Доклады Российской академии наук. Химия, науки о материалах , 2020, T. 492-493, № 1, стр. 143-148

Пленки бактериальной целлюлозы, продуцированной Gluconacetobacter hansenii, как источник окисленной формы нанофибриллярной целлюлозы

М. С. Рубина 1*, М. А. Пигалёва 2, А. В. Наумкин 1, Т. И. Громовых 3

1 Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова Российской академии наук
Москва, Россия

2 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, физический факультет
Москва, Россия

3 ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет)
Москва, Россия

* E-mail: margorubina@yandex.ru

Поступила в редакцию 08.05.2020
После доработки 25.05.2020
Принята к публикации 15.06.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

В настоящей работе согласно методике TEMPO-катализируемого процесса окисления была получена нанофибриллярная целлюлоза. В качестве исходного материала для окисления выступала бактериальная целлюлоза, выращенная продуцентом Gluconacetobacter hansenii. В результате окисления была получена устойчивая водная дисперсия новой формы наноцеллюлозы, которую использовали для формирования пленки. Установлено, что пленка из окисленной бактериальной целлюлозы образована фибриллами со средней шириной около 6 нм и длиной от 300 нм до нескольких микрон. Методами ИК- и рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии подтверждено наличие карбоксильных групп на поверхности пленки.

Ключевые слова: нанофибриллярная целлюлоза, бактериальная целлюлоза, окисление

Нанофибриллярная целлюлоза (НФЦ) представляет собой один из типов наноструктурированных целлюлозных материалов с характерными размерами образующих единиц 100 нм (ширина) и 1–10 мкм (длина) [1]. Эта наноформа целлюлозы характеризуется высоким аспектным соотношением (отношение длины к ширине фибрилл), что обуславливает появление целого ряда уникальных механических, реологических, барьерных свойств. НФЦ находит применение в качестве носителей лекарственных средств, в качестве пленочных покрытий, пористых материалов в регенеративной медицине для лечения ран.

Одним из эффективных методов для получения НФЦ можно считать окисление целлюлозы гипохлоритом натрия в щелочной среде, катализируемое стабильным радикалом (2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-ил)оксилом (TEMPO). Известно, что процесс TEMPO-опосредованного окисления полисахаридов отличается региоселективностью и позволяет окислять первичные спиртовые группы в полисахаридном звене до альдегидных и карбоксильных групп в мягких условиях при комнатной температуре и нормальном давлении [2].

При использовании метода, предложенного в [3], где в качестве окислительной системы используется TEMPO/NaClO/NaBr при pH 10, практически все первичные спиртовые группы у C6 атомов в полисахаридных звеньях целлюлозы окисляются до карбоксильной группы. Полученная таким образом окисленная нанофибриллярная целлюлоза (ОНФЦ) и материалы на ее основе могут использоваться в медицинских целях, в частности, в качестве гемостатических препаратов, при лечении экстремальных и хронических кожных ран, в качестве наполнителей и носителей лекарственных препаратов в фармацевтической индустрии [4].

Бактериальная целлюлоза (БЦ) – продукт биосинтеза некоторых видов бактерий, среди которых наиболее часто используются штаммы-продуценты Acetobacter xylinum или Gluconacetobacter xylinum [5]. В отличие от растительной целлюлозы БЦ характеризуется более высокой степенью чистоты, кристалличностью и гидрофильными свойствами, что обуславливает ее востребованность в регенеративной медицине [6]. Длительное воздействие окислительной системы TEMPO/NaClO/NaBr на БЦ приводит к полной дезинтеграции пленки и получению дисперсии ОНФЦ [7], которую можно использовать для пленко- и гелеобразования, создания композитных материалов [8]. Таким образом, создание новой легкодиспергируемой наноформы целлюлозы расширит возможности применения БЦ для создания композиционных материалов.

