Цитология, 2019, T. 61, № 9, стр. 735-739

Основные свойства злокачественности – инвазия и метастазирование – реализуются благодаря разрушению межклеточного матрикса. В этом процессе принимают участие металлопротеиназы, активация которых вызвана подкислением межклеточного пространства, обусловленного переходом опухолевых клеток с тканевого дыхания на гликолиз. Переключение на гликолиз в опухолевых клетках происходит не только в условиях гипоксии, что наблюдается и в нормальной ткани, но и при оксигенации. Впервые этот эффект описал в 20-х гг. прошлого столетия Отто Варбург (Warburg, 1924) и поэтому аэробный гликолиз называют “эффект Варбурга”. Основным элементом переключения клеток на гликолиз и продвижения клеток в сторону опухолевой прогрессии является транскрипционный фактор HIFα. Эффективность образования АТФ при гликолизе намного меньше, чем при окислительном фосфорилировании. При окислении одной молекулы глюкозы при митохондриальном дыхании образуются 34 молекулы АТФ, а при гликолизе – только две. Недостающую энергию опухоль компенсирует усилением активности ферментов гликолиза, в первую очередь, транспортера глюкозы, что приводит к увеличенному потреблению глюкозы опухолью и истощению организма. Поэтому в процессе жизнедеятельности энергообеспечение опухолевых клеток может стать узким местом их функционирования.

Переход опухолевых клеток на гликолиз в большинстве случаев не связан с нарушением митохондриальных функций (Seyfried, Shelton, 2010). Показано, что онкобелки (продукты мутированных онкогенов) ответственны за опухолевую трансформацию и являются активаторами эффекта Варбурга благодаря стабилизации в опухоли транскрипционного фактора HIFα, который стимулирует гликолиз и ингибирует транспорт пирувата в митохондрии (Kobliakov, 2018). Одним из современных подходов к разработке новых методов лечения опухоли является ингибирование гликолиза. Ведутся исследования по использованию в качестве противоопухолевых препаратов ингибиторов различных стадий гликолиза.

Показано, что 2-дезоксиглюкоза, лонидамин, 3‑бромпируват, которые ингибируют гексокиназу, фосфорилирующую глюкозу с образованием глюкозо-6-фосфата, тормозят рост экспериментальных опухолей, а в некоторых случаях приводят к их полному рассасыванию (Di Cosimo et al., 2003; Huang et al., 2015; Lis et al., 2018). Однако при сохранении функционирующей дыхательной цепи митохондрий ингибирование гликолиза вызывает переключение превращения глюкозы с гликолиза на окислительное фосфорилирование. Поэтому в качестве противоопухолевой терапии предлагается одновременное ингибирование гликолиза и митохондриального дыхания. В качестве ингибитора митохондриального дыхания используется метформин. Это соединение блокирует перенос электронов в первом комплексе дыхательной цепи митохондрий. (Menendez et al., 2012; Zhuang et al., 2014) и является соединением, допущенным к использованию в медицинской практике. Совместное действие метформина и ингибитора гликолиза 2-дезоксиглюкозы вызывает апоптоз в культуре опухолевых клеток простаты LNCaP (Sahra et al., 2010).

Особое место среди ингибиторов окислительного фосфорилирования занимают вещества различной структуры, но имеющие общее свойство диссоциироваться в биологических средах. Эти соединения носят название “разобщители” дыхания и фосфорилирования. Они являются липофильными слабыми кислотами с константой диссоциации (рК) в интервале рН 4.0–7.0. (Terada, 1990). Эти соединения нарушают протонный градиент на внутренней мембране митохондрий, необходимый для синтеза АТФ, что вызывает ускоренное, без образования АТФ, потребление кислорода в дыхательной цепи митохондрий. В результате происходит падение межмембранного потенциала и активация митохондриальной АТФазы, что приводит к нехватке АТФ в клетке. Низкий уровень АТФ и высокие уровни АДФ и АМФ стимулируют активацию АМР-киназы (АМРК) и ингибирование киназы мТОР (Lim et al., 2009). Одной из функций мТОР является стимуляция процесса трансляции благодаря активации трансляционных факторов elf4E и S6K. Уменьшение активности мТОР вызывает падение уровня фактора HIFα (Hsu et al., 2013) и уменьшение гликолиза.

Разобщители дыхания и фосфорилирования нашли применение в методиках лечения ожирения (Grundlingh et al., 2011). В настоящее время разобщители исследуются как возможные противоопухолевые агенты. В то же время у известных противоопухолевых препаратов есть свойства разобщителей и поэтому обсуждается возможность механизма их противоопухолевого действия именно как разобщающее. Например, у противоопухолевого препарата неморозон (nemorosone) выявлено свойство разобщителя и предполагается, что его противоопухолевое действие связано с этим его свойством (Pardo-Andreu et al., 2011). Исследование действия на противоопухолевую активность разобщителей, таких как FCCP (carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) (Han et al., 2009), никлозамиде (niclosamide) (Kumar et al., 2018) и других показало, что они обладают способностью тормозить рост экспериментальных опухолей, как в культуре клеток, так и в экспериментах in vivo.

В процессе роста опухоли важное значение имеет скорость роста сосудов для снабжения опухоли кислородом и питательными веществами. В нетрансформированных клетках взрослого организма клетки эндотелия не растут, потребление ими кислорода и необходимость в энергии у них незначительна. В опухолевой ткани при быстром ее росте необходим рост сосудов, поставляющих в опухоль питательные вещества и кислород. Показано, что в эндотелиальных клетках опухоли потребление кислорода в 3 раза выше, чем в нормальных тканях и соответственно резко увеличивается потребление энергии. Одним из аспектов противоопухолевого действия разобщителей является ингибирование роста сосудов (Coutelle et al., 2014).

Одним из наиболее изучаемых разобщителей является 2,4-динитрофенол (ДНФ). Это соединение было первым веществом, идентифицированным как разобщитель. История применения ДНФ в качестве лекарственного средства уходит в 30-ые г. 20-го в., когда его впервые использовали в качестве средства для похудения (Tainter et al., 1935). В настоящее время синтезировано несколько типов разобщителей, применяемых в лечении ожирения.

При исследовании клеток в культуре ДНФ вызывал гибель опухолевых клеток благодаря усилению апоптоза и активации АМРК (Han et al., 2008). Однако информации по изучению противоопухолевого действия ДНФ на животных нет. Чтобы устранить этот пробел, в настоящей работе изучали действие ДНФ на рост аденокарциномы молочной железы мышей Ca755.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Узелки на месте перевивки опухоли Ca755 появлялись почти одновременно во всех группах на 6-е сут эксперимента. Пальпируемые опухоли начинали определяться через 20 сут после перевивки во всех трех группах животных (рис. 1). Через 29 сут после перевивки у животных, получавших обе дозы ДНФ, опухоли едва прощупывались, а в контрольной группе размер опухоли составлял уже 5 см³. На 32-е сут эксперимента средний размер опухоли в контрольной группе и в группе, получавшей 800 мг/мл ДНФ, стал одинаковым. Начиная с 36-х сут эксперимента опухоль в группе, получавшей 800 мг ДНФ, стала расти быстрее, чем в контрольной группе. В группе животных, получавшей 200 мг/мл ДНФ, средний размер опухоли был меньше, чем в контрольной группе на всем протяжении эксперимента. Усиление роста опухоли на средних и поздних стадиях эксперимента при действии большой дозы ДНФ (800 мг мг/л), видимо, связано с его общим токсическим действием на организм.

Рис. 1.

Действие 2,4-динитрофенола (ДНФ) на скорость роста опухоли молочной железы Ca755 у мышей. Опухоль перевита подкожно. ДНФ в концентрации 200 и 800 мг/л давали мышам с питьевой водой. К – контрольные животные. Достоверное различие между раз-мером опухоли в группе К и в группе, получавшей с питьевой водой ДНФ в концентрации 200 мг/л, наблюдали на 29-е сут (Р < 0.05).

Токсический эффект ДНФ может быть связан как с энергетическим истощением организма ввиду распада АТФ, так и с повышением температуры организма. Распад АТФ при действии разобщителей, в том числе и ДНФ, сопровождается выделением тепла и разогреванием организма. Показано, что температура тела при действии ДНФ может повыситься до 43°С (Grundlingh et al., 2011). Ускоренный транспорт протонов без образования АТФ через мембрану митохондрий вызывает каскад биохимических реакций, дающих как геномный так и негеномный эффект. Происходит уменьшение образования активных форм кислорода в дыхательной цепи митохондрий (Miwa et al., 2003), что влечет за собой уменьшение уровня кальция в митохондриях и активацию циклической АМФ (Geisler, 2019).

Одним из элементов противоопухолевой защиты в клетке является опухолевый супрессор р53 (Bieging et al., 2014). В большинстве опухолей происходят инактивирующие мутации в структуре гена-супрессора р53 (Stiewe, Haran, 2018), что приводит к ускорению роста опухоли и меньшей чувствительности к действию цитостатиков. Сравнительное исследование по действию разобщителя никлозамида на рост перевиваемых опухолей с мутацией в гене р53 и без нее продемонстрировало, что клетки опухоли с мутацией в гене р53 более чувствительны к токсическому действию разобщителя, чем клетки, в которых ген р53 находился в нативном состоянии (Kumar et al., 2018). Авторы считают, что этот эффект связан с тем, что под действием разобщителя происходит увеличение цитоплазматического кальция, а в отсутствии р53 увеличенный уровень кальция вызывает активацию фосфолипазы А2 (Lin et al., 1992). Происходит образование арахидоновой кислоты из липидов, которая стимулирует активацию каспаз 3 и 9, выхода цитохрома С и апоптоз (Kumar et al., 2018).

Полученные нами результаты говорят о том, что ДНФ действует на рост опухоли примерно так же, как и ранее исследованные другие вещества со свойствами разобщения. По-видимому, этот класс соединений вряд ли найдет применение в монотерапии, но благодаря уменьшению уровня АТФ в клетках опухоли должно происходить ослабление функционирования Р-гликопротеинов – белков, способствующих выбросу цитостатиков из клетки. Для функционирования Р-гликопротеинов требуется большое количество АТФ, поэтому совместное действие ингибиторов гликолиза и митохондриального дыхания усилит действие цитостатиков. В этой связи будущие исследования должны проводиться на моделях с использованием разобщителей в сочетании с другими веществами (цитостатитками).

Другой путь использования разобщителей связан с совместным введением их с ингибиторами гликолиза. Вызванная разобщителями нехватка АТФ в опухолевых клетках, требующих постоянного притока энергии для своего роста, не может быть восполнена за счет гликолиза, что приводит или к прекращению роста опухоли, или к апоптозу (Bost et al., 2016). Совместное использование ингибиторов гликолиза и митохондриального дыхания дает обнадеживающие результаты (Cheong et al., 2011) в дальнейшем поиске комбинации этих двух классов ингибиторов.