Доклады Российской академии наук. Химия, науки о материалах , 2020, T. 492-493, № 1, стр. 13-17

Циклические аминокислоты играют важную роль в жизни человека и животных, поэтому требуется контроль их количественного содержания в окружающей среде, продуктах питания, в фармацевтических препаратах и других продуктах, используемых в медицине. Для их концентрирования, при малом содержании в объектах анализа, часто используются системы на основе водорастворимых полимеров, например, поли-N-пирролидоны [1], полиэтиленгликоли [2]. В последнее время для увеличения эффективности таких систем в них вводят ионные жидкости [3–5]. Однако, это усложняет и удорожает методы разделения и очистки аминокислот.

Альтернативой для данных систем могут быть новые водорастворимые и нетоксичные гомо- и сополимеры N-виниламидов, и прежде всего такие как поли-N-винилпирролидон, поли-N-винилкапролактам и некоторые другие, которые представляют значительный интерес благодаря возможности их применения в медицине, биотехнологии и в процессах экстракции [6–8]. Менее исследованными в качестве экстрагентов в ряду рассматриваемых полимеров являются продукты полимеризации простейшего представителя N-виниламидов N-винилформамида (ВФ), некоторые из которых проявляют иммуностимулирующее действие. Наличие в макроцепи таких полимеров звеньев ВФ, способных к гидролизу с образованием NH₂-групп, позволяет получать монодисперсные субмикронные частицы с многофункциональной поверхностью. В результате этого становится возможным увеличить эффективность взаимодействия макромолекул с веществами [8]. Имеющиеся данные о свойствах полимеров ВФ указывают на возможность их использования для создания высокоэффективных экстракционных систем с целью извлечения биологически активных веществ.

В работе впервые систематически изучена экстракция циклических аминокислот (фенилаланин, тирозин, гистидин, пролин) в двухфазных системах на основе поли-N-винилформамида (ПВФ)  и  сополимера  N-винилформамида  с N-винилимидазолом (ВФ-ВИ) с применением в качестве высаливателя сульфата аммония с концентрацией 20 мас. %: рН в таких системах составлял 4.2 ± 0.1. Основываясь на результатах ранее проведенных исследований по применению N-винилформамида для экстракции аминокислот [6, 8], нами целенаправленно использован ПВФ со средневязкостной молекулярной массой М = 25 × 10³ г/моль и величиной характеристической вязкости [η] = 0.40 дл/г в 0.2 М растворе хлорида натрия при 20°C. Сополимер ВФ-ВИ получали радикальной полимеризацией в диоксане с применением в качестве инициатора азодиизобутиронитрила с концентрацией 1 мас. % в течение 8 ч при 65°С [9]. Сополимер ВФ-ВИ синтезировали при молярном соотношении сомономеров 9 : 1 с получением сополимера, содержащего 0.49 мол. дол. звеньев ВФ. Характеристическая вязкость ВФ в сополимере составила 0.52 дл/г.

Растворы экстрагировали на вибросмесителе в течение 10 мин при температуре 20 ± 1°С. Для установления межфазного равновесия и полного расслаивания системы экстракционную систему центрифугировали при 10 000 об./мин в течение 15 мин. Измеряли соотношение равновесных объемов водной и органической фаз (r). Водно-солевую фазу отделяли от органической и анализировали методом капиллярного электрофореза [10]. Рассчитаны коэффициенты распределения (D) и степень извлечения аминокислот (R, %) при их межфазном распределении и различных соотношениях исходных объемов фаз (табл. 1).

Установлено, что тирозин извлекается лучше других аминокислот в системах с ПВФ в качестве экстрагента, а гистидин экстрагируется более эффективно в системах ВФ-ВИ (обе аминокислоты извлекаются более, чем на 98%) при соотношении объемов фаз 10 : 2. На основании полученных экстракционных характеристик предложен механизм межмолекулярных взаимодействий в системах полимер–аминокислота (рис. 1).

Рис. 1.

Схема межмолекулярного взаимодействия в системах тирозин–ПВФ (1) и гистидин–ВФ-ВИ (2).

Тирозин – гораздо более полярная молекула, чем фенилаланин, а молекула пролина содержит циклическую структуру в алифатической боковой цепи, что удерживает пролин в жесткой конформации [11]. Поэтому результаты экстракции фенилаланина и пролина в системах с ПВФ несколько ниже, чем тирозина и гистидина. Можно предположить, что наличие в структуре тирозина гидроксильной группы и азота в пятичленном цикле гистидина обусловливает их большую способность к комплексообразованию, что способствует их лучшему перераспределению в фазу гомо- или сополимера в процессе экстракции по сравнению с фенилаланином и пролином. Введение в систему компонента со звеньями ВИ приводит к образованию внутримолекулярных связей между  полярными  группами  аминокислот  и N-атомами пиридинового типа в имидазольном цикле. Такой характер взаимодействия способствует более сильному сжатию макромолекул, находящихся в конформации клубка, что отражается на результатах экстракции. Это объясняется тем, что в макроцепи сополимеров появляются звенья, проявляющие комплексообразующую способность и характеризующиеся неравномерным распределением электронной плотности и наличием нуклеофильных центров [9].

Учитывая результаты экстракции индивидуальных аминокислот, нами предложены оптимальные системы для разделения и селективного определения двухкомпонентных растворов аналитов при r = 10 : 2 (табл. 2). В качестве примера приводим результаты экстракции смеси фенилаланин–тирозин, так как раздельное определение этих аминокислот имеет существенное значение: лечение фенилкетонурии заключается в соблюдении специальной диеты, при которой белок замещается смесью аминокислот с низким содержанием фенилаланина и высоким содержанием тирозина.

Для идентификации и раздельного определения аминокислот нами применен электрофоретический метод. Электрофоретический анализ проводили на приборе “Капель-105 М” (производитель “Люмэкс”, Россия). Определение проводили при условиях: ввод пробы при давлении 300 мбар в течение 5 с, длина волны – 254 нм, напряжение +25 кВ, температура 30°С, время ввода пробы 7 мин, ведущий электролит – фосфатный буферный  раствор  с  рН  7.8  ±  0.2  с  добавкой β-циклодекстрина. Регистрировали электрофореграммы, проверяли правильность автоматической разметки пиков, с помощью программного обеспечения “Эльфоран” идентифицировали компоненты. Для исключения влияния буферного раствора и экстрагента предварительно были получены их электрофореграммы.

На электрофореграмме отчетливо проявляются пики фенилаланина и тирозина, имеющие хорошее разрешение (рис. 2). Использование поли-N-винилформамида позволяет провести экстракционно-электрофоретическое определение аминокислот в таблетированных фармацевтических препаратах “Гистидин” (“ОЗОН”, Россия) и “Пролин” (“Vitaline”, США). Производителями заявляется содержание гистидина 500 мг на одну таблетку, нами найдено 487 ± 6 мг; содержание пролина заявляется 25 мг, найдено 24.6 ± 0.2 мг.

Рис. 2.

Электрофореграмма смеси фенилаланина и тирозина.

В результате проведенного исследования установлена высокая экстрагирующая способность гомо- и сополимеров на основе N-винилформамида. Максимальная эффективность экстракции индивидуальных аминокислот достигается при использовании в качестве экстрагента поли-N-винилформамида и соотношении объемов фаз 10 : 2; в этих условиях степени извлечения аминокислот достигают 93–98%. Впервые проведенное экстракционное разделение двухкомпонентной смеси аминокислот наиболее эффективно в системах на основе сополимера ВФ-ВИ. Разработаны условия электрофоретического определения аминокислот после их экстракции растворами полимеров. Полученные результаты экстракции и определения циклических аминокислот позволяют рекомендовать предложенные методики при анализе объектов окружающей среды, пищевых и фармацевтических продуктов, содержащих циклические аминокислоты.