Цитология, 2020, T. 62, № 8, стр. 556-565
Морфофунциональная реакция Т-лимфоцитов при in vitro контакте с кальцийфосфатным покрытием в присутствии Т-клеточного активатора
Л. С. Литвинова 1, *, Е. С. Мелащенко 1, О. Г. Хазиахматова 1, К. А. Юрова 1, Ю. П. Шаркеев 2, 3, Е. Г. Комарова 3, М. Б. Седельникова 3, Н. М. Тодосенко 1, И. А. Хлусов 1, 4, 5
1 Центр иммунологии и клеточных биотехнологий Балтийского федерального университета им. И. Канта
236041 Калининград, Россия
2 Исследовательская школа физики высокоэнергетических процессов Томского политехнического университета
634050 Томск, Россия
3 Лаборатория физики наноструктурных биокомпозитов Института физики прочности и материаловедения СО РАН
634055 Томск, Россия
4 Кафедра морфологии и общей патологии Сибирского государственного медицинского университета
634050 Томск, Россия
5 Исследовательская школа химических и биомедицинских технологий Томского политехнического университета
634050 Томск, Россия
* E-mail: larisalitvinova@yandex.ru
Поступила в редакцию 17.04.2020
После доработки 24.04.2020
Принята к публикации 28.04.2020
Аннотация
Изучена морфофункциональная активность Т-лимфоцитов при in vitro контакте с КФ-покрытием в присутствии частиц с антителами к антигенам CD2, CD3 и СD28. Пластины из титана ВТ1-0 (10 × 10 × 1 мм3) с двусторонним микродуговым шероховатым (индекс Ra = 2–5 мкм) КФ-покрытием использовали в качестве модельных образцов минерального матрикса костной ткани. Магнитные частицы (MACSiBeadтм T-Cell Activation/Expansion Kit human) с антителами к антигенам CD2, CD3 и СD28 применяли как Т-клеточный активатор (ТКА), симулирующий сигналы антигенпрезентирующих клеток (АПК). Мононуклеарные клетки (МНК), выделенные из крови человека (98.8% клеток CD45CD3+), культивировали в присутствии образцов с КФ-покрытием и (или) ТКА (2 × 106 частиц в 1.5 мл питательной среды в пропорции c клетками 2 : 1) в течение 2-х и 14 сут. КФ-покрытие и ТКА синергично запускали адаптацию культуры МНК через механизмы гиперактивации и последующей гибели Т-лимфоцитов. Иммуноселекция была обусловлена накоплением наивных Т-лимфоцитов CD45RA+/RO+ и Т-клеток памяти с одновременным истощением пула Т-клеток CD4+ и CD8+. Изменение субпопуляций Т-лимфоцитов сопровождалось усилением (через 48 ч культивирования) секреторной активности клеток с последующим ее снижением к 14 суткам наблюдения. КФ-покрытие поддерживало (в сравнении с культурой клеток на пластике) секреторную способность лимфоцитов Th1 (IL-12, TNFα, IFNγ) и Th2 (IL-4, IL-6, IL-10, IL-13). В то же время, длительный сигнал ТКА после 48-часовой активации приводил к истощению секреции Т-клетками. Обсуждается предположение, что обнаруженные in vitro эффекты могут иметь значение в переключении сигналинга между Т-лимфоцитами, АПК и КФ-материалами на границе раздела клетка–инородное тело, исходом которого может быть смена фаз воспаления (регенерация), развитие иммунной толерантности, успешная остеоинтеграция имплантата или нарушение ремоделирования костной ткани.
Иммунокомпетентные клетки крови принимают непосредственное участие в процессах воспаления, ангио- и остеогенеза (Loi et al., 2016; Schell et al., 2017). Эти процессы, в конечном итоге, приводят к регенерации (ремоделированию) костной ткани, приживлению имплантата или, при неблагоприятном сценарии, к его отторжению вследствие остеолизиса. В отличие от продуктивного воспаления, протекающего в различных внутренних органах и завершающегося во взрослом организме, как правило, формированием рубца, гранулематозное воспаление в условиях физиологической или репаративной (после имплантации) регенерации в кости приводит к образованию новой костной ткани (Hoff et al., 2016). В связи с этим в последние годы сформировалась новая концепция, получившая название “остеоиммунология” (Arron, Choi, 2000; Greenblatt, Shim, 2013).
Однако публикационная активность в области исследования клеточно-молекулярных механизмов воспаления (регенерации) в костной ткани, индуцированных иммунокомпетентными клетками (Humbert et al., 2019), относится преимущественно к исследованиям in vitro с использованием стационарной двумерной (2D) культуры клеток.
2D-культивирование клеток применяется уже более 100 лет. Тем не менее, клеточные культуры, растущие на пластиковых поверхностях, не воспроизводят поведение клеток in vivo. Благодаря трехмерной (3D) пространственной симуляции реакция клеток в условиях in vitro значительно приближается к физиологическим параметрам жизнедеятельности (Коршунов, Кондакова, 2016).
Проблемой 3D-культивирования является создание трехмерных конструкций, максимально приближающихся по своим свойствам к природному экстрацеллюлярному матриксу (ЭЦМ) различных органов и тканей. В этом плане наиболее успешным технологическим решением в области имитации минерального вещества костной ткани являются кальцийфосфатные (КФ) материалы, успешно применяющиеся в эксперименте и клинике (Шаркеев и др., 2014).
Костная ткань находится в постоянном процессе ремоделирования (Fernández-Tresguerres-Hernández-Gil et al., 2006; Crockett et al., 2011) на основе механизмов физиологической или репаративной регенерации (Crockett et al., 2011). В последние годы преимущественное значение уделяется регуляторной роли различных субпопуляций макрофагов в кости и костном мозге: резидентным, так называемым остеомакрофагам (osteomacs), про- (М1) и противовоспалительным (М2) их подтипам (Loi et al., 2016; Batoon et al., 2017; Иванюк и др., 2018). В то же время, хоминг Т-лимфоцитов в зону повреждения происходит раньше моноцитов, приводит к их активации антигенпрезентирующими клетками (АПК) (Mitchell, 2004), что способствует привлечению инфильтрирующих макрофагов, необходимых для усиления воспаления и последующей регенерации (Yuan et al., 2019). Модулирование взаимодействия АПК и Т-клеток с помощью анти-CD2CD3CD28-частиц уже проводится in vivo в трансплантологии (Chavin et al., 1993). Тем не менее, не ясен длительный клеточно-молекулярный сигналинг между Т-лимфоцитами, АПК и КФ-материалами на границе раздела клетка–инородное тело, исходом которого является смена фаз воспаления и, соответственно, приживление или отторжение имплантата (Nepola, 1994).
