Доклады Российской академии наук. Химия, науки о материалах , 2023, T. 508, № 1, стр. 103-110

ВВЕДЕНИЕ

Нифедипин (диметиловый эфир 2,6-диметил-4-(2-нитрофенил)-1,4-дигидропиридин-3,5-дикарбоновой кислоты) – гипотензивное лекарственное средство, селективный блокатор “медленных” кальциевых каналов – получил широкое применение в качестве антигипертензивного и антиангинального средства. При внутрижелудочном введении лабораторным животным LD₅₀ нифедипина  равна 1022 мг кг^–1 [1, 2]. В середине 80-х годов прошлого века появились данные о неблагоприятном действии нифедипина при его длительном применении в высоких дозах (более 60 мг сут^–1). Впоследствии результаты рандомизированных исследований показали безопасность пролонгированных лекарственных форм нифедипина, применение которых не повышает смертность больных с артериальной гипертензией [3]. Востребованность и широкое применение нифедипина обусловливают актуальность и необходимость продолжения исследований по снижению его побочных эффектов.

В настоящее время в качестве базисной антигипертензивной терапии показаны его пролонгированные лекарственