Доклады Российской академии наук. Химия, науки о материалах , 2021, T. 496, № 1, стр. 77-82

Исследование устойчивости к кальцинозу яремных вен быка с покрытиями, нанесенными из растворов в угольной кислоте

И. С. Чащин 1*, А. А. Петленко 2, И. Л. Зайцев 3, Н. П. Бакулева 4

1 Институт элементоорганических соединений имени А.Н. Несмеянова Российской академии наук
119991 Москва, Россия

2 Московский физико-технический институт
141701 Долгопрудный, Московская область, Россия

3 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, факультет фундаментальной медицины
119991 Москва, Россия

4 Национальный медицинский исследовательский центр сердечно-сосудистой хирургии имени А.Н. Бакулева Министерства здравоохранения РФ
119049 Москва, Россия

* E-mail: chaschin@polly.phys.msu.ru

Поступила в редакцию 17.08.2020
После доработки 04.12.2020
Принята к публикации 11.01.2021

Полный текст (PDF)

Аннотация

Впервые было проведено исследование устойчивости к кальцинозу яремных вен быка (ЯВБ) с хитозановым и бисфосфонатным покрытиями, нанесенными из растворов в среде системы вода/субкритический диоксид углерода (угольная кислота). Были исследованы образцы после гибридной децеллюляризации в сверхкритическом СО2, а также с покрытиями, нанесенными из растворов в угольной кислоте под давлением (P = 30 МПа) и комнатной температуре. Было выявлено снижение кальциноза обработанных вен, особенно для вен с бисфосфонатным покрытием, на Δ = 90 ± 5%, p < 0.05, по сравнению с общепринятым “золотым стандартом” (ЯВБ, сшитые глутаровым альдегидом и децеллюляризованные с помощью додецилсульфата натрия). Установлено, что для значительного подавления кальциноза ЯВБ необходимо сочетание комбинированных свойств покрытия, а именно: способности маскировать свободные альдегидные группы и способности подавлять рост патогенной микрофлоры (антимикробной активности).

Ключевые слова: сверхкритический диоксид углерода, угольная кислота, биопротезы, децеллюляризация, кальциноз, хитозан, бисфосфонаты

В настоящее время в кардиохирургической практике широко применяются девитализованные яремные вены быка (ЯВБ) в качестве альтернативы ксеногенным кондуитам (трубка на основе животного биоматериала с протезом клапана артерии) легочной артерии человека. Общепринятым “золотым стандартом” таких кондуитов является ЯВБ, децеллюляризованная в растворе полярного детергента – 1%-го раствора додецилсульфата натрия с последующей химической стабилизацией в 0.625%-ном растворе глутарового альдегида. Согласно данному протоколу производят широко распространенные кондуиты “Contegra”, получаемые из яремных вен крупного рогатого скота, разработанные компанией “Ven-Pro Corp.” (США) в 1999 г. как альтернатива легочным аллотрансплантатам [1]. Эффект девитализации биоткани, в случае применения ионных детергентов – додецилсульфата натрия (ДСН) или дезоксихолата натрия, основан на разрушении клеточных мембран и денатурации белков [2] при взаимодействии с молекулами детергентов. Однако вследствие денатурации белков может происходить также и разрушение гликозаминогликанов и факторов роста, что нарушает ультраструктуру внеклеточного матрикса [3, 4].

Весьма перспективной выглядит концепция обработки вен в среде суб- и сверхкритического диоксида углерода (ск СО2), поскольку позволяет быстро и в щадящем режиме децеллюляризовать ткань вен с сохранением структуры внеклеточного матрикса. В литературе представлены некоторые протоколы с применением сверхкритического диоксида углерода с добавлением этанола и воды в качестве полярных сорастворителей для децеллюляризации некоторых видов биотканей [5, 6].

Ранее нами была разработана методика гибридной децеллюляризации ЯВБ, сочетающая экспресс-отмывку в растворе додецилсульфата натрия с последующей экспозицией в многокомпонентной системе, включающей воду, неполярный детергент (Твин-80, “Sigma-Aldrich”, США) и этанол в растворе ск СО2, которая подробно описана в работе [7]. Была показана эффективность такого подхода с точки зрения децеллюляризации и сохранения механико-прочностных характеристик ткани вен. Дополнительно был разработан комбинированный способ модификации ЯВБ: гибридная децеллюляризация с последующим нанесением протекторного хитозанового покрытия из растворов в системе вода/субкритический диоксид углерода под давлением (угольная кислота). Было доказано улучшение механико-прочностных характеристик таких ЯВБ [7]. Кроме того, хитозановое покрытие является абсолютно биосовместимым, придает антимикробные [8] и антитромбогенные [9] свойства биоматериалу, что позволяет рассматривать децеллюляризованные ЯВБ с хитозановым покрытием как альтернативу нативному, вышедшему из строя сосуду.

Известно, что кальциноз коллагеновых матриц биопротезов в основном возникает в результате иммунного ответа организма на наличие ксеногенных клеток и клеточных компонентов, а также контакта тока крови со свободными остаточными группами глутарового альдегида на поверхности биоматериала [10]. Поэтому можно предположить, что, применяя комбинированный подход децеллюляризации с последующим нанесением покрытия, экранирующего матрицу от контакта с током крови, удастся устранить два основных фактора развития кальциноза – фосфолипиды, клетки и клеточные элементы, а также закрыть свободные остаточные группы глутарового альдегида [10]. Помимо полимерного протекторного покрытия могут быть использованы покрытия на основе бисфосфонатов, эффективность которых с точки зрения подавления кальциноза перикардиальной ткани биопротезов хорошо известна [11]. Поскольку ранее мы показали эффективность метода нанесения протекторного хитозанового покрытия из растворов в угольной кислоте под давлением на перикард, то ожидается, что и в случае модификации ЯВБ с целью снижения кальциноза данный метод нанесения покрытий будет наиболее предпочтителен.

Целью настоящей работы являлось исследование устойчивости ткани модифицированных ЯВБ к кальцинозу с помощью специальной in vivo модели. Согласно данной модели, крысам подкожно имплантировались образцы модифицированных вен, которые находились в организме животных в течение 12 нед. с учетом специальной кальций-промоутирующей диеты. После экспозиции образцы извлекались и исследовались на количество солей кальция спектрофотометрическим методом.

В качестве антикальциевых модификаторов использовали полимер хитозан (# 448869, “Sigma-Aldrich”, США) и низкомолекулярный бисфосфонат – алендронат натрия (# 121268-17-5, “Sigma-Aldrich”, США), структурные формулы которых приведены на рис. 1.

Рис. 1.

Антикальциевые модификаторы ЯВБ: хитозан (а), алендронат натрия (бисфосфонат) (б).

Использовали ЯВБ, прошедшие этап лабораторного отбора и механической очистки. Контрольные и опытные образцы вен группы 1 (“ГА”, табл. 1) проходили цикл предобработки, включающий сшивку в 0.625%-ом водном растворе глутарового альдегида (ГА, “Merck”, Германия) в буфере HEPES (“Sigma-Aldrich”, США) и обработку 1%-м водным раствором додецилсульфата натрия. Затем опытные образцы группы 1 подвергали протоколу гибридной децеллюляризации, подробно описанной в работе [7], согласно которому вены предварительно отмывали в течение 1 ч в 1%-ом водном растворе ДСН и затем проводили экспозицию в растворе многокомпонентной системы: ск СО2/этанол/вода/Твин-80 в квазидинамическом режиме с закачкой и сбросом СО2 (“Гибрид”, табл. 1). Экспозицию в растворе ск СО2 проводили в установке с объемом реактора 300 мл “SFT-150” (“Supercritical Fluid Technologies Inc.”, США). После герметизации в реактор нагнетали СО2 (чистота >99.997%, АО “Линде Газ Рус”, Россия). В течение экспозиции в реактор парциально впрыскивали 95%-й этанол (ООО “Константа-Фарм М”, Россия) через вспомогательный насос со скоростью1 мл мин–1. Опытные образцы группы 2 проходили стадию гибридной очистки (аналогично образцам группы 1) с последующим нанесением хитозанового покрытия или хитозанового покрытия с наночастицами серебра (“Гибрид + Хитозан” или “Гибрид + Хитозан/Ag” соответственно) из 1%-го раствора полимера в системе вода/субкритический диоксид углерода (угольная кислота) под давлением 30 МПа при t = = 23–25°C в течение 3 ч (группы 3 и 4, табл. 1). Образцы вен группы 5 проходили стадию экспозиции в 1%-м растворе алендроната натрия (“Sigma-Aldrich”, США) в угольной кислоте под давлением 30 МПа при t = 23–25°C в течение 3 ч после стадии гибридной децеллюляризации (“Гибрид + Бисфосфонат”, табл. 1).

Таблица 1.

Результаты анализа способности к подавлению кальциноза вен, обработанных с помощью суб- и сверхкритического диоксида углерода (M ± m, N = 27)

№ группы, образец Описание обработки Концентрация Са, мг г–1 Нормализованное содержание Са относительно контроля, %
1. “ГА” (“золотой стандарт”) Вены, сшитые в 0.625% растворе ГА и отмытые в 1% ДСН в течение суток 31.0 ± 6.0 11.0 ± 3.0
2. “Гибрид” Вены, отмытые в 1% ДСН (1 ч) + обработка в ск СО2 с детергентом Твин-80 23.0 ± 3.0 8.0 ± 2.0
3. “Гибрид + Хитозан” “Гибрид”, сшитые в 0.625% растворе ГА, + нанесение хитозана из 1% раствора полимера в угольной кислоте 24.0 ± 5.0 8.0 ± 2.0
4. “Гибрид + Хитозан/Ag” “Гибрид”, сшитые в 0.625% растворе ГА, + нанесение хитозана с наночастицами Ag из 1% раствора полимера со стабилизированными наночастицами в угольной кислоте 19.0 ± 3.0 6.0 ± 1.0
5. “Гибрид + Бисфосфонат” “Гибрид”, сшитые в 0.625% растворе ГА, + экспозиция в 1% растворе алендроната натрия в угольной кислоте 2.5 ± 1.0 1.0 ± 0.5

Исследования кальциноза образцов модифицированных ЯВБ проводили на крысах, которые, благодаря быстрому метаболизму их организма, могут служить удобной моделью для экспресс-тестирования in vivo. Модифицированные образцы ЯВБ с площадью 2–3 см2, покрытых хитозаном (наносили из растворов углекислоты), имплантировали подкожно самцам крыс породы “Wis-tar” (возраст 1 мес, вес 90–115 г) под наркозом. После имплантации животные содержались в нормальных условиях и получали пищу ad libitum. Через 4 мес. после имплантации образцы ЯВБ были извлечены из животных и промыты в физиологическом растворе для удаления остатков крови животных. Содержание кальция в образцах определяли атомно-абсорбционным спектрофотометром “ААС-5100/Zeeman” (“Perkin-Elmer”, Германия). Количественные данные анализировали с помощью двухвыборочного независимого t-критерия (α = 0.05) с использованием “Origin 8” (“OriginLab Corp.”, США).

С целью доказательства наличия антикальциевых покрытий были проанализированы ИК-спектры нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) поверхностей образцов ЯВБ. Для децеллюляризованных гибридным методом вен [7] удалось детектировать типичные для коллагена пики в области 3292–3305 см–1 (OH, NH, амид A), 3078 см–1 (амид B), 2928 см–1 (CH2) [10], 1651–1633 см–1 (тройной пик C=O) [12] и 1234 см–1 (NH, пролин, амид III). Характерные для хитозана пики отчетливо видны на спектрах образцов с полимерным покрытием в области 3440 см–1 (OH и NH), 1658 см–1 (CO) и 1598 см–1 (амид II, NH2) [13]. Спектр вены с покрытием из алендроната натрия содержал отчетливые пики в области 1240–1280 см–1, а также системы пиков в области 900–1100 см–1 (рис. 2г), что характерно для области колебаний PO-группы [14, 15]. Сложность в выделении характерных пиков алендронатного покрытия связана с их перекрыванием с колебательной областью третичного углерода COH [14] (≈1100–1210 см–1), однако для вен с покрытием пики в данной области более выражены, чем для обычных очищенных вен (рис. 2а,г), что косвенно подтверждает наличие бисфосфонатного покрытия, адсорбированного на ткань ЯВБ.

Рис. 2.

ИК НПВО спектры алендроната натрия (б) и ЯВБ: после гибридной децеллюляризации (а); после гибридной децеллюляризации с хитозановым покрытием, нанесенным из растворов в угольной кислоте (в); после гибридной децеллюляризации с бисфосфонатным покрытием, нанесенным из растворов в угольной кислоте (г).

Поскольку ранее была доказана эффективность децеллюляризации вен после гибридной обработки [7], то как отсутствие клеток и клеточных компонентов в тканях вен, так и наличие маскирующего полимерного или бисфосфонатного покрытия, экранирующего коллагеновую матрицу от тока крови, позволяют ожидать снижение степени кальциноза вен по сравнению с существующим “золотым стандартом”.

Действительно, было показано существенное понижение степени связывания солей кальция венами, претерпевшими гибридную очистку с помощью ск СО2, на Δ = 30 ± 10% (сравнение групп 1 и 2, табл. 1 p < 0.05, где p – уровень значимости, вероятность того, что сравниваемые группы в табл. 1. статистически неразличимы). Несмотря на наличие хитозанового покрытия в достаточно большом количестве (∼1 вес. % хитозана от веса биоткани [7]), способность к подавлению кальциноза у вен с полимерным покрытием не отличается от вен без такового (сравнение групп 2 и 3, табл. 1, p > 0.05). Однако для вен с покрытием с внедренными наночастицами серебра и усиленными антимикробными свойствами наблюдалось значительное подавление кальциноза на Δ = 45 ± 10% по сравнению не только с “золотым стандартом” (сравнение групп 1 и 4, табл. 1, p < 0.05), но и по сравнению с децеллюляризованными в ск СО2 венами (на Δ = 25 ± 10%, сравнение групп 2 и 4, табл. 1,  p < 0.05). Бисфосфонатное покрытие, в отличие от хитозанового, вызывает значительное снижение кальциноза биоткани ЯВБ (на Δ = 85 ± 5%) в сравнении с венами после гибридной децеллюляризации (сравнение групп 2 и 5, табл. 1, p < 0.05), и на Δ = 90 ± 5% по сравнению с “золотым стандартом” (сравнение групп 1 и 5, табл. 1, p < 0.05).

Известно, что наночастицы серебра обладают повышенной антимикробной активностью [16]. Также и алендронат натрия подавляет рост некоторых грамотрицательных патогенов [17]. Следовательно, при использовании в качестве имплантируемых биопротезов ЯВБ с нанесенными для подавления кальциноза защитными покрытиями, экранирующими свободные остаточные альдегидные группы, необходимо обеспечить также и наличие у протезов выраженных антимикробных свойств. Важность данного аспекта, скорее всего, связана с особенностью строения яремных бычьих вен, которые имеют выраженную разрыхленную волокнистую адвентицию. Вероятность адсорбции патогенов на такую ткань значительно повышается, что определяет усиленный иммунный ответ со стороны организма, проявляющийся, в том числе, в кальцификации биоткани протеза, которую предпочтительно было бы предотвратить.

Список литературы

  1. Сойнов И.А., Журавлева И.Ю., Кулябин Ю.Ю., Ничай Н.Р., Афанасьев А.В., Алешкевич Н.П., Богачев-Прокофьев А.В., Караськов А.М. // Хирургия. 2018. № 1. С. 75–81. https://doi.org/10.17116/hirurgia2018175-81

  2. Keane T.J., Swinehart I.T., Badylak S.F. // Methods. 2015. V. 84. P. 25–34. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2015.03.005

  3. Kundu J., Michaelson A., Talbot K., Baranov P., Young M.J., Carrier R.L. // Acta Biomater. 2016. V. 31. P. 61–70. https://doi.org/10.1016/j.actbio.2015.11.028

  4. Jones G., Herbert A., Berry H., Edwards J.H., Fisher J., Ingham E. // Tissue Eng., Part A. 2017. V. 23. P. 124–134. https://doi.org/10.1089/ten.TEA.2016.0114

  5. Sawada K., Terada D., Yamaoka T., Kitamura S., Fujisato T. // J. Chem. Technol. Biotechnol. 2008. V. 83. P. 943–949. https://doi.org/10.1002/jctb.1899

  6. Guler S., Aslan B., Hosseinian P., Aydin H.M. // Tissue Eng. C. 2017. V. 23. P. 540–547. https://doi.org/10.1089/ten.TEC.2017.0090

  7. Chaschin I.S., Khugaev G.A., Krasheninnikov S.V., Petlenko A.A., Badun G.A., Chernysheva M.G., Dzhidzhikhiya K.M., Bakuleva N.P. // J. Supercrit. Fluids. 2020. V. 164. 104893. https://doi.org/10.1016/j.supflu.2020.104893

  8. Gallyamov M.O., Chaschin I.S., Khokhlova M.A., Grigorev T.E., Bakuleva N.P., Lyutova I.G., Kondratenko J.E., Badun G.A., Chernysheva M.G., Khokhlov A.R. // Mater. Sci. Eng. C. 2014. V. 37. P. 127–140. https://doi.org/10.1016/j.msec.2014.01.017

  9. Lü X.Y., Huang Y., Ma C.Q. // Sensors. 2001. V. 1. P. 148–160. https://doi.org/10.3390/s10500148

  10. Schoen F., Tsao J., Levy R. // Am. J. Pathol. 1986. V. 123. P. 134–145.

  11. Webb C.L., Benedict J.J., Schoen F.J., Linden J.A., Levy R.J. // Ann. Thorac. Surg. 1988. V. 46. P. 309–316. https://doi.org/10.1016/S0003-4975(10)65932-2

  12. Santos M.H., Suva R.M., Dumont V.C., Neves J.S., Mansur H.S., Heneine L.G.D. // Mater. Sci. Eng. C. 2013.V. 33. P. 790–800. https://doi.org/10.1016/j.msec.2012.11.003

  13. Theapsak S., Watthanaphanit A., Rujiravanit R. // ACS Appl. Mater. Interfaces. 2012. V. 4. P. 2474–2482. https://doi.org/10.1021/am300168a

  14. Lin-Vien D., Colthup N.B., Fateley W.G., Grasselli J.G. The Handbook of Infrared and Raman Characteristic Frequencies of Organic Molecules / London, Academic Press Limited, 1991, p. 503.

  15. Cukrowski I., Popović L., Barnard W., Paul S.O., van Rooyen P.H., Liles D.C. // Bone. 2007. V. 41. № 4. P. 668–678. https://doi.org/10.1016/j.bone.2007.05.008

  16. Panáček A., Kvítek L., Prucek R., Kolář M., Večeřová R., Pizúrová N., Sharma V.K., Nevěčná T., Zbořil R. // J. Phys. Chem. B. 2006. V. 110. P. 16248–16253. https://doi.org/10.1021/jp063826h

  17. Menezes A.M.A., Rocha F.A.C., Chaves H.V., Cibele B.M., Carvalho C.B.M., Ribeiro R.A., Brito G.A.C. // J. Periodontol. 2005. V. 76. P. 1901–1909. https://doi.org/10.1902/jop.2005.76.11.1901

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

Доклады Российской академии наук. Химия, науки о материалах