Цитология, 2019, T. 61, № 9, стр. 740-749

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Модель принудительного плавания и схема эксперимента. Все эксперименты проводили в соответствии с “Правилами проведения работ с подопытными животными”, утвержденными комиссией по этике Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН (Санкт-Петербург). Крыс-самцов линии Вистар весом 210 ± 20 г содержали в стандартных условиях вивария и предварительно адаптировали к воде при температуре воды 32°С в течение 5 сут. На 6-е сут проводили тестирование крыс с грузом, вес которого составлял 7% от веса тела. Тестирование заключалось в плавании крыс по 3 мин с интервалом 1 мин при температуре воды 28°С до полного утомления. Седьмой день 1-, 2- и 3-й нед. цикла принудительного плавания был выходным. Препараты вводили, начиная со 2-й нед. эксперимента. В течение пяти дней 2- и 3-й нед. крыс подвергали нормированной нагрузке: плавание по 3 мин с интервалом 1 мин при температуре воды 28°С с грузом 7% от веса тела, общая продолжительность плавания составляла 50–60% от показателей тестирования. На 6-й день 2-й и 3-й нед. проводили промежуточное тестирование. В течение 4-х дней 4-й нед. эксперимента крысам давали предельную нагрузку; условия и критерии утомления те же, что и при тестировании. На пятый день 4-й нед. эксперимента, т.е. через 1 сут после окончания цикла плавательной нагрузки, животных умерщвляли посредством декапитации гильотиной, после чего извлекали мышцы SOL и EDL.

Группы животных. По результатам тестирования формировали 6 групп: контрольную группу (интактные животные) (1), группы ХА (2) и КА (3) – плавание на фоне введенного перорально КА или ХА соответственно в дозе 10 мг на 1 кг массы тела животного за 5 мин до начала плавательной нагрузки; группу ЭЗЧ (4) – плавание на фоне введенного перорально водного раствора препарата ЭЗЧ в дозе 12 мг/кг в пересчете на катехины за 2 ч до нагрузки и через 2 ч после окончания нагрузки (суточная доза катехинов 24 мг/кг); группу ЭЗЧ + ХА (5) – плавание на фоне введенного ЭЗЧ в сочетании с ХА и группу ЭЗЧ + КА (6) – плавание на фоне ЭЗЧ в сочетании с КА. Объем вводимых за один раз растворов одному животному не превышал 1 мл ЭЗЧ и 0.3 мл соли аммония.

Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ). Для проведения ТЭМ образцы ткани мышц крыс фиксировали в 2.5%-ном растворе глутаральдегида на какодилатном буфере pH 7.4, содержащем 0.15 М сахарозы, постфиксировали в 1%-ном растворе OsO₄ и после постепенного обезвоживания в ряду спиртов и ацетона заключали в смесь Эпона и Аралдита. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB III (Швеция) с помощью стеклянных ножей. Срезы помещали на медные сетки, контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе LIBRA 120 Carl Zeiss (Германия). При морфометрическом исследовании в анализ брали только продольные срезы миоцитов. У каждого животного анализировали по 10–20 полей зрения. Все морфометрические показатели (среднюю площадь митохондрий, объемную плотность митохондрий, площадь просветов и количество Т-трубочек) определяли с помощью программы для анализа изображений “ImageJ”, используя электронограммы, отснятые при увеличении 5000×.

Статистическая обработка данных. Статистическую обработку данных проводили с использованием программ Microsoft Excel 2007 и SigmaPLot 11.0. Для каждого параметра рассчитывали среднее значение и ошибку среднего. Достоверность отличий оценивали, используя t-критерий Стьюдента. Различия считали значимыми при уровне достоверности 95% (P < 0.05). Различия при уровне достоверности в 90% не считали значимыми, но отмечали как тенденцию к изменению.

Использованные реактивы: препарат ЭЗЧ (Sunphenon 90D, Taiyo International Inc., США), глутаральдегид, какодилатный буфер, четырехокись осмия, смесь аралдитов, метиленовый синий и толуидиновый синий (Sigma-Aldrich, США), уранилацетат (Polysciences Inc., США), ХА, КА, ацетон, цитрат свинца (Вектон, Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Электронно-микроскопическое (ТЭМ) и морфометрическое исследования медленной SOL и быстрой EDL мышц крыс, выполнявших нормированную и предельную нагрузку в разработанной нами модели принудительного плавания и получавших препараты ЭЗЧ и солей аммония, позволили выявить значительные изменения митохондриального аппарата крыс. Они проявлялись, в первую очередь, в увеличении средней площади митохондрий в обеих мышцах почти во всех группах крыс (рис. 1а). В мышцах SOL крыс группы ЭЗЧ средняя площадь митохондрий увеличивалась на 25.5% по сравнению с контролем, а в группе ЭЗЧ + КА – на 17.5%. В группах КА и ХА отличий от контроля в мышцах SOL не было, а в группе ЭЗЧ + ХА средняя площадь митохондрий уменьшалась на 17%.