В настоящей работе предлагается синтез новой наноформы целлюлозы (ОНФЦ) с использованием в качестве исходного материала для окисления БЦ, синтезируемой продуцентом Glucon-acetobacter hansenii.

Окисление проводили в сильнощелочной среде, используя в качестве окислительной смеси систему TEMPO/NaClO/NaBr. В качестве источника целлюлозы использовали пленки БЦ в гелевой форме (никогда не подвергались сушке). Ранее было продемонстрировано, что выбранные в работе условия культивирования для синтеза БЦ позволяют получать наноструктурированный слоистый материал [9].

При добавлении окислителя – водного раствора NaClO – к реакционной смеси, содержащей БЦ, NaBr и TEMPO, раствор окрашивался в желтый цвет и практически сразу начинался процесс окисления и отделения волокон. По прошествии суток наблюдалась практически полная дезинтеграция пленки БЦ и помутнение раствора, что указывало на образование дисперсии нанофибриллярной целлюлозы. В результате такого процесса образующиеся в ходе окисления карбоксильные группы целлюлозы находятся в депротонированном состоянии и образуют ионные взаимодействия с катионами натрия, которые находятся в реакционной смеси.

На рис. 1б показано АСМ изображение нанофибрилл ОНФЦ, адсорбированных на поверхность свежесколотой слюды методом полива из водной дисперсии OHФЦ. Для полива использовали дисперсию “как есть” – без стадии промывок и фильтрования. Из изображений были определены морфологические параметры нанофибрилл. Визуализированные отдельные нанофибриллы имеют вытянутую “палочкообразную” форму. Ширина фибрилл (рис. 1в), определенная как разность высот между поверхностью слюды и поверхностью фибриллы находится в диапазоне от 2 до 14 нм, со средним значением около 6 нм. Длина окисленных фибрилл (рис. 1г) варьировалась в большей степени от 300 нм до нескольких микрон (максимальная длина, определенная из АСМ изображения – 2.5 мкм).

Рис. 1.

Типичное СЭМ изображение нанофибрилл в исходной БЦ пленке (а); типичное АСМ изображение нанофибрилл ОНФЦ, адсорбированных на поверхность свежесколотой слюды методом полива из водной дисперсии OHФЦ (б); гистограммы распределения высоты (ширины) нанофибрилл OHФЦ (в); гистограмма распределения длины отдельных нанофибрилл OHФЦ (г).

Согласно рис. 1а исходная пленка БЦ, использованная для окисления, характеризуется шириной микрофибрилл 30–100 нм и длиной большей, чем несколько микрон. Значительное укорочение волокон указывает на процесс деполимеризации, который сопровождает окисление [1].

Для исследования функционального состава и химии поверхности ОНФЦ была сформирована отдельная пленка поливом предварительно очищенной дисперсии на стерильную чашку Петри из полистирола. Пленку высушивали на воздухе при комнатной температуре и относительной влажности около 50%. Толщина сформированной пленки, измеренная с помощью микрометра, составила 15 мкм. Процедуру очистки проводили сочетанием стадий центрифугирования продукта (9000 об./мин, 15 мин) и его промывки деионизованной водой.

На рис. 2 показан ИК спектр пленки ОНФЦ. В спектре регистрируются наиболее интенсивные полосы поглощения при следующих значениях волновых чисел (см–1): ок. 3363 (вал., O–H) и 2968–2878 (вал., C–H), 1430 (ножничные, СH2 у C6), 1372 (деф., С–H), 1360, 1338 (деф., O–H в плоскости), 1316 (маятниковые, СH2), 1280 (деф. С–H), 1248 (деф. С–H),1233 (деф. O–H в плоскости у C6), 1205 (вал., C–O в пиранозном кольце), 1165 (деф., C–O–C в пиранозном кольце), 1111 (вал. ассим., пиранозное кольцо), 1059 (деф., C–O–C). Положения этих полос для пленки ОНФЦ практически совпадают с полосами, зарегистрированными для исходной пленки БЦ, и указывают на структуру целлюлозы I типа [10].

Рис. 2.

ИК спектр тонкой пленки ОНФЦ, зарегистрированный в режиме поглощения. На вставке отдельно показана увеличенная область 1750–1180 см–1 для пленки исходной БЦ (спектр а) и пленки ОНФЦ (спектр б).

В результате окисления в спектре ОНФЦ по сравнению с БЦ (рис. 2, вставка) регистрируется интенсивная полоса поглощения при 1607 см–1. Эта полоса отвечает валентным колебаниям C=O в COO группе [11] и говорит об успешности проведения процедуры окисления.

Изменения затрагивают также область 4000–2800 см–1: уширяется полоса ок. 3363 см–1 и уменьшается отношение интенсивностей полос валентных колебаний метильных групп и валентных колебаний гидроксильных групп. Это может указывать на увеличение содержания воды в пленке ОНФЦ и, соответственно, на лучшие гидрофильные свойства пленок по сравнению с БЦ.

Для получения информации о химическом состоянии элементов и их концентрации на поверхности пленки были охарактеризованы методом РФЭ спектроскопии. Зарегистрированные фотоэлектронные спектры C 1s для пленок разлагали на компоненты, приписывая каждой компоненте определенное состояние углерода (рис. 3). Процедура разложения и интерпретации спектров аналогична той, которая была описана ранее в работе [12]. Результаты разложения представлены в табл. 1. C 1s спектры пленок БЦ и ОНФЦ описаны четырьмя состояниями атомов углерода: С1 (углерод, связанный с углеродом или водородом, С–С/C–H), С2 (углерод, связанный с гидроксильной группой, C–O, и углерод в эфирной связи в пиранозном кольце C–O–C), С3 (углерод, связанный с кислородом в карбонильной группе и/или ацетальный углерод, C=O/O–C–O) и С4 (углерод, связанный с двумя кислородами в карбоксильной группе, O=C–O). Состояние C1 не характерно для структуры целлюлозы, однако встречается регулярно во всех типах целлюлозы и представляет собой низкомолекулярные фрагменты примесного углерода [13]. Стоит отметить, что для структуры целлюлозы в теории характерны только два состояния углерода: C2 и C3, атомное отношение концентраций которых должно составлять 5. Согласно результатам разложения спектров отношение C2/C3 составляет 3.04 и 3.33 для БЦ и ОНФЦ соответственно. Уменьшение отношения C2/С3 по сравнением с теоретическим может указывать на присутствие дополнительного состояния углерода.

Рис. 3.

Фотоэлектронные спектры C 1s: пленка БЦ (а), пленка ОНФЦ (б).

Таблица 1.

Результаты разложения спектров C 1s для исходной пленки БЦ и ее окисленной формы (ОНФЦ) на компоненты

Тип пленки Тип углерода Энергия связи, эВ Ширина пика, эВ Относительная интенсивность, %
ОНФЦ C1 284.9 1.11 16
C2 286.6 0.98 60
C3 288.1 1.09 18
C4 289.7 1.61 5
БЦ C1 285.0 1.15 6
C2 286.6 0.98 70
C3 288.0 1.22 23
C4 289.6 0.97 1

В результате окисления на поверхности ОНФЦ регистрируется увеличение содержания углерода карбоксильной группы (C4, O=C–O), при этом отношение (C2+С3)/C4 стремительно уменьшается, а отношение C2/С3 практически не меняется. Это может указывать на то, что окислительный процесс затрагивает атомы углерода, связанные как с гидроксильными группами (C2, C–O), так и с ацетальными группами (С3, O–C–O) [14].

Состав поверхности (ат. %), определенный с помощью коэффициентов элементной чувствительности из обзорных спектров, для исходной пленки – C56.5O43.5 и для окисленной – C54.3O38.8Na6.9. Предполагалось, что отношение атомных концентраций O/C после окисления должно увеличиться. Однако, наблюдается тенденция по уменьшению этого отношения с 0.77 (БЦ) и до 0.71 (ОНФЦ). Увеличение содержания углерода в пленке ОНФЦ по сравнению с БЦ, вероятно, связано с увеличением доли примесного углерода (C1 в спектрах). В литературе отмечается [15], что даже тщательно очищенные поверхности биоматериалов на воздухе очень быстро становятся “загрязненными” вследствие адсорбции низкомолекулярных органических соединений из окружающей среды. Разделить вклады примесных атомов углерода, привнесенных в результате процедуры синтеза материала или в результате пробоподготовки, не представляется возможным.

Таким образом, в результате использования адаптированной методики окисления смесью TEMPO/NaClO/NaBr пленки бактериальной целлюлозы, синтезированной продуцентом Gluconacetobacter hansenii, была получена водная дисперсия окисленной нанофибриллярной целлюлозы. Фибриллы окисленной целлюлозы отличаются более высоким аспектным соотношением по сравнению с фибриллами исходной бактериальной целлюлозы и содержат карбоксильные группы на своей поверхности, что было подтверждено спектральными методами (ИК и РФЭС).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Получение пленки бактериальной целлюлозы. Для получения бактериальной целлюлозы был использован штамм Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008. Получение пленки БЦ проводили культивированием продуцента в стационарном режиме при температуре 26 ± 2°С на среде со следующим составом (г/л): глюкоза – 20.0, пептон – 5.0, дрожжевой экстракт – 5.0, гидрофосфат натрия – 2.7, дигидрофосфат калия – 2.0, лимонной кислоты моногидрат – 1.15. Подробные методики культивирования продуцента, выращивания самой пленки БЦ и ее очистка описаны в работах [6, 9].

Окисление целлюлозы. В 30 г воды при интенсивном перемешивании растворяли 4.6 мг 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксила (TEMPO) и 51.5 мг NaBr. Далее в раствор помещали пленку БЦ в гелеобразной форме размером 5 × 9 см2 (в высушенном виде соответствует около 100 мг целлюлозы). Реакция окисления начиналась при добавлении по каплям из шприца 1.78 г 13% водного раствора NaClO. После окончания добавления NaClO pH раствора был доведен до значения 10–11 с помощью 0.5 М раствора гидроксида натрия. Реакцию проводили при температуре 22 ± 2°С. По прошествии 24 ч в реакционную смесь добавляли 2 мл этанола. Очищение ОНФЦ проводили последовательными процедурами центрифугирования при 9000 об./мин в течение 15 мин и промывки осадка деионизованной водой. Процедуру повторяли несколько раз, чтобы pH надосадочной жидкости составлял 7. Далее осадок очищенной ОНФЦ редиспергировали в новой порции деионизованной воды и проводили обработку полученной дисперсии в УЗ-бане с целью гомогенизации.

Методы исследования. Эксперименты по РФЭС выполняли на спектрометре AxisUltra DLD (Kratos, Великобритания) с использованием монохроматизированного излучения Al Kα (1486.6 эВ) при рабочей мощности рентгеновской трубки 150 Вт. Обзорные спектры и спектры высокого разрешения соответствующих энергетических уровней были записаны при энергиях прохождения 160 и 40 эВ и с размерами шагов 1 и 0.1 эВ соответственно. Энергетическая шкала спектрометра была откалибрована для получения следующих значений для эталонных образцов (то есть металлических поверхностей, недавно очищенных ионной бомбардировкой): Au 4f7/2–83.96 эВ, Ag 3d5/2–368.21 эВ. Эффекты электростатического заряжения образцов были компенсированы с помощью электронного нейтрализатора.

ИК спектры образцов регистрировали на спектрометре Nexus (ThermoNicolet, США) в режиме пропускания с использованием окошек из NaCl в диапазоне 4000–700 см–1, разрешение 2 см–1, число сканов – 64.

