne/Becker muscular dystrophies. Part II: Clinical protocol. Neuromus. Disord. 12 (Suppl. 1) : S45–S48.

  15. Tsurumi Y., Kearney M., Chen D., Silver M., Takeshita S., Yang J., Symes J.F., Isner J.M. 1997. Treatment of acute limb ischemia by intramuscular injection of vascular endothelial growth factor gene. Circulation. 96 (Suppl. 9) : 382–388.

  16. Wolff J.A., Malone R.W., Williams P., Chong W., Acsadi G., Jani A., Felgner P.L. 1990. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science. 247 : 1465–1468.

Дополнительные материалы отсутствуют.