Рис. 1.

Параметры митохондрий по данным электронно-микроскопического исследования миоцитов медленных (SOL) и быстрых (EDL) мышечных волокон крыс. а – Средняя площадь отдельных митохондрий (СПМ, мкм²), б – объемная плотность митохондрий (ОПМ, %). Все величины выражены как среднее значение и их ошибка. Отличие от контроля (К) достоверно (*) при P < 0.05. Группы ХА и КА – плавание на фоне введенного перорально КА или ХА соответственно в дозе 10 мг/кг за 5 мин до начала плавательной нагрузки; группа ЭЗЧ – плавание на фоне вводимого перорально водного раствора ЭЗЧ в дозе 12 мг/кг в пересчете на катехины за 2 ч до нагрузки и через 2 ч после окончания нагрузки; группы ЭЗЧ + ХА и ЭЗЧ + КА – плавание на фоне вводимого препарата ЭЗЧ дважды в день в сочетании с ХА или КА, введенных в дозе 10 мг/кг за 5 мин до начала нагрузки.

В мышцах EDL выявлены более значительные изменения средней площади митохондрий. В группах ХА и ЭЗЧ + КА встречаются митохондрии, вытянутые на длину одного–двух саркомеров (рис. 2), так что средняя площадь митохондрий в мышцах EDL этих групп превышает контроль на 42 и 110% соответственно (рис. 1а). Объемная плотность митохондрий в мышцах SOL и EDL большинства групп не отличается от контрольных значений, но в мышцах SOL группы ЭЗЧ + ХА она снижена относительно контроля на 50%. В мышцах же EDL в группе ЭЗЧ объемная плотность митохондрий снижается на 64%, а в группе ЭЗЧ + КА – повышается на 87% (рис. 1б).

Рис. 2.

Электронно-микроскопические фотографии (ТЭМ) миоцитов мышц EDL крысы после плавательной нагрузки: а – контрольная группа; б, в – соответственно группа ХА (плавание на фоне введения ХА) и группа ЭЗЧ+КА (плавание на фоне вводимых ЭЗЧ и КА). Стрелками указаны митохондрии, СМ – саркомеры. На снимках б, в видны гигантские митохондрии, образовавшиеся в результате слияния (fusion) митохондрий меньших размеров. ТЭМ. Увеличение 5000×.

Помимо изменений митохондриального аппарата, в некоторых группах крыс выявлены изменения тубулярной системы мышечных волокон. Проанализированы изменения площади просветов Т-трубочек, их общее количество на единицу площади цитоплазмы и ориентированность относительно оси клетки. Как и в случае с митохондриями, наибольшие отличия от группы интактного контроля выявлены в ультраструктурных изменениях мышечных волокон EDL. В группе ЭЗЧ + ХА и особенно в группе КА отмечено значительное расширение Т-трубочек, площадь их просветов увеличена в 1.5 и 2 раза соответственно (рис. 3а, рис. 4). При этом количество Т-трубочек на единицу площади цитоплазмы (на 100 мкм²) в мышцах EDL группы КА снижено на 18%, а в группе ЭЗЧ + ХА увеличено на 19% (рис. 3б). Уменьшение числа Т-трубочек на 31% относительно контроля отмечено в миоцитах SOL крыс группы ЭЗЧ (рис. 3б).

Рис. 3.

Параметры Т-тубулярной системы по данным электронно-микроскопического исследования миоцитов медленных (SOL) и быстрых (EDL) мышечных волокон крыс : а – средняя площадь просветов поперечных Т-трубочек (мкм²), б – число Т-трубочек на 100 мкм² площади цитоплазмы. Все величины выражены как среднее значения и их ошибки. Отличия от контроля достоверны (*) при P < 0.05. Объяснения названий групп даны в подписи к рис. 1.

Рис. 4.

