Доклады Российской академии наук. Химия, науки о материалах , 2020, T. 491, № 1, стр. 5-9

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ МЕТАБОЛИЗМА АБСЦИЗОВОЙ КИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕЧЕННОГО ТРИТИЕМ ПО ЦИКЛОГЕКСЕНОВОМУ ИЛИ БОКОВОМУ ФРАГМЕНТУ АНАЛОГА

В. П. Шевченко 1, И. Ю. Нагаев 1*, А. И. Шапошников 2, К. В. Шевченко 1, А. А. Белимов 2, О. С. Юзихин 23, Т. Т. Исмаилов 4, Т. С. Ермеккалиев 5, Н. Е. Гоголева 45, Ю. В. Гоголев 45, академик РАН Н. Ф. Мясоедов 1

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук (ИМГ РАН)
Москва, Россия

2 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт сельскохозяйственной микробиологии Российской Академии наук
Санкт-Петербург, Россия

3 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений
Санкт-Петербург, Россия

4 Казанский институт биохимии и биофизики – обособленное структурное подразделение Федерального исследовательского центра “Казанский научный центр Российской академии наук”
Казань, Россия

5 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования “Казанский (Приволжский) федеральный университет”
Казань, Россия

* E-mail: nagaev@img.ras.ru

Поступила в редакцию 27.09.2019
После доработки 14.03.2020
Принята к публикации 16.03.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Разработана методика введения трития в боковую часть молекулы абсцизовой кислоты. Реакцию проводили в диоксане в присутствии катализатора Линдлара. Выход меченого препарата составил 70%, молярная радиоактивность – 44 Ки/моль. Проведено биологическое тестирование меченого препарата. Показано, что меченный тритием аналог абсцизовой кислоты служит ростовым субстратом для почвенных бактерий, которые включают радиоактивную метку в состав клеточных метаболитов. Поглощение метки бактериями из боковой цепи абсцизовой кислоты более чем на порядок превышает этот показатель для препаратов с меченной циклогексеновой частью молекулы. Полученные данные указывают на существование неизвестного ранее пути метаболизма абсцизовой кислоты у микроорганизмов.

Ключевые слова: мечение, тритий, абсцизовая кислота, катаболизм, ризосферные бактерии

Абсцизовая кислота (АБК) является основным стрессовым гормоном высших растений [1]. Его выработка способствует адаптации растений к неблагоприятным условиям внешней среды, таким как засуха, засоление почв, низкие температуры. По этой причине внимание многих исследователей сфокусировано на регуляции накопления АБК под действием абиотического стресса. Поскольку высокое содержание АБК ингибирует рост растений, прорастание семян и клубней [2], определение условий, снижающих концентрацию данного фитогормона в тканях и во внешней среде, является крайне важным этапом для разработки подходов, необходимых для гармоничного развития растений.

Известно, что рост-стимулирующие ризосферные бактерии (plant growth promoting rhizobacteria, PGPR) могут усиливать рост растений как благодаря образованию фитогормонов, активаторов роста – ауксинов и цитокининов, так и за счет утилизации 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты (АЦК) предшественника гормона старения – этилена [3]. Нами впервые была выявлена модуляция роста растений ризосферными бактериями благодаря их способности метаболизировать АБК [4]. Два штамма бактерий были охарактеризованы, что позволило отнести их к новым видам рода Novosphingobium и рода Rhodococcum [5, 6].

Целью работы является использование АБК, содержащей изотопную метку в разных положениях, для выяснения биохимических путей конверсии АБК у названных бактерий.

Ранее нами был получен препарат АБК с замещением атомов протона на атомы трития в циклогексеновой части молекулы, преимущественно в альфа-положении от кетогруппы С-4 [7]. Для этого тритий вводился изотопным обменом с тритиевой водой при 220°С в присутствии ди-изо-пропилэтиламина. Меченый препарат метаболизировался АБК-деградирующими штаммами PGPR, однако, большая часть изотопной метки оставалась в культуральной жидкости. Поэтому необходимо было провести соответствующее исследование с АБК, содержащей тритиевую метку в боковой цепи молекулы.

Предварительные эксперименты для оптимизации включения трития в боковую цепь молекулы АБК проводили при использовании различных катализаторов (5% Pd/BaSO4, (Ph3P)3RhCl, катализатор Линдлара) по отработанной схеме [8, 9]. При этом оказалось, что лучший выход и молярная радиоактивность наблюдались при использовании катализатора Линдлара, обработанного триэтиламином. В этих условиях параллельно проводили препаративный синтез при использовании газообразного дейтерия и газообразного трития.

При использовании трития в реакционную ампулу помещали раствор 9.5 мг АБК в 0.3 мл диоксана, 5.6 мг катализатора Линдлара и 3 мкл триэтиламина. Смесь замораживали жидким азотом, вакуумировали и вводили газообразный тритий до давления 400 гПа. Реакцию вели 1.5 ч при перемешивании при комнатной температуре. Затем содержимое ампулы вновь замораживали жидким азотом, вакуумировали и удаляли лабильный тритий упариванием с метанолом (3 × 1 мл). Меченый препарат очищали методом ВЭЖХ на колонке с сорбентом Kromasil 100 С18 (“Eka Chemicals AB”, Швеция, размер 8 × 150 мм, размер частиц 7 мкм), в системе метанол:вода:уксусная кислота (40:60:0.1), скорость потока – 2 мл/мин. Для анализа радиохимической чистоты полученного препарата использовали колонку Reprosil pur C18aq (“Dr. Maisch GmbH”, Германия, размер 4 × 150 мм, размер частиц 5 мкм), элюент А – метанол:вода:уксусная кислота (30:70:0.1), элюент Б – метанол, линейный градиент от 0 до 50% Б в течение 15 мин, скорость потока 1 мл/мин. А также колонку Prontosil 120 C18aq (размер 4 × 150 мм, размер частиц 5 мкм), элюент А – метанол:вода:уксусная кислота (30:70:0.1), элюент Б – метанол, линейный градиент от 0 до 50% Б в течение 15 мин, скорость потока 1 мл/мин. Выход меченого препарата составил 70%, молярная радиоактивность 44 Ки/моль.

Масс-спектрометрические данные получены на приборе LCQ Advantage MAX (Термоэлектрон, США), с ионизацией электрораспылением, прямым вводом раствора образца с концентрацией 10 мкг/мл в метаноле и дальнейшей фрагментацией молекулярного пика в отрицательных ионах в анализаторе методом ионных соударений с гелием при 35 эВ. Исследование распределения дейтерия между циклической и ациклической частями молекулы АБК проводили по методике [7]. Молекулярный моноизотопный пик для молекулы немеченой АБК, ее циклогексенового фрагмента и боковой цепи наблюдали при m/z = 263, 153 и 111, соответственно (рис. 1). Включение дейтерия в молекулу АБК – 1.73 атома. Содержание дейтерия в ациклическом фрагменте молекулы АБК – 92–95%.

Рис. 1.

Фрагментация молекулы абсцизовой кислоты.

Определение способности АБК-утилизирующих бактерий Novosphingobium sp. PW6 и Rhodococcus sp. P1Y включать в свой метаболизм меченную тритием АБК и накапливать радиоактивный изотоп проводили по следующей методике.

Для этого бактериальные культуры выращивали на минеральной среде, содержащей KH2PO4 13.6 г/л, NH4Cl 1.0 г/л, MgSO4 0.3 г/л, Fe-chelate 64 мг/л, CaCl2 0.4 г/л, NaOH 1.4 г/л, pH 6.5 с добавлением АБК из расчета 250 мг/л. При выходе культуры на логарифмическую стадию роста (оптическая плотность ОD600 0.2 ОЕ) в питательную среду добавляли меченную АБК до 0.5 мкКи/мл. Через 3 ч клетки бактерий осаждали из культуральной жидкости (КЖ) центрифугированием (10 000 g, 5 мин), смешивали с мелкодисперсным кварцевым стеклом (Sigma-Aldrich, США) и разрушали с помощью гомогенезатора Tissue Lyser TL (Qiagen, Германия). Полученные лизаты клеток осветляли центрифугированием (13 500 g, 10 мин) и фракционировали методом ВЭЖХ в градиенте ацетонитрила с использованием хроматографа Prep150 (Waters, США) на колонке XBridge Prep C18 OBD. Радиоактивность хроматографических фракций определяли с использованием жидкосцинтилляционного спектрометра QUANTULUS 1220 (Perkin Elmer, США). Одновременно фракционировалась и исследовалась культуральная жидкость и раствор АБК в качестве стандарта.

Превращение АБК бактериями подтверждалось обнаружением соединений, содержащих тритий в различных хроматографических фракциях бактериальных лизатов и культуральной жидкости. Результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1.

Значения радиоактивности фракций, полученных при анализе лизатов клеток бактерий методом ВЭЖХ 

№ фракции Метаболиты АБК, меченой 3Н в циклогексеновой части (положение С-3', С-5') Метаболиты АБК, меченой 3Н в боковой цепи (положение С-4,5)
Rhodococcus sp. P1Y Novosphingobium sp. P6W Rhodococcus sp. P1Y Novosphingobium sp. P6W
Значения радиоактивности фракций лизатов клеток бактерий (имп./мин/106 клеток)
1 0 0 0 0
2 0 0 0 0
3 0 0 0 0
4 0 0 0 0
5 0 18 0 182
6 63 41 383 297
7 31 60 945 46
8 45 0 96 0
9 0 0 0 0
10 0 0 0 0
Значения радиоактивности фракций культуральной жидкости (имп./мин/мл)
1 525 5610 0 830
2 117 116 0 0
3 131 57 0 0
4 52 11 0 0
5 0 0 0 0
6 0 0 2640 5980
7 735 1030 5035 484
8 6770 112 111 19
9 280 46 109 0
10 0 0 0 0

На хроматограмме культуральной жидкости при 254 нм зарегистрирован пик со временем удерживания 2.5 мин, который соответствовал АБК. Этому пику соответствовали высокие значения радиоактивности в начальной фракции КЖ Novosphingobium sp. P6W. В значительно большей степени это выражено для препарата АБК, меченного в циклогексеновой части. Во всех лизатах бактериальных клеток, инкубированных 3 ч в питательной среде с мечеными препаратами АБК, радиоактивность не была зарегистрирована. Это свидетельствует о том, что нативная АБК не проникает в клетки бактерий. Незначительные величины β-распада регистрировались так же в средних фракциях лизатов клеток, инкубированных с препаратом АБК с тритием в положениях С-3', С-5'. Значительно большее возрастание радиоактивности (до 945 имп./мин/106 клеток) наблюдалось во фракциях клеточных метаболитов с временем удержания 12–14 мин в вариантах с меткой в боковой цепи АБК. Это свидетельствует о фрагментации (деацилировании) фитогормона ферментами АБК-разлагающих бактерий и преимущественном включении в клеточный метаболизм производных боковой цепи молекулы.

Ранее было показано [10], что у растений катаболизм АБК начинается с гидроксилирования в положении С-8' при участии фермента семейства CYP707A (рис. 2). Затем 8'-гидрокси-АБК спонтанно изомеризуется в фазеевую кислоту в результате внутренней циклизации 8'-гидроксила по положению С-2' с образованием енона. На заключительной стадии 4'-кетогруппа ферментативно восстанавливается до гидроксила с образованием дегидрофазеевой кислоты. Таким образом, у растений превращение АБК затрагивает только циклическую часть молекулы, что ведет к значительной (хотя и не полной) инактивации данного стрессового фитогормона.

Рис. 2.

Катаболизм АБК у растений.

Информация о механизме микробной трансформации АБК до настоящего времени весьма ограничена [11]. Имеется сообщение, что бактерии, изолированные из АБК-обогащенной почвы, превращают этот фитогормон в дегидрофомиол in vitro и обладают вомифолдегидрогеназной активностью [12]. Полученные нами результаты свидетельствуют о существовании нового, не описанного ранее биохимического пути трансформации и утилизации АБК ризосферными бактериями. Расшифровка данного пути, по нашему мнению, заслуживает особого внимания. Ежегодно с опадом листьев и отмирающими частями растений в почву вносится значительное количество АБК, что может привести к замедлению прорастания семян и угнетению роста растений. Кроме того, выработка АБК является фактором вирулентности многих фитопатогенных грибов за счет снижения иммунитета растений в результате стрессовых реакций [11]. Таким образом, АБК-утилизирующая способность PGPR может оказывать биопротекторное действие на растения и служить повышению плодородия почвы, восстанавливая ее гормональный баланс. Изучение данного процесса поможет в разработке новых биопрепаратов для растениеводства.

ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работу проводили частично при поддержке гранта Российского научного фонда № 17–14–01363 и программ фундаментальных исследований Президиума РАН “Инновационные разработки в биомедицине” и “Постгеномные технологии и перспективные решения в биомедицине”.

Список литературы

  1. Zhu J.K. //Annu. Rev. Plant Biol. 2002. V. 53. P. 247–273.

  2. Sharp R.E., LeNoble M.E. // J. Exp. Bot. 2002. V. 53. № 336. P. 33–37.

  3. Dodd I.C., Zinovkina N.Y., Safronova V.I., et al. // Annals of Applied Biology. 2010. V. 157. № 3. P. 361–379.

  4. Belimov A.A, Dodd I.C., Safronova V.I., et al. // Plant Physiol. Biochem. 2014. V. 74. P. 84–91.

  5. Gogoleva N.E., Nikolaichik Y.A., Ismailov T.T., et al. // Microbiol. Resour. Announc. 2019. V. 8. № 15. e01591-18.

  6. Gogoleva N.E., Nikolaichik Y.A., Ismailov T.T., et al. // 3 Biotech. 2019. V. 9. № 94. P. 1–8.

  7. Shevchenko V.P., Nagaev I.Yu., Shaposhnikov A.I., et al. // Doklady Chemistry. 2018. V. 483. № 1. P. 268–271.

  8. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Мясоедов Н.Ф. // Хим-фарм. журнал. 1999. Т. 33. № 6. С. 14–27.

  9. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Мясоедов Н.Ф. // Успехи химии. 1999. Т. 68. № 10. С. 944–966.

  10. Nambara E., Marion-Poll A. // Annu. Rev. Plant Biol. 2005. V. 56. P. 165–185.

  11. Spence C., Bias H. // Curr. Opin. Plant Biol. 2015. V. 27. P. 52–58.

  12. Hasegawa S., Poling S.M., Maier V.P., et al. // Phytochem. 1984. V. 23. № 12. P. 2769–2771.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

Доклады Российской академии наук. Химия, науки о материалах