Для получения СЭМ изображений использовали электронный микроскоп с полевой эмиссией (FE-SEM) Hitachi SU8000 (Япония). Перед съемкой образцы помещали на поверхность алюминиевого столика диаметром 25 мм, фиксировали при помощи проводящего скотча (образец черни) или проводящего пластилина (образец пленки) и напыляли на них проводящий слой углерода толщиной 10 нм.

АСМ исследование проводили в режиме прерывистого контакта с использованием атомно-силового микроскопа Multimode с контроллером NanoScope-IIIa (Digital Instruments, США) и кремниевыми кантилеверами NCH (Nanoworld Instruments, Швейцария). Анализ изображений АСМ проводили с помощью программного обеспечения Nanoscope (Digital Instruments) и программного обеспечения Femtoscan Online (Центр перспективных технологий, Россия). Для визуализации отдельных нанофибрилл ОНФЦ с помощью АСМ ее водный раствор с концентрацией 0.3 г/л наносили на поверхность свежесколотой слюды.

Список литературы

  1. Isogai A., Saito T., Fukuzumi H. // Nanoscale. 2011. V. 3. P. 71–85.

  2. Pierre G., Punta C., Delattre C., Melone L., Dubessay P., Fiorati A., Pastori N., Galante Y.M., Michaud P. // Carbohydr. Polym. 2017. V. 165. P. 71–85.

  3. Isogai A., Kato Y. // Cellulose. 1998. V. 5. P. 153–164.

  4. Weishaupt R., Siqueira G., Schubert M., Tingaut P., Maniura-Weber K., Zimmermann T., Thöny-Meyer L., Faccio G., Ihssen J. // Biomacromolecules. 2015. V. 16. № 11. P. 3640–3650.

  5. Громовых Т.И., Садыкова В.С., Луценко С.В., Дмитренок А.С., Фельдман Н.Б., Данильчук Т.Н., Каширин В.В. // Прикладная биохимия и микробиология. 2017. Т. 53. № 1. С. 69–75.

  6. Pigaleva M.A., Bulat M. V., Gromovykh T.I., Gavryushina I.A., Lutsenko S. V., Gallyamov M.O., Novikov I.V., Buyanovskaya A.G., Kiselyova O.I. // J. Supercrit. Fluids. 2019. V. 147. P. 59–69.

  7. Wu C., Fuh S., Lin S., Lin Y., Chen H., Liu J., Cheng K. // Biomacromolecules. 2018. V. 19. № 2. P. 544–554.

  8. Wu C.N., Cheng K.C. // Cellulose. 2017. V. 24. P. 269–283.

  9. Gromovykh T.I., Pigaleva M.A., Gallyamov M.O., Ivanenko I.P., Ozerova K.E., Kharitonova E.P., Bahman M., Feldman N.B., Lutsenko S. V., Kiselyova O.I. // Carbohydr. Polym. 2020. V. 237. P. 116140.

  10. Carrilo F., Colom X., Suñol J.J., Saurina J. // Eur. Polym. J. 2004. V. 40. № 9. P. 2229–2234.

  11. Da Silva Perez D., Montanari S., Vignon M.R. // Biomacromolecules. 2003. V. 4. № 5. P. 1417–1425.

  12. Рубина М.С., Пигалёва М.А., Бутенко И.Е., Будни-ков А.В., Наумкин А.В., Громовых Т.И., Луценко С.В., Васильков А.Ю. // ДАН. 2019. Т. 488. № 4. С. 391–396.

  13. Ly B., Belgacem M.N., Bras J., Brochier Salon M.C. // Mater. Sci. Eng. C. 2010. V. 30. № 3. P. 343–347.

  14. Lai C., Sheng L., Liao S., Xi T., Zhang Z. // Surf. Interface Anal. 2013. V. 45. № 11–12. P. 1673–1679.

  15. Rouxhet P.G., Genet M.J. // Surf. Interface Anal. 2011. V. 43. № 12. P. 1453–1470.

Дополнительные материалы отсутствуют.