Электронно-микроскопические фотографии миоцитов мышц EDL крысы после плавательной нагрузки. а – Контрольная группа; б – группа КА (плавание на фоне введения КА). Стрелками указаны Т-трубочки. В контроле видны классические триады – структуры ЭМС, образовавшиеся в результате прямого взаимодействия (сопряжения) дигидропиридиновых рецепторов, расположенных на Т-трубочках (светлые “отверстия” посредине), и рианодиновых рецепторов, расположенных в мембранах саркоплазматического ретикулума (темные пятна с двух сторон Т-трубочек). В мышцах EDL группы КА (б) вокруг расширенных Т-трубочек можно видеть до 5 темных пятен, что свидетельствует о повышенном сопряжении дигидропиридиновых и рианодиновых рецепторов в составе структур ЭМС. ТЭМ. Увел.: 12 500×.

При анализе ультраструктуры миоцитов мы также обращали внимание на ориентированность Т-трубочек – поперечно и продольно ориентированные Т-трубочки, поскольку в группах крыс ХА и КА заметно увеличено количество продольно перерезанных Т-трубочек, причем в местах, где наблюдаются разрывы мышечных волокон. В миоцитах SOL не выявлены изменения ориентированности Т-трубочек (рис. 5а). В миоцитах EDL крыс групп КА и ХА увеличено число продольных Т-трубочек на 54 и 66% соответственно (рис. 5б, рис. 6), что является следствием повреждения мышечных волокон EDL.

Рис. 5.

Доля Т-трубочек, расположенных продольно и поперечно относительно плоскости среза, в миоцитах SOL (а) и EDL (б) крыс. Данные ТЭМ. Все величины выражены как средние значения и их ошибка; отличия от контроля достоверны (*) при P < 0.05. Названия групп см. в подписи к рис. 1.

Рис. 6.

Электронно-микроскопические фотографии миоцитов мышц EDL крысы после плавательной нагрузки. а – контрольная группа; б – группа КА (плавание на фоне введения КА). Сплошными стрелками указаны поперечно ориентированные Т-трубочки, штриховыми – продольно ориентированные Т-трубочки. В мышечных волокнах крыс группы КА наряду с обычными поперечно ориентированными Т-трубочками видны продольно ориентированные Т-трубочки, расположенные в местах разрывов мышечных волокон или рядом с ними. ТЭМ. Увел.: 5000×.

ОБСУЖДЕНИЕ

Механизмы формирования мышечного утомления при интенсивной физической нагрузке и восстановление мышечной функции – важнейшие проблемы современной биохимии и физиологии. В настоящее время не существует единой теории утомления мышц, работающих в условиях целостного организма. Исследования молекулярно-клеточных механизмов ЭМС способствовали формированию представлений о значительной роли в развитии утомления субклеточных структур мышечных волокон (Т-трубочек, митохондрий, саркоплазматического ретикулума, миофибрилл), посттрансляционных изменений рецепторов, ионных каналов и регуляторных белков (Allen et al., 2008; Debold, 2015; Huang et al., 2016). Деполяризация мембраны скелетного мышечного волокна вызывает высвобождение ионов кальция, депонированных в саркоплазматическом ретикулуме, за счет сопряжения (прямого взаимодействия) дигидропиридиновых рецепторов, локализованных на мембране Т-системы, с рианодиновыми на мембране ретикулума, т.е. за счет механизма индуцированного деполяризацией высвобождения ионов кальция (DICR) с последующей активацией сократительного аппарата (Marty, Fauré, 2016). Однако механизм DICR в скелетных мышцах не является жестко детерминированным и при определенных условиях (контрактура, тетанус, утомление, гипоксия, оксидативный стресс и др.) в них может работать механизм кальций-индуцированного высвобождения ионов кальция (CICR) (Nasledov et al., 2007; Endo, 2009).