В связи с вышесказанным, цель настоящей работы заключалась в изучении морфофункциональной активности Т-лимфоцитов при in vitro контакте с КФ-материалом в присутствии частиц с антителами к антигенам CD2, CD3 и СD28.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Образцы модельных матриксов. 3D-культуры клеток in vitro получали на пластинах из коммерчески чистого титана ВТ1-0 (10 × 10 × 1 мм3), несущего рельефное двустороннее КФ-покрытие (с индексом шероховатости поверхности Ra в пределах 2–5 мкм). КФ-покрытие формировали методом микродугового оксидирования с использованием установки Microarc-3.0 (Институт физики прочности и материаловедения СО РАН, г. Томск) в анодном режиме. Электролит состоял из водного раствора ортофосфорной кислоты (20 мас. %), карбоната кальция (9 мас. %) и синтетического гидроксиапатита (ГАП, 6 мас. %). Порошок ГАП с диаметром частиц 40–100 нм получен механохимическим способом. Получение и свойства микродугового КФ-покрытия описаны ранее (Khlusov et al., 2018).
Перед тестированием биологической активности изготовленные образцы стерилизовали в сухожаровом шкафу (Sanyo, Япония) при 160°С в течение 1 ч.
Выделение клеток. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли из лейковзвеси здорового донора (Заключение № 2 от 06.03.2017 г. Локального этического комитета; Инновационный парк Балтийского федерального университета им. И. Канта) стандартным методом центрифугирования в градиенте плотности (ρ = 1.077 г/см3) фиколл-урографин (Pharmacia, Швеция) с последующей двукратной отмывкой в фосфатном буфере. Жизнеспособность клеток после выделения составляла 96%.
Для получения культур МНК в концентрации 1 × 106 кл./лунку культивировали в 12-луночных планшетах (Orange Scientific, Бельгия) в 1.5 мл полной питательной среды ( все компоненты от фирмы Sigma-Aldrich, США), состоявшей из 90% среды α-MEM, 10% инактивированной (при 56°С в течение 30 мин) сыворотки крови эмбрионов коров, 0.3 г/л L-глютамина, 100 Ед/мл смеси пенициллина и стрептомицина. Культивирование проводили в течение 2-х и 14 сут при 37°С, во влажной атмосфере, содержащей 5% СO2. Контролем служила клеточная взвесь на пластике без добавления в лунку образца с КФ-покрытием (2D-культивирование). Для активационной модели в клеточную взвесь 1 раз добавляли 10 мкл (2 × 106) анти-биотиновых MACSiBeadтм магнитных частиц T-CellActivation/ExpansionKithuman с антителами к антигенам CD2, CD3 и СD28 (Miltenyi Biotec, Германия). Анти-биотиновые частицы MACSiBeadтм, нагруженные антителами, используются в качестве активатора для покоящихся Т-клеток, так как имитируют стимулирующий сигнал АПК. Соотношение МНК и активирующих частиц составляло 1 : 2. В длительной 14-суточной культуре осуществляли замену питательной среды каждые 3–4 сут.
После культивирования клеточную взвесь центрифугировали при 500 g в течение 15 мин. Клеточный осадок использовали для оценки апоптоза, некроза, презентации мембранных антигенов, надосадочную жидкость (супернатант) – для определения концентрации цитокинов.
Тестирование жизнеспособности клеток. Процентное соотношение живых и погибших (апоптотических и некротических) МНК и общее количество клеток в пробе определяли с помощью набора реагентов FITC ANNEXIN V (Abcam, США) методом проточной цитофлуориметрии на аппарате MACS Quant (MiltenyiBiotec, Германия).
Оценка иммунофенотипа (мембранных антигенов). Использовали метод проточной цитофлуориметрии (проточный цитофлуориметр MACS Quant (Miltenyi Biotec, Германия)), основанный на взаимодействии специфических моноклональных антител с кластерными детерминантами на клеточных мембранах, в соответствии с инструкцией производителя. Неприлипающие клетки отмывали фосфатным буфером (рН 7.2) и в объеме 50 мкл связывали их со стандартными моноклональными антителами, меченными флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), фикоэритрином (PE) или перидининовым белком хлорофилла (Per-CP) (Abcam, Великобритания; e-Bioscience, США), к маркерам CD3, CD4, CD8, CD45RO, CD45RA. После 15-минутной инкубации в фосфатном буфере с антителами клетки анализировали на проточном цитофлуориметре MACS Quant (Miltenyi Biotec, Германия). Оценивали параметры оранжевой, зеленой и красной флуоресценции в гейте изучаемых клеток, определяли долю клеток, презентирующих определенные антигенные детерминанты. Результаты цитометрического анализа анализировали с помощью программы KALUZA Analysis Software (Beckman Coulter, США).
Количественное определение цитокинов. Содержание интерлейкинов IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, интерферона IFN-g и фактора некроза опухоли TNF-α в клеточных супернатантах, полученных центрифугированием при 1000 g в течение 15 мин на холоду (4°С), оценивали методом проточной флюориметрии, используя двухлучевой лазерный автоматизированный анализатор (Bio-Plex Protein Assay System, Luminex 200, Bio-Rad, США). Все процедуры очищения, отмывки супернатантов из клеточных культур, а также связывания и обнаружения целевых цитокинов проводили с использованием коммерческой тест-системы Bio-Plex Pro Human cytokine Group II 21-Plex Panel (Bio-Rad, США), согласно коммерческому протоколу. Считывание результатов проводили на автоматическом анализаторе для микропланшетов Bio-Plex (Bio-Plex® Luminex 200 Systems, Bio-Rad, США) с использованием программы Bio-Plex Manager (Bio-Rad, США). Для каждого набора концентрацию исследуемого цитокина определяли по калибровочной кривой (определяемый динамический диапазон составлял 2–32 000 пг/мл) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.
Статистическая обработка результатов. Использовали программу IBM SPSS Statistics 20. При анализе имеющихся выборок данных использовали гипотезу нормальности распределения (Колмогорова−Смирнова). Для каждой выборки достоверность оценивали с помощью непараметрического критерияв Манна–Уитни (P), а также Т-критерия Вилкоксона (PT) для зависимых выборок. Различия считали достоверными при уровне значимости P < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Лейкоциты, мигрирующие из крови в ткани, секретируют различные про- и противовоспалительные цитокины, хемокины и факторы роста, чтобы привлечь другие клетки воспаления, стимулировать неоваскуляризацию, хемотаксис и дифференцировку стромальных стволовых клеток и, таким образом, регулировать в течение 2 нед. интенсивность острого и хронического воспаления (Loi et al., 2016), приводящего, в конечном итоге, к ремоделированию очага повреждения (Yuan et al., 2006; Barradas et al., 2011). При этом основная часть исследователей ограничивается изучением функциональной активности лейкоцитов в ранние сроки их культивирования in vitro.
В случае растянутой во времени (3–10 лет; Риггз и др., 2000) физиологической мозаичной регенерации кости в оптимальных условиях жизнедеятельности организма иммунокомпетентые клетки (прежде всего, Т-лимфоциты) малоактивны в тканях (Гольдберг и др., 1996). Для исследования закономерностей функционирования МНК в подобных условиях была разработана in vitro 3D-гомеостатическая модель сокультивирования иммунных клеток с искусственным ЭЦМ, имитирующим в трехмерном масштабе минеральное вещество костной ткани.
При репаративной регенерации включаются механизмы адаптации к экстремальному раздражителю, вызвавшему повреждение, и активируется локальное микроокружение, которое посредством гуморальных факторов способствует усиленной инфильтрации клетками крови (Гольдберг и др., 1996). Такую ситуацию мы экспериментально моделировали с помощью молекулярно-биологического подхода, названного активационной моделью и основанного на антиген-независимой активации Т-лимфоцитов, достигаемой добавлением в in vitro культуру МНК Т-клеточного активатора (ТКА: T-cell activation/expansion kit human), содержащего частицы с антителами к антигенам CD2, CD3, СD28, которые симулируют процесс стимуляции Т-клеток со стороны АПК. Для костной ткани применяли комбинацию гуморального сигнала АПК с 3D-матриксом, имитирующим минеральное вещество регенерирующей костной ткани.
Согласно полученным данным, при добавлении в культуру МНК частиц с антителами к антигенам CD2, CD3 и СD28 для активации и экспансии покоящихся Т-лимфоцитов (имитация сигналов АПК) через 2 сут культивирования значимо снижалась (на 7%) доля жизнеспособных клеток, что было обусловлено усилением их гибели путем апоптоза (на 0.9%) и некроза (на 4.5%) в сравнении с гомеостатической 2D-культурой (табл. 1).
Таблица 1.
Жизнеспособность (ЖС) неприлипающих МНК крови человека в различные сроки культивирования in vitro
| Показатель ЖС, % | Гомеостатическая модель культивирования клеток | Активационная модель культивирования | ||
|---|---|---|---|---|
| 1 (2D-культура) | 2 (3D-культура) | 3 (2D-культура) | 4 (3D-культура) | |
| 2 сут культивирования, n = 6 | ||||
| Живые клетки | 87.45 (84.62;88.55) |
70.20 (67.90; 71.00) 1P < 0.05 |
80.65 (80.17; 82.25) 1P < 0.05 |
64.95 (57.50; 69.90) 3P < 0.05 |
| Aпоптоз | 1.80 (1.25; 2.05) |
2.50 (2.40; 3.90) 1P < 0.05 |
2.70 (2.37; 3.35) 1P < 0.05 |
4.10 (3.10; 5.00) |
| Некроз | 11.05 (9.40; 13.82) |
26.90 (25.40; 28.20) 1P < 0.05 |
15.75 (15.00; 17.25) 1P < 0.05 |
31.25 (26.40; 36.00) 3P < 0.05 |
| 14 сут культивирования, n = 6 | ||||
| Живые клетки | 69.14 (55.00; 82.14) |
16.67 (15.38; 37.50) 1P < 0.05 |
90.35 (89.45; 90.40) 1P < 0.05 |
82.99 (81.57; 83.36) 2P < 0.05 3P < 0.05 |
| Aпоптоз | 13.58 (8.93; 13.75) |
12.50 (8.33; 15.38) |
5.80 (5.69; 6.18) 1P < 0.05 |
9.55 (9.11; 10.07) 3P < 0.05 |
| Некроз | 17.28 (8.93; 31.25) |
69.23 (50.00; 75.00) 1P < 0.05 |
3.80 (3.46; 4.86) 1P < 0.05 |
7.53 (6.94; 8.88) 2P < 0.05 3P < 0.05 |
Примечание к табл. 1–3. Данные проточной (цито)флуорометрии с использованием соответствующих моноклональных антител; n – число исследованных проб (лунок планшета); для каждой группы вычисляли средневыборочные характеристики: медиану (М), первый и третий квартили (Q1 и Q3). 1P, 2Р, 3Р – статистические различия с клеточной культурой 1, 2, 3 соответственно (U-критерий Манна−Уитни).
Тем не менее, общая клеточность культуры возрастала с 2.97 × 105 кл./мл до 5.41 × 105 кл./мл (в 1.8 раза; P < 0.05). Как следствие, повышенная гибель неприлипающих МНК в ранние сроки культивирования на фоне прироста клеточной популяции была расценена как известный феномен “смерть клетки через гиперактивацию” (Massanella et al., 2010). Она может быть связана с клеточной адаптацией к неоптимальным условиям жизнедеятельности (Браун, Моженок, 1987).
Действительно, через 14 сут наблюдения в 2D-активационной культуре доля живых МНК, напротив, уже на 21% (P < 0.05) превышала значение в обычной культуре клеток на пластике (2D-гомеостатическая модель) при сниженном в 2–4 раза числе погибших лейкоцитов (табл. 1). Таким образом, гуморальная имитация сигнала АПК способствует длительному выживанию МНК.
Присутствие 3D-матрикса с КФ покрытием в 2-суточной гомеостатической культуре МНК способствовало значительному уменьшению (на 17%) клеточной жизнеспособности, обусловленной усилением апоптоза (на 0.7%) и, в большей степени, некроза (на 16%) в сравнении 2D-культурой. Сходные изменения отмечены в активационной 3D-культуре на фоне стимулирующего эффекта ТКА (табл. 1). Через 14 сут выживаемость неприлипающих лейкоцитов в 3D-гомеостатической культуре достигала критических значений (17% при 69% в 2D-контроле, табл. 1). Была выдвинута гипотеза, что эффект 3D-матриксов не связан с проявлением их цитотоксичности. КФ-материалы, имитирующие минеральное вещество костной ткани, являются структурным раздражителем, запускающим ex vivo физиологические механизмы адаптации культуры МНК через механизмы гиперактивации и последующей гибели неприлипающей части популяции (преимущественно, наивных Т-лимфоцитов). Подобные процессы характерны для Т-клеток, например, при реакции на стресс и введении глюкокортикоидов. Косвенно гипотеза подтверждалась наблюдением того, что к 14-м сут (табл. 1) выживаемость МНК, стимулированных ТКА в 3D-культуре, значительно увеличивалась по сравнению с 2D- и 3D-гомеостатической культурой (на 13 и 66% соответственно, P < 0.05).
Влияние КФ-материалов на функциональную активность клеток активно изучается (Tite et al., 2018). Костные имплантаты способны индуцировать сенсибилизацию CD4+-Т-хелперов 1-го типа (Th1), развитие продуктивного воспаления в тканях-мишенях с исходом в склероз (Mitchell, 2004).
В нашем исследовании после 2-суточного культивирования in vitro (2D-контроль) доля T-лимфоцитов в неприлипающей фракции МНК крови человека, несущих кластеры дифференцировки CD45CD3, составила 98.8% (98.6; 99.0). ТКА и 3D-матриксы не влияли на показатель, цифры для CD3+-клеток варьировали в пределах 98–99%. Как следует из табл. 2, CD45CD3+-клетки экспрессировали, в основном, антигены CD4 (64–67%) и CD8 (18–22%).
Таблица 2.
Иммунофенотип лимфоцитов CD3+ в популяции неприлипающих МНК крови человека в различные сроки культивирования in vitro
| Гомеостатическая модель культивирования | Активационная модель культивирования | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 (CD4) | 2 (CD8) | 3 (CD45RA) | 4 (CD45RO) | 5 (CD4) | 6 (CD8) | 7 (CD45RA) | 8 (CD45RO) |
| 2 суток культивирования | |||||||
| аМНК на пластиковой поверхности планшетов (2D-контроль), n = 6 | |||||||
| 67.18 (65.46; 68.28) |
21.82 (20.54; 23.38) |
55.35 (54.57; 55.69) |
34.83 (33.56; 36.13) |
64.47 (58.38; 64.99) |
21.28 (20.90; 23.60) |
59.78 (59.40; 60.13) 3P < 0.05 |
32.89 (32.58; 33.46) |
| бМНК на пластиковой поверхности планшетов в контакте с КФ-покрытием (3D-культура), n = 6 | |||||||
| 67.77 (67.29; 68.37) |
21.11 (20.60; 21.53) |
56.33 (55.62; 59.03) |
36.72 (35.21; 38.43) |
64.21 (62.74; 66.11) |
18.84 (18.14; 19.53) 2P < 0.05 |
55.75 (55.50; 56.75) аР < 0.05 |
34.22 (34.22; 36.61) |
| 14 суток культивирования | |||||||
| вкультура МНК на пластиковой поверхности планшетов (2D-контроль), n = 6 | |||||||
| 36.12 (35.74; 47.01) аР < 0.05 |
22.69 (17.21; 27.18) |
93.18 (81.51; 99.97) аР < 0.05 |
80.52 (63.16; 86.36) аР < 0.05 |
55.64 (43.37; 64.24) 1P < 0.05 |
15.38 (11.08; 32.69) |
97.48 (97.34; 97.60) аР < 0.05 |
91.36 (90.57; 91.72) 4P < 0.05 аР < 0.05 |
| г культура МНК на пластиковой поверхности планшетов в контакте с КФ покрытием (3D-культура), n = 6 | |||||||
| 34.39 (30.35; 36.72) бР < 0.05 |
15.30 (14.47; 22.34) |
87.27 (86.42; 97.8) бР < 0.05 |
78.18 (78.07; 92.20) бР < 0.05 |
46.05 (45.99; 48.39) 1P < 0.05 бР < 0.05 |
5.39 (4.31; 5.42) 2P< 0.05 вР < 0.05 |
96.94 (96.43; 97.59) бР < 0.05 |
88.70 (86.85; 89.90) бР < 0.05 вР 0.05 |
В 48-часовой 2D-гомеостатической культуре 55% клеток являются CD45RA+ наивными T-лимфоцитами (не активированными антигеном) (табл. 2). Иммуномодулирующее действие ТКА, имитирующее сигнал от АПК, увеличивало на 4% (Р < 0.05) долю CD45RA+ наивных T-клеток, но в 3D-активационной культуре этот эффект нивелировался (табл. 2).
Интересными оказались данные по экспрессии изучаемых антигенов в условиях длительного культивирования МНК человека, в том числе, в присутствии гуморального и (или) структурного раздражителей (табл. 2). В 2D- и 3D-моделях гомеостатического культивирования в 2 раза (P < 0.05) снижалась доля Т-хелперов CD4+, но более чем на 30–40% (P < 0.05) возрастала доля CD45RA+-наивных и CD45RO+-Т-клеток памяти. В 14-суточной активационной культуре почти в 2–3 раза возрастала доля CD45RA+- и, особенно, CD45RO+-клеток, при этом число CD45RO-клеток памяти достигало максимального значения (91.36%; табл. 2). Это соответствует данным об экспрессии наивными Т-клетками маркеров клеток памяти после стимуляции Т-клеточного рецептора (TCR) в культуре in vitro (Gattinoni et al., 2011). В свою очередь, число CD4+-Т-лимфоцитов уменьшалось в меньшей степени (в сравнении с гомеостатической моделью), однако имело место прогрессивное снижение (P < 0.05) доли CD8+ -T-клеток вплоть до 5.39% (в 3 раза ниже значения в 3D-гомеомодели) в 3D-активационной культуре (табл. 2).
Т-лимфоциты способны длительно выживать и сохранять структурно-функциональные свойства в неблагоприятных условиях (Hoff et al., 2013), что позволяет им совместно с макрофагами регулировать переключение механизмов острого на хроническое продуктивное воспаление и регенерацию (Loi et al., 2016). По-видимому, в нашем случае это относится к популяции, экспрессирующей CD45RA+/RO+ маркеры наивных Т-лимфоцитов и Т-клеток памяти (табл. 2).
Известно ограничение иммунного ответа в период формирования костной мозоли (Meert et al., 1998). Местная иммунная толерантность опосредуется через секреторные молекулы регуляторных Т-лимфоцитов (Al-Sebaei et al., 2014) и мезенхимных стволовых клеток (Einhorn, Gerstenfeld, 2015). Наш in vitro эксперимент показал, что 14-суточный костимулирующий сигнал АПК, в большей степени, в присутствии модельного минерального матрикса кости, также способен оказывать иммуномоделирующий эффект: преимущественное гипоиммуногенное действие в отношении CD8+Т-клеток при высокой выживаемости Т-клеток памяти CD45RO+ (табл. 2). Возможно, речь идет о селекции (переключении) клонов иммунокомпетентных клеток с провоспалительного фенотипа, связанного с санацией очага воспаления, на противоспалительный эффект, обусловливающий запуск процессов ангиогенеза и регенерации (Einhorn, Gerstenfeld, 2015).
В плане переключения регуляторного эффекта значительную роль может играть функциональная поляризация лимфоцитов на Т-хелперы Th1 и Th2, которая определяется, в частности, профилем секретируемых цитокинов. Лимфоциты Th1 регулируются IL-2, в свою очередь, продуцируют IFNγ, фактор некроза опухоли β (TNF β) и IL-12. Субпопуляция лимфоцитов Th2 секретирует молекулы IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 и IL-13 (Naldini et al., 2003), которые обладают воспалительным, ангио- и (или) остеогенным потенциалом. Кроме того, IL-4, IL-6 и IL-10 считаются одними из ключевых участников тканевой реакции на инородные тела (Wang et al., 2008).
Результаты мультиплексного анализа секреторной активности представлены в табл. 3. Неактивированные антигеном МНК крови человека, согласно известной классификации (van den Broek et al., 2014), в 2-суточной 2D-гомеостатической культуре продуцируют TNFα и IFNγ в средних концентрациях (0.1–1 нг/мл), а гуморальные медиаторы (IL-2, IL-12, IL-4, Il-5, IL-6, IL-10, IL-13) – в низких концентрациях (1–100 пг/мл). В то же время, неопределяемые (0 пг/мл), минимальные (<1 пг/мл) и высокие (>1 нг/мл) уровни цитокинов в краткосрочной 2D-гомеокультуре МНК не выявлены. Другими словами, секреторную способность неактивированных МНК можно считать низкой и сбалансированной в отношении про- и противовоспалительных медиаторов (IL-4, IL-10, IL-13, IFNγ) с преобладанием в межклеточной жидкости секреторных молекул Th1-лимфоцитов (TNFα, IFNγ; табл. 3). Исходя из данных литературы о двойной роли IFNγ в процессах воспаления, этот цитокин отнесен к группе противовоспалительных факторов (Lee et al., 2017).
Таблица 3.
Секреторная активность (пг/мл) МНК крови человека в различные сроки культивирования in vitro
| Гомеостатическая модель культивирования | Активационная модель культивирования | ||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Th1 лимфоциты | Th2 лимфоциты | Th1 лимфоциты | Th2 лимфоциты | ||||||||||||||
| IL-2 (1) |
IL-12 (2) |
TNFα (3) |
IFNγ (4) |
IL-4 (5) |
IL-5 (6) |
IL-6 (7) |
IL-10 (8) |
IL-13 (9) |
IL-2 (10) |
IL-12 (11) |
TNFα (12) |
IFNγ (13) |
IL-4 (14) |
IL-5 (15) |
IL-6 (16) |
IL-10 (17) |
IL-13 (18) |
| 2 сут культивирования | |||||||||||||||||
| а Культура МНК на пластиковой поверхности планшетов (2D-контроль), n = 6 | |||||||||||||||||
| 18 (12; 43) |
13 (12;15) |
109 (76; 103) |
291 (230; 310) |
6 (5; 8) |
13 (10; 15) |
93 (60; 153) |
16 (14; 20) |
17 (15;21) |
45 (43; 56) |
48 (37; 56) 2P < 0.05 |
856
(753; 919) 3P < 0.05 |
1281 (1140; 1763) 4P < 0.05 |
9 (8; 9) 5P < 0.05 |
204 (187; 218) 6P < 0.05 |
3055 (2279; 3056) 7P < 0.05 |
774
(681; 849) 8P < 0.05 |
1230 (1006; 1240) 9P 0.05 |
| б Культура МНК на пластиковой поверхности планшетов в контакте с КФ покрытием (3D-культура), n = 6; 1PT–9PT < 0.05; aPT < 0.05 | |||||||||||||||||
| 79 (77; 127) аР < 0.05 |
14 (8; 29) |
163 (96; 199) |
376 (307; 433) |
8 (7.0; 9.8) |
17 (15; 19) |
5352 (567; 10 141) аР < 0.05 |
23 (19; 30) |
21 (19; 23) |
160
(141; 604) 1P < 0.05 аР < 0.05 |
52 (43; 60) 2P < 0.05 |
7391 (6143; 10174) 3P < 0.05 аР < 0.05 |
6964 (6629; 7746) 4P < 0.05 аР < 0.05 |
15 (14;18) 5P < 0.05 аР < 0.05 |
272 (248; 293) 6P < 0 .05 а P <0.05 |
12 787 (10 403; 19 674) 7P < 0.05 аР < 0.05 |
1048 (1004; 1160) 8P < 0.05 аР < 0.05 |
1793 (1698; 2291) 9P < 0.05 аР < 0.05 |
| 14 сут культивирования | |||||||||||||||||
| в Культура МНК на пластиковой поверхности планшетов (2D-контроль), n = 6 | |||||||||||||||||
| 0 (0; 1) аР < 0.05 |
0.5 (0.2; 0.7) аР < 0.05 |
16 (15; 16) аР < 0.05 |
4 (0;10) аР < 0.05 |
0.3 (0.2; 0.5) аР < 0.05 |
0 (0–0.4) аР < 0.05 |
26 (15; 71) аР < 0.05 |
0 (0–2) аР < 0.05 |
1.6 (1.5-.8) аР < 0.05 |
0 (0; 0) аР < 0.05 |
0.9 (0.4; 1) аР < 0.05 |
16 (14; 21) аР < 0.05 |
22 (8; 37) аР < 0.05 |
0.4 (0.2; .4) аР < 0.05 |
0 (0; 0) аР < 0.05 |
66 (66; 67) аР < 0.05 |
0.5 (0; 0.8) аР < 0.05 |
1.5 (1; 1.6) аР < 0.05 |
| г Культура МНК на пластиковой поверхности планшетов в контакте с КФ покрытием (3D-культура), n = 6 | |||||||||||||||||
| 1.4 (1.1; 1.6) бР < 0.05 |
1.5 (0.9; 1.7) аР < 0.05 вР < 0.05 |
33 (29; 39) бР < 0.05 вР < 0.05 |
32 (14; 50) бР < 0.05 вР < 0.05 |
1.2 (0.8; 1.6) бР < 0.05 вР < 0.05 |
0 (0–0.4) бР < 0.05 |
189 (128–225) бР < 0.05 вР < 0.05 |
11 (9; 15) бР < 0.05 вР 0.05 |
3 (2; 3) бР < 0.05 вР < 0.05 |
0 (0; 0) бР < 0.05 |
0.8 (0.3; 0.9) бР < 0.05 |
16 (14; 21) бР < 0.05 |
39 (26; 66) бР < 0.05 |
0.5 (0.3; 0.6) бР < 0.05 |
4 (3; 16) бР < 0.05 вР < 0.05 |
34 (24; 61) 7P < 0.05 бР < 0.05 |
0.6 (0.3; 1) 8P < 0.05 бР < 0.05 |
4.5 (4; 17) бР < 0.05 вР < 0.05 |
Моделирование 2-суточного контакта неактивированных МНК с поверхностью регенерирующей кости (3D-гомеостатическая культура) приводило к значимому (по отношению к 2D-культуре) всплеску секреции провоспалительных цитокинов IL-6 (в 58 раз) и IL-2 (в 4 раза) (табл. 3). Таким образом, неантигенный 3D-раздражитель, имитирующий минеральный компонент ЭЦМ кости, индуцирует секреторную активность лимфоцитов Th1 и Th2 в отношении прововоспалительных медиаторов.
Введение ТКА, симулирующего сигналинг АПК, также существенно (P < 0.05) стимулировало через 48 ч секрецию практически всех тестируемых медиаторов (за исключением IL-2) в активационной 2D-культуре МНК по сравнению с гомеостатической 2D-моделью (табл. 3). Провоспалительные цитокины по повышенному содержанию в супернатантах образовывали следующий ряд (по убыванию концентрации; табл. 3): IL-6 (33 раза) > IL-5 (16 раз) > > TNF-a (8 раз) > IL-12 (3.5 раза). Ранжирование повышенных концентраций противовоспалительных биомолекул привело к следующим результатам: IL-13 (72 раза) > IL-10 (48 раз) > IFN-g (4 раза) > IL-4 (1.5 раза). ТКА оказывал в определенной степени более выраженное и сбалансированное стимулирующее действие на спектр изучаемых цитокинов по отношению к подобному эффекту, описанному для структурного 3D-раздражителя.
В 2-суточной активационной 3D-культуре (МНК совместно с частицами Т-активатора и 3D-матриксом) уровни тестируемых цитокинов достигали максимального уровня как в сравнении с 3D-гомеокультурой (PT < 0.05, n = 9), так и с 2D-активационной моделью (PT < 0.05, n = 9). В данных табл. 3 можно отметить концентрации высокие (более 1 нг/мл) для цитокинов TNFα, IL-6, IL-10, IFNγ и IL-13, средние (0.1–1 нг/мл) для IL-2 и IL-5 и низкие (1–100 пг/мл) для IL-12 и IL-4.
Другими словами, гуморальный ТКА, симулирующий сигналинг АПК, и структурный неиммуногенный 3D-раздражитель, имитирующий минеральное вещество регенерирующей костной ткани, оказывают выраженное синергичное стимулирующее влияние на секрецию изучаемых цитокинов. Подобные эффекты могут лежать в основе повышенной in vitro гибели МНК через гиперактивацию (табл. 1) при 2-суточном контакте с использованными модельными раздражителями.
Напротив, гомеостатическая и активационная 2D-культуры МНК через 14 суток in vitro культивирования резко (PT < 0.05, n = 18), иногда до нуля (IL-2, IL-5, IL-10), снижали свою секреторную активность по отношению к 48-ч моделям и, более того, слабо отвечали (прежде всего, в 3D-активационной культуре) на структурный раздражитель в виде матриксов с КФ покрытием (табл. 3). Магнитные частицы, конъюгированные с антителами CD3/CD28, способствуют преимущественно экспансии T-клеток CD4+. Для эффективной активации Т-лимфоцитов CD8+ необходимы костимуляторные сигналы, например, IL-2 (Kagoya et al., 2017). В связи с этим, нулевые уровни IL-2 в 14-суточных культурах могут объяснять отмеченное в табл. 2 падение доли цитотоксических Т-лимфоцитов.
Тем не менее, искусственный ЭЦМ, имитирующий в 3D-масштабе минеральное вещество костной ткани, статистически значимо (P < 0.05 в сравнении с 2D-гомеокультурой) поддерживал секрецию лимфоцитов Th1 (IL-12, TNFα, IFNγ) и Th2 (IL-4, IL-6, IL-10, IL-13) в 14-суточной гомеостатической 3D-модели (табл. 3). Концентрация плейотропного IL-6 поддерживалась на среднем уровне секреции (189 пг/мл; в 7 раз выше, чем в 2D-гомеокультуре), что может иметь значение для длительной стимуляции процессов ангиогенеза (Naldini et al., 2003) и остеогенеза (Hallab et al., 2004), обусловленной данным цитокином.
В свою очередь, для гуморального ТКА (анти-CD2CD3СD28-частицы) в 2–14-суточных культурах подтверждаются данные о том, что короткие периоды стимуляции Т-лимфоцитов в большей степени усиливают их функциональную активность, а хроническая активация, напротив, ослабляет секреторную способность клеток (Kagoya et al., 2017). Так, комбинация моноклональных антител анти-CD2 и анти-CD3 приводит к изменению экспрессии генов в Т-клетках, что сопровождается снижением продукции IL-2 и IL-4 уже через 6 ч контакта с антителами и развитием состояния иммунной толерантности (Chavin et al., 1993). Этот механизм лежит в основе длительного выживания аллогенных трансплантатов при снижении риска побочных эффектов, обусловленных IL-2 и IL-4 (Chavin et al., 1993).
По-видимому, активирующий сигнал анти-CD2CD3СD28-частицами приводит через 14 сут к развитию толерантности Т-клеток памяти и истощению эффекторных клеток, что установлено для хронических вирусных инфекций (Angelosanto et al., 2012). В присутствии КФ-покрытий, растворяющихся с выделением ионов кальция (Шаркеев и др., 2014), механизм толерантности может реализоваться через TCR-чувствительный кальциневрин-зависимый фактор транскрипции ядерного фактора активированных T-клеток (NFAT) (Martinez et al., 2015).
Интерпретируя сведения из литературы и полученные результаты in vitro моделирования, можно заключить, что Т-клеточный анти-CD2CD3CD28-активатор, длительно (14 сут) имитирующий сигнал АПК, способен, по-видимому, снизить риск отторжения имплантатов с КФ-покрытием посредством истощения цитотоксических Т-лимфоцитов, что должно способствовать медленно текущему хроническому продуктивному воспалению и репарации тканей. В то же время, неопределяемые (0 пг/мл) и минимальные (<1 пг/мл) концентрации IL-2 и IL-4 (табл. 3), обладающих ангиогенными и остеогенными свойствами (Yuan et al., 2016; Zheng et al., 2018; Yuan et al., 2019), несут риск фиброзной инкапсуляции имплантата и “неуспеха” репаративного ремоделирования костной ткани. В этом плане, in vivo тестирование частиц анти-CD2CD3CD28 в ортопедии и травматологии по аналогии с их испытаниями в онкологии (Kagoya et al., 2017) и трансплантологии (Chavin et al., 1993) может дать ответ о целесообразности их использования при остеосинтезе в случае хронических заболеваний, длительно незаживающих переломов и ложных суставов опорно-двигательного аппарата.
Список литературы
Браун А.М., Моженок Т.П. 1987. Неспецифический адаптационный синдром клеточной системы. Л.: Наука. 232 с. (Brown A.M., Mozhenok T.P. 1987. Nonspecific Adaptation Syndrome of the Cellular System. L.: Science. 232 s)
Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Удут В.В., Наумов С.А., Хлусов И.А. 1996. Закономерности структурной организации систем жизнеобеспечения в норме и при развитии патологического процесса. Томск: Изд-во ТГУ. 283 с. (Goldberg E.D., Dygay A.M., Udut V.V., Naumov S.A., Khlusov I.A. 1996. Patterns of the structural organization of life support systems are normal and in the development of the pathological process. Tomsk: TSU Publishing House. 283 pp.)
Иванюк Е.Э., Надеждин С.В., Покровская Л.А., Шуплецова В.В., Хазиахматова О.Г., Юрова К.А., Малащенко В.В., Литвинова Л.С., Хлусов И.А. 2018. Субпопуляции макрофагов и мезенхимные стволовые клетки в регуляции ремоделирования костной ткани. Цитология. Т. 60. № 4. С. 252. (Ivanyuk E.E., Nadezhdin S.V., Pokrovskaya L.A., Shupletsova V.V., Khaziakhmatova O.G., Yurova K.A., Malashchenko V.V., Litvinova L.S., Khlusov I.A. 2018. Macrophage subsets and mesenchymal stem cells in regulation of bone tissue remodeling. Tsitologiya. V. 60. No 2. P. 252. )https://doi.org/10.31116/tsitol.2018.04.03
Коршунов Д.А., Кондакова И.В. 2016. Современные достижения и проблемы в исследовании культур клеток. Успехи совр. биол. Т. 136. № 4. С. 347. (Korshunov D.A., Kondakova I.V. 2016. Modern achievements and problems in the study of cell cultures. Succ. Mdern Biol. V. 136. No 4. P. 347.)
Риггз Б.Л., Мелтон III Л. Дж. (Ред.) 2000. Остеопороз. М.-СПб.: Невский диалект. 560 с. (Riggs B.L., Melton III L.J. (Eds.) 1995. Osteoporosis: Etiology, diagnosis, and management. 2nd ed. Philadelphia-N. Y.: Lippincott-Raven Publ. 524 pp.
Шаркеев Ю.П., Псахье С.Г., Легостаева Е.В., Князева А.Г., Смолин А.Ю., Ерошенко А.Ю., Коноваленко И.С., Назаренко Н.Н., Белявская О.А., Куляшова К.С., Комарова Е.Г., Толкачева Т.В., Хлусов И.А., Зайцев К.В., Хлусова М.Ю. и др. 2014. Биокомпозиты на основе кальцийфосфатных покрытий, наноструктурных и ультрамелкозернистых биоинертных металлов, их биосовместимость и биодеградация. Томск: Изд. дом Томского гос. университета. 596 с. (Sharkeev Yu.P., Psakhye S.G., Legostaeva E.V., Knyazeva A.G., Smolin A.Yu., Eroshenko A.Yu., Konovalenko I.S., Nazarenko N.N., Belyavskaya O.A., Kulyashova K.S., Komarova E.G., Tolkacheva T.V., Khlusov I.A., Zaitsev K.V., Khlusova M.Yu., et al. 2014. Biocomposites based on calcium phosphate coatings, nanostructured and ultrafine-grained bioinert metals, their biocompatibility and biodegradation. Tomsk: Publishing House of Tomsk State University. 596 p.)
Al-Sebaei M.O., Daukss D.M., Belkina A.C., Kakar S., Wigner N.A., Cusher D., Graves D., Einhorn T., Morgan E., Gerstenfeld L.C. 2014. Role of Fas and TREG cells in fracture healing as characterized in the Fas-deficient (lpr) mouse model of lupus. J. Bone Miner. Res. V. 29. P. 1478. https://doi.org/10.1002/jbmr.2169
Angelosanto J. M., Blackburn S.D., Crawford A., Wherry E.J. 2012. Progressive loss of memory T cell potential and commitment to exhaustion during chronic viral infection. J. Virol. V. 86. P. 8161.
Arron J.R., Choi Y. 2000. Bone versus immune system. Nature. V. 408. P. 535. https://doi.org/10.1038/35046196
Barradas A.M.C., Yuan H., van Blitterswijk C.A., Habibovic P. 2011. Osteoinductive biomaterials: Current knowledge of properties, experimental models and biological mechanisms. Eur. Cells Materials. V. 21. P. 407. https://doi.org/10.22203/ecm.v021a31
Batoon L., Millard S.M., Raggatt L.J., Pettit A.R. 2017. Osteomacs and bone regeneration. Curr. Osteoporos Rep. V. 15. P. 385. https://doi.org/10.1007/s11914-017-0384-x
Chavin K.D., Qin L., Lin J., Woodward J. E., Baliga P., Bromberg J.S. 1993. Combination Anti-CD2 and anti-CD3 monoclonal antibodies induce tolerance while altering lnterleukin-2, lnterleukin-4, tumor necrosis factor, and transforming growth factor-β production. Ann. Surg. V. 218. P. 492. https://doi.org/10.1097/00000658-199310000-00009
Crockett J.C., Rogers M.J., Coxon F.P., Hocking L.J., Helfrich M.H. 2011. Bone remodelling at a glance. J. Cell. Sci. V. 124. P. 991. https://doi.org/10.1242/jcs.063032
Einhorn T.A., Gerstenfeld L.C. 2015. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nat. Rev. Rheumatol. V. 11. P. 45. https://doi.org/10.1038/nrrheum.2014.164
Gattinoni L., Lugli E., Ji Y., Pos Z., Paulos C.M., Quigley M.F., Almeida J.R., Gostick E., Yu Z., Carpenito C., Wang E., Douek D.C., Price D.A., June C.H., Marincola F.M., Roederer M., Restifo N.P. 2011. A human memory T cell subset with stem cell-like properties. Nat. Med. V. 17. P. 1290. https://doi.org/10.1038/nm.2446
Fernández-Tresguerres-Hernández-Gil I., Alobera-Gracia M.A., del-Canto-Pingarrón M., Blanco-Jerez L. 2006. Physiological bases of bone regeneration II. The remodeling process. Med. Oral Patol. Oral Cir. Bucal. V. 11. P. E151.
Greenblatt M.B., Shim J.H. 2013. Osteoimmunology: a brief introduction. Immune Netw. V. 13. P. 111. https://doi.org/10.4110/in.2013.13.4.111
Hallab N.J., Jacobs J.J., Katz J. L. 2004. Orthopedic applications. In: Biomaterials science: An introduction to materials in medicine. 2nd ed. San Diego: Elsevier Academic Press. P. 526.
