Доклады Российской академии наук. Физика, технические науки, 2023, T. 511, № 1, стр. 22-28

В настоящее время в мировой практике при разработке инновационных сенсорных подходов широко применяются материалы и структуры на основе разнообразных наночастиц и нанокластеров [1–4]. Одними из наиболее перспективных материалов такого рода, обладающих целым набором уникальных свойств, являются магнитные материалы, в частности частицы, содержащие суперпарамагнитные нанокристаллы [5–7]. Магнитные частицы (МЧ) активно используются в современных исследованиях при решении самых различных задач, например, для разработки новых методов направленной доставки лекарственных препаратов, для создания контрастирующих агентов для магниторезонансной томографии, для магнитной иммуносепарации клеток, в качестве нанометок в иммуноанализах и т.д. [8–12].

Потенциал применения МЧ в области биосенсорики состоит в их использовании для специфического распознавания детектируемых аналитов, возможности манипулирования с помощью внешнего магнитного поля, а также в применении в качестве детектируемых магнитных меток, которые могут быть зарегистрированы даже в непрозрачных средах. Однако этот потенциал в настоящее время все еще не реализован в полной мере, в частности из-за несовершенства доступных методов регистрации МЧ. Для количественного обнаружения МЧ часто используются методы, основанные на явлении гигантского магнитного сопротивления (ГМС), заключающегося в значительном уменьшении электрического сопротивления материала в присутствии внешнего магнитного поля [13–15]. В основе ГМС лежит проявление квантовомеханических эффектов в тонких пленках, которые состоят из чередующихся ферромагнитных и немагнитных слоев. Однако поскольку ГMC‑сенсорами регистрируется искажение внешнего постоянного магнитного поля одиночной МЧ, то пространственный масштаб такого искажения сравним с размером самой частицы. Это накладывает принципиальные ограничения на размер используемых МЧ, размеры и количество сенсорных элементов. Жесткие требования предъявляются и к сверхтонким защитным покрытиям ГМС‑структур, которые при этом должны выдерживать присутствие жидких реагентов и клинических сред на поверхности. Кроме того, поскольку намагниченность магнитных наночастиц достаточно мала, сигнал регистрируется с невысоким отношением сигнал/шум – обычно не более 10. Для регистрации МЧ также используются сверхпроводящие квантовые интерферометрические (CКВИД) магнетометры, охлаждаемые жидким гелием, позволяющие измерять время релаксации намагниченности при импульсном возбуждении частиц [16–18]. Известны применения СКВИД-магнетометров в биосенсорных устройствах и различных аналитических системах, позволяющие существенно улучшить чувствительность определения биологически активных соединений [19–21]. Однако необходимость использования специальной дорогостоящей, сложной и громоздкой аппаратуры, а также высокая стоимость обслуживания таких магнетометров существенно сужают их доступность для широкомасштабных исследований.

В значительной степени вышеуказанных недостатков лишена технология регистрации магнитных материалов по их нелинейному перемагничиванию, лежащая в основе данной работы. Она реализуется в компактных и сравнительно недорогих регистрирующих устройствах, позволяющих проводить измерения практически в реальном масштабе времени и при комнатной температуре [1, 5]. Технология основана на нелинейном намагничивании МЧ в магнитных полях на двух частотах (рис. 1). При этом отклик, пропорциональный количеству нелинейного магнитного материала, регистрируется на комбинаторных частотах, представляющих собой алгебраические суммы с целочисленными коэффициентами двух возбуждающих частот. Важно, что на комбинаторных частотах отсутствует вклад линейных пара- или диамагнитных материалов. За счет этого возможно реализовать высокие чувствительность и отношение сигнала к шуму при измерении количества МЧ [10]. В результате такая технология детекции простых нанооксидов железа сравнима по чувствительности с регистрацией меток из радиоактивных изотопов ⁵⁹Fe по сопутствующему гамма-излучению и позволяет детектировать десятые доли нанограмм МЧ в объеме 0.25 мл при времени измерения около 2 с и не имеющем аналогов в линейном динамическом диапазоне 7 порядков.

Рис. 1.

Схема нелинейного намагничивания в магнитных полях на двух частотах и регистрации отклика на комбинаторных частотах.

В настоящей работе на основе указанной технологии развит универсальный метод применения биофункционализированных МЧ в качестве полифункциональных агентов, выполняющих в одном анализе сразу несколько различных функций для актуальных задач биохимической и медицинской диагностики кардио- и инфекционных заболеваний (рис. 2а). Первая функция МЧ заключается в их применении в качестве специфических магнитносепарирующих агентов, управляемых внешним магнитным полем. На этом этапе с помощью МЧ обеспечиваются эффективное концентрирование, обогащение и очистка аналита от окружающего матрикса, что позволяет анализировать среды сложного состава, такие как цельная кровь, клинические образцы большого объема, пищевые продукты и т.д. Те же самые МЧ выполняют функцию носителей образовавшихся иммунокомплексов и обеспечивают их миграцию вдоль различных аналитических зон тест-системы. Следующую функцию МЧ выполняют в качестве нанометок биохимических реакций. Такие метки точно количественно детектируются по всему объему тест-систем, а не только с их поверхности, как практически всегда происходит при регистрации оптических меток. Особенно важно, что используемый принцип магнитной регистрации позволяет анализировать, в том числе, непрозрачные и окрашенные образцы.

Рис. 2.

а – Схема реализации различных функций одних и тех же магнитных частиц. Применение МЧ в качестве: (1) специфических магнитносепарирующих агентов, (2) носителей образовавшихся иммунокомплексов и (3) детектируемых нанометок; б – схема получения биофункционализированных полифункциональных магнитных материалов.

Для регистрации полифункциональных магнитных материалов в данной работе была адаптирована и оптимизирована (с целью достижения максимальной чувствительности) упомянутая технология магнитометрических измерений, а также разработана методика изготовления биофункционализированных полифункциональных магнитных материалов, заключающаяся в следующем. На поверхность суперпарамагнитных наночастиц диаметром 200 нм ковалентно иммобилизу-ются “детектирующие” моноклональные антитела, специфически связывающиеся с определяемым соединением (рис. 2б). Для этого к 8 мкл 10%-го раствора частиц, модифицированных карбоксильными группами (COOH-), добавляется 50 мкл буфера, содержащего 2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту (MES) (pH 5.0). Затем после однократной магнитной отмывки в растворе MES к частицам добавляется 50 мкл раствора MES, содержащего 3 мг 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и 2 мг N-гидроксисукцинимида. После 15 мин инкубации осуществляется замена буфера на 50 мкл фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБР) (pH 7,4), содержащего моноклональные антитела (60 мкг/мл). Затем добавляется 5 мкл 10%-го бычьего сывороточного альбумина (БСА) в фосфатно-солевом буферном растворе и инкубируется 4 ч. Все инкубации осуществляются при комнатной температуре на вертикальном ротаторе. Затем МЧ трижды отмываются в деионизованной воде и хранятся при +4°С.

Продемонстрирована возможность получения полифункциональных магнитных материалов, совместимых с технологией регистрации МЧ на комбинаторных частотах с применением методов модификации поверхности МЧ на основе альтернативных типов биораспознающих молекул: аптамеров, пептидов, белковых антигенов или антител. Выбор оптимальных молекул, обеспечивающих быстрое связывание с аналитами и медленную диссоциацию комплексов, осуществлялся с помощью анализаторов на основе низкокогерентной интерферометрии, позволяющих эффективно измерять кинетические константы взаимодействия как с биомолекулами, так и с функционализированными наночастицами [22–25]. С применением таких оптических анализаторов были разработаны методы синтеза конъюгатов магнитных наночастиц, функционализированных белковыми антигенами коронавируса SARS-CoV-2. При этом точная количественная характеризация МЧ с помощью регистрации на комбинаторных частотах позволила эффективно и быстро устанавливать оптимальные условия для иммобилизации распознающих молекул с сохранением их высокой селективной связывающей активности и минимального неспецифического связывания. Также экспериментально установлены параметры для конъюгации, такие как количество биораспознающих молекул и время инкубации с МЧ, которые обеспечивают максимальную чувствительность при минимальной продолжительности анализа. С использованием полученных полифункциональных конъюгатов разработаны способы повышения чувствительности, расширения динамического диапазона и сокращения продолжительности количественных иммунохроматографических форматов магнитного иммуноанализа (менее 20 мин), что открывает новые возможности для быстрой и высокочувствительной диагностики целого ряда заболеваний.

В частности, применительно к диагностике коронавируса SARS-CoV-2 оптимизированы различные форматы иммуноанализа с использованием полифункциональных МЧ и антител/антигенов, иммобилизованных на тестовой линии нитроцеллюлозных иммунохроматографических мембран. Была протестирована новая иммунохроматографическая аналитическая платформа для быстрого количественного детектирования антител различных классов (IgG, IgM) к антигенам вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови человека (рис. 3а). Установлено, что достигнутые пределы детекции на один-два порядка превышают чувствительность известных аналитических лабораторных методов, характеризуются широким динамическим диапазоном измерения концентраций (более трех порядков) и позволяют проводить анализ значительно быстрее – в течение 20 мин и даже вне условий специализированных лабораторий. Кроме того, проведены эксперименты по подтверждению специфичности разработанных платформ и отсутствия кросс-реактивности с другими биологически важными соединениями (в частности, низко- и высокомолекулярными потенциально интерферирующими антигенами) в сложных биологических средах.

Рис. 3.

а – Схема магнитных иммунохроматографических тест-систем для определения иммуноглобулинов класса G к RBD-антигену вируса SARS-CoV-2; б – калибровочная зависимость детектируемых магнитных сигналов от концентрации сердечной формы белка, связывающего жирные кислоты.

Отдельная серия экспериментов была посвящена демонстрации универсальности метода и возможности его использования в сочетании с анизотропными магнитными наноматериалами (АМН), а именно: цилиндрообразными структурами, синтезированными в присутствии постоянного магнитного поля. Поверхность таких АМН была модифицирована за счет введения аминогруппы NH₂- с помощью 3-(2-аминоэтиламино)пропилметилдиметоксисилана и последующего введения карбоксильной группы COOH- с помощью янтарного ангидрида. Подобные АМЧ успешно испытаны в качестве магнитных материалов, реализующих как магнитную сепарацию, так и способных служить биораспознающими носителями и метками иммунохимических реакций. Полученные COOH-модифицированные АМН были охарактеризованы и функционализированы путем ковалентной иммобилизации на их поверхности карбодиимидным методом моноклональных антител к трем различным кардиомаркерам: сердечному тропонину I – сТнI; мозговому натрийуретическому гормону – NT-proBNP; сердечной форме белка, связывающего жирные кислоты – сБСЖК. Получены калибровочные зависимости детектируемых сигналов от концентрации анализируемых кардиомаркеров, по которым установлены аналитические характеристики разработанных тест-систем (рис. 3б). Установлено, что предел детекции для сБСЖК составил 75 пг/мл; динамический диапазон – три порядка величины концентрации; среднее относительное отклонение значений регистрируемых сигналов – не более 7%; время анализа – 25 мин.

Кроме того, разработанные методы были протестированы для экспрессной количественной регистрации кардиомаркеров непосредственно в сложных матриксах с применением трехмерных твердых фаз для иммунохроматографического анализа в сочетании с электронным подсчетом магнитных нанометок во всем объеме пористых структур. Для иммунохроматографического детектирования кардиомаркеров впервые использованы не традиционные тонкие тест-полоски, а трехмерные цилиндрические волоконные структуры. На такие структуры заранее были нанесены все компоненты для анализа и сформированы три зоны. Первая зона содержала магнитные биоконъюгаты, вторая – иммобилизованные моноклональные антитела, а третья обеспечивала миграцию анализируемого раствора под действием капиллярных сил. Продемонстрированный потенциал нового трехмерного формата иммунохроматографического анализа включает не только характерные преимущества стандартной иммунохроматографии (высокая скорость анализа; простота использования, не требующая привлечения высококвалифицированного персонала для работы и интерпретации результатов; возможность проведения измерений в полевых или догоспитальных условиях), но и ряд новых преимуществ, таких как количественные измерения концентраций аналита в широком диапазоне концентраций и возможность тестирования цельной крови или сыворотки крови человека без продолжительной пробоподготовки.

Таким образом, реализованное сочетание сверхчувствительной регистрации нелинейных магнитных наноматериалов с применением полифункциональных частиц представляется перспективным для высокоточных количественных методов экспрессного определения биологически активных соединений в сложных средах. Такие методы могут использоваться для решения актуальных задач в различных областях, в частности для догоспитальной диагностики заболеваний (например, для экстренного определения кардиомаркеров у пациентов с подозрениями на острый инфаркт миокарда, а также для скоростного обнаружения коронавирусной инфекции), для анализа продуктов питания, экологического и токсикологического мониторинга и т.д.