В научной литературе очень мало данных о взаимосвязи механизмов регуляции кальция и ультраструктурных характеристик медленных и быстрых мышц, полученных в рамках одной экспериментальной модели физической нагрузки и утомления. В одной из наших работ была прослежена связь между экспрессией генов, ответственных за синтез основных белков регуляции баланса ионов кальция (CASQ1, SERCA1, SERCA2, RyR1, CACNA1), и ультраструктурными характеристиками быстрых (EDL) и медленных (SOL) скелетных мышц крыс в условиях продолжительной физической нагрузки (Корф и др., 2017а). В этой работе мы не обнаружили у крыс в мышцах SOL после цикла принудительного плавания изменений уровня транскрипции исследованных генов, но зато выявили разрывы мышечных волокон, слияние митохондрий (fusion, мегаконию) наряду с их распадом (fission, плейокония) и деградацией (вакуолизацией и апоптозом). Более выраженные изменения в экспрессии исследованных генов были выявлены в мышцах EDL, в которых адаптация к нагрузкам связана главным образом с усилением системы откачки ионов Са²⁺ из саркоплазмы и удержания их в цистернах саркоплазматического ретикулума, где главным буфером кальция является кальсеквестрин (Корф и др., 2017а).

Однако ультраструктурный анализ с помощью электронной микроскопии также выявил множественные разрывы мышечных волокон и деградацию митохондрий без очевидных признаков их слияния. У крыс, получавших ЭЗЧ и демонстрировавших бóльшую работоспособность, не только в EDL, но и в SOL выявлено статистически значимое повышение экспрессии генов CASQ1, SERCA1, SERCA2, RyR1, CACNA1 (Корф и др., 2017б). Следовательно, применение ЭЗЧ приводит к повышению выносливости за счет дополнительного участия в работе медленных мышц, адаптация которых связана с повышением экспрессии всех исследованных генов, ответственных за регуляцию баланса ионов Са²⁺. Повышение экспрессии генов RyR1 и CACNA1 не только в быстрых, но и в медленных мышцах при употреблении ЭЗЧ свидетельствует об эффективном развитии структур ЭМС в обоих типах мышц. В отличие от “аварийной” адаптации мышц к нагрузке за счет механизма выведения кальция из цитозоля и удержания его в ретикулуме (и, вероятно, в митохондриях), адаптация при содействии ЭЗЧ связана с повышением контроля над мобилизацией кальция благодаря повышению сопряжения в системах возбуждение–сокращение (структуры ЭМС) и возбуждение–метаболизм (аэробная и анаэробная генерация АТФ в митохондриях и саркоплазме) (Schönekess et al., 1995; Gehlert et al., 2015).

Проведенное в настоящей работе морфометрическое исследование мышц SOL и EDL крыс, получавших препараты ЭЗЧ и солей аммония на фоне нагрузок в модели принудительного плавания, позволило выявить изменения показателей митохондрий (их средней площади и объемной плотности), расширение Т-трубочек, изменения их числа на единицу площади цитоплазмы и их ориентированности по отношению к плоскости среза в основном за счет увеличения числа продольно ориентированных Т-трубочек. Наиболее значительные изменения по всем определяемым параметрам выявлены в быстрых мышцах EDL, тогда как среди групп наиболее значительные изменения в этих мышцах выявлены в группе ЭЗЧ + + КА по параметрам митохондрий, в группах КА и ЭЗЧ + ХА – по средней площади и количеству Т‑трубочек, в группах КА и ХА – по продольно ориентированным Т-трубочкам. Если сопоставить эти данные с интегральным показателем эффективности того или иного препарата – продолжительностью плавания, то наблюдается следующая зависимость. У крыс группы ЭЗЧ, показавших минимальный прирост продолжительности плавания в последний день предельной нагрузки по сравнению с первичным тестированием (10–20%, Р > 0.05), адаптация к физической нагрузке происходит главным образом за счет увеличения средней площади митохондрий и в меньшей степени – за счет их объемной плотности в медленных мышцах SOL, притом что в быстрых мышцах EDL оба показателя уменьшаются (Р < 0.05). Адаптивные изменения обусловлены подключением к работе медленных мышц, быстрые мышцы функционируют за счет гликолиза, но очевидно без перегрузки, т. к. образующийся лактат своевременно покидает мышцы EDL и служит “быстрым топливом” для мышц SOL. Участие эритроцитов в этой челночной передаче лактата, по всей видимости, минимальное.

У крыс группы ХА, показавших чуть более высокий прирост продолжительности плавания (15–25%, Р > 0.05), адаптация обусловлена увеличением средней площади митохондрий в мышцах EDL, при этом средняя площадь Т-трубочек уменьшается. В этих же мышцах у крыс группы ХА статистически значимо увеличивается доля продольно ориентированных Т-трубочек наряду с разрывами мышечных волокон. Отсюда следует, что адаптивные изменения в мышцах EDL группы ХА обусловлены интенсификацией процессов анаэробного и аэробного окисления глюкозы и лактата в быстрых мышцах, экспорт лактата минимальный, он утилизируется преимущественно in situ, степень развития структур ЭМС уменьшается, что приводит к повышенной мобилизации ионов кальция по механизму CICR. Эритроциты участвуют в захвате и транспортировке лактата, но скорее в качестве “буферной емкости”, а не челнока.

Следующим по эффективности препаратом является комплекс ХА + ЭЗЧ, который обусловил прирост продолжительности плавания в пределах 20–50% (Р < < 0.05), что свидетельствует об аддитивном действии двух компонентов этого комплекса (напомним, что эти компоненты вводятся раздельно, так что название “комплекс” является условным). Аддитивность функционального эффекта структурно обеспечивается, во-первых, увеличением средней площади и объемной плотности митохондрий в мышцах EDL, но с некоторым уменьшением этих параметров в мышцах SOL; во-вторых – увеличением средней площади Т-трубочек в мышцах SOL и особенно EDL, а также увеличением их числа в мышцах EDL. А в-третьих, при этом не происходит увеличения доли продольно ориентированных Т-трубочек, что означает сохранение целостности быстрых мышечных волокон при их повышенной функциональной готовности. Лактатная емкость эритроцитов у крыс этой группы, по-видимому, более высокая по сравнению с крысами группы ХА, но основными потребителями лактата являются все же быстрые мышцы.

Далее по степени эффективности следует комплексное действие КА + ЭЗЧ (прирост продолжительности плавания 30–60%, Р < 0.05). Однако для лучшего понимания сути ультраструктурных изменений, выявленных в мышечных волокнах этой группы крыс, сначала опишем эти изменения в мышцах крыс группы КА, показавших максимальный прирост продолжительности плавания (40–90%, Р < 0.05). В группе КА, в отличие от группы ХА, максимальный функциональный эффект обусловлен адаптивными изменениями исключительно в структурах ЭМС: максимально выраженным увеличением средней площади Т-трубочек в мышцах EDL и не столь выраженным, но увеличенным числом Т-трубочек в мышцах SOL. При этом доля продольных Т-трубочек в мышцах EDL, а значит и разрывов мышечных волокон, возрастает (P < 0.05). Это означает, что адаптация к нагрузке только за счет митохондрий (группа ХА) или только за счет структур ЭМС (группа КА) приводит к перенапряжению и срыву адаптации. Разница в том, что функциональная готовность и порог чувствительности мышечных волокон EDL существенно выше в группе КА, что свидетельствует о ведущей роли структур ЭМС в развитии силовой выносливости, не обеспечивающей, однако, своевременного восстановления мышечных волокон в условиях предельной физической нагрузки. Лактатная емкость эритроцитов у крыс группы КА, на наш взгляд, еще более высокая по сравнению с крысами группы ХА, но основными потребителями лактата остаются быстрые мышцы.

Возвращаясь к группе крыс КА + ЭЗЧ, нетрудно заметить, что по функциональной готовности эта группа показала аддитивный эффект со знаком минус: немногим хуже, чем группа КА, но существенно лучше, чем группа ЭЗЧ. При этом мы выявили выраженные адаптивные изменения митохондриального аппарата в медленных и особенно в быстрых мышцах наряду с незначительными, но значимыми изменениями структур ЭМС, причем разнонаправленными: увеличение средней площади Т-трубочек в мышцах SOL сочетается с уменьшением площади и числа Т-трубочек в мышцах EDL. В то же время никаких изменений доли продольных и поперечных волокон не было выявлено. Это может свидетельствовать о важности митохондриального аппарата в аэробной утилизации лактата и в быстрых, и в медленных мышцах, что предотвращает их перенапряжение и (или) своевременное восстановление при выполнении субмаксимальной нагрузки. Подключение к работе медленных мышц и дополнительное развитие в них митохондриального аппарата дает возможность эритроцитам не только накапливать и транспортировать избыток лактата, но и оптимальным образом его “перераспределять” в работающих мышцах.

Таким образом, наиболее эффективными препаратами, способствующими адаптации скелетных мышц к предельным физическим нагрузкам, следует считать “комплексы”, сочетающие в себе малые дозы солей аммония (хлорида или карбоната) и ЭЗЧ в качестве нутрицевтика растительного происхождения, роль которого состоит в инициации адаптационной перестройки структур ЭМС и генерации энергии в медленных мышечных волокнах.