Hoff P., Gaber T., Strehl C., Schmidt-Bleek K., Lang A., Huscher D., Burmester G.R., Schmidmaier G., Perka C., Duda G., Buttgereit F. 2016. Immunological characterization of the early human fracture hematoma. Immunol. Res. V. 64. P. 1195. https://doi.org/10.1007/s12026-016-8868-9
Hoff P., Maschmeyer P., Gaber T., Schutze T., Raue T., Schmidt-Bleek K., Dziurla R., Schellmann S., Lohanatha F.L., Rohner E., Ode A., Burmester G.R., Duda G.N., Perka C., Buttgereit F. 2013. Human immune cells’ behavior and survival under bioenergetically restricted conditions in an in vitro fracture hematoma model. Cell Mol. Immunol. V. 10. P. 151. https://doi.org/10.1038/cmi.2012.56
Humbert P., Brennan M.Á., Davison N., Rosset P., Trichet V., Blanchard F., Layrolle P. 2019. Immune modulation by transplanted calcium phosphate biomaterials and human mesenchymal stromal cells in bone regeneration. Front. Immunol. V. 10. P. 663. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.00663
Kagoya Y., Nakatsugawa M., Ochi T., Cen Y., Guo T., Anczurowski M., Saso K., Butler M.O., Hirano N. 2017.Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy. JCI Insight. V. 2. e89580. https://doi.org/10.1172/jci.insight.89580
Khlusov I. A., Dekhtyar Y., Sharkeev Y. P., Pichugin V. F., Khlusova M. Y., Polyaka N., Tjulkins F., Vendinya V., Legostaeva E.V., Litvinova L.S., Shupletsova V.V., Khaziakhmatova O.G., Yurova K.A., Prosolov K.A. 2018. Nanoscale electrical potential and roughness of a calcium phosphate surface promotes the osteogenic phenotype of stromal cells. Materials. V. 11. P. 978. https://doi.org/10.3390/ma11060978
Lee S.H., Kwon J.y., Kim S., Jung K., Cho M.-L. 2017. Interferon-gamma regulates inflammatory cell death by targeting necroptosis in experimental autoimmune arthritis. Sci. Rep. V. 7. 10133. https://doi.org/10.1038/s41598-017-09767-0
Loi F., Córdova L.A., Pajarinen J., Lin T.H., Yao Z., Goodman S.B. 2016. Inflammation, fracture and bone repair. Bone. V. 86. P. 119. https://doi.org/10.1016/j.bone.2016.02.020
Martinez G.J., Pereira R.M., Äijö T., Kim E.Y., Marangoni F., Pipkin M.E., Togher S., Heissmeyer V., Zhang Y.C., Crotty S., Lamperti E.D., Ansel K.M., Mempel T.R., Lähdesmäki H., Hogan P.G., Rao A. 2015. The transcription factor NFAT promotes exhaustion of activated CD8+ T cells. Immunity. V. 42. P. 265. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2015.01.006
Massanella M., Negredo E., Pérez-Alvarez N. Puig J., Ruiz-Hernández R., Bofill M., Clotet B., Blanco J. 2010. CD4 T-cell hyperactivation and susceptibility to cell death determine poor CD4 T-cell recovery during suppressive HAART. AIDS. V. 24. P. 959. https://doi.org/10.1097/QAD.0b013e328337b957
Meert K.L., Ofenstein J.P., Sarnaik A.P. 1998. Altered T cell cytokine production following mechanical trauma. Ann. Clin. Lab. Sci. V. 28. P. 283.
Mitchell R.N. 2004. Innate and adaptive immunity: The immune response to foreign materials. In: Biomaterials science: An introduction to materials in medicine. 2nd ed. San Diego: Elsevier Academic Press. P. 304.
Naldini A., Pucci A., Bernini C., Carraro F.2003. Regulation of angiogenesis by Th1- and Th2-type cytokines. Curr. Pharm. Des. V. 9. P. 511. https://doi.org/10.2174/1381612033391423
Nepola J.V. 1996. External fixation. In: Rockwood and green’s fractures in adults. 4th ed. Philadelphia: Lippincott–Raven. P. 229.
Pucci N.A., Bernini C., Carraro F. 2003. Regulation of angiogenesis by Th1- and Th2-type cytokines. Curr. Pharm. Des. V. 9. P. 511. https://doi.org/10.2174/1381612033391423
Schell H., Duda G.N., Peters A., Tsitsilonis S., Johnson K.A., Schmidt-Bleek K. 2017.The haematoma and its role in bone healing. J. Exp. Orthop. 4: 5. https://doi.org/10.1186/s40634-017-0079-3
Tite T., Popa A.C., Balescu L.M., Bogdan I.M., Pasuk I., Ferreira J.M.F., Stan G.E. 2018. Cationic substitutions in hydroxyapatite: Current status of the derived biofunctional effects and their in vitro interrogation methods. Materials. V. 11. P. 2081. https://doi.org/10.3390/ma11112081
Van den Broek L.J., Kroeze K.L., Waaijman T., Breetveld M., Sampat-Sardjoepersad S.C., Niessen F.B., Middelkoop E., Scheper R.J., Gibbs S. 2014. Differential response of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, dermal fibroblasts, and keratinocytes to burn wound exudates: potential role of skin-specific chemokine CCL27. Tiss. Eng. (A). V. 20. P. 197. https://doi.org/10.1089/ten.TEA.2013.0123
Wang X., Lennartz M. R., Loegering D.J., Stenken J. A. 2008. Multiplexed cytokine detection of interstitial fluid collected from polymeric hollow tube implants – A feasibility study. Cytokine. V. 43. P. 15. https://doi.org/10.1016/j.cyto.2008.04.009
Yuan H., van Blitterswijk C.A., de Groot K., de Bruijn J.D. 2006. Cross-species comparison of ectopic bone formation in biphasic calcium phosphate (BCP) and hydroxyapatite (HA) scaffolds. Tiss. Eng. V. 12. P. 1607. https://doi.org/10.1089/ten.2006.12.1607
Yuan Y., Chen X., Zhang L., Wu J., Guo J., Zou D., Chen B., Sun Z., Shen C., Zou J. 2016. The roles of exercise in bone remodeling and in prevention and treatment of osteoporosis. Prog. Biophys. Mol. Biol. V. 122. P. 122. https://doi.org/10.1016/j.pbiomolbio.2015.11.005
Yuan Y., Li H., Liao Y., Feng C. 2019. CD8+ T cells are involved in early inflammation before macrophages in a rat adipose tissue engineering chamber model. J. Tiss. Eng. Regen. Med. V. 13. P. 1499. https://doi.org/10.1002/term.2836
Zheng Z.W., Chen Y.H., Wu D.Y., Wang J.B., Lv M.M., Wang X.S., Sun J., Zhang Z.Y. 2018. Development of an accurate and proactive immunomodulatory strategy to improve bone substitute material-mediated osteogenesis and angiogenesis. Theranostics. V. 8. P. 5482. https://doi.org/10.7150/thno.28315
Дополнительные материалы отсутствуют.
Пн.-пт.: 10.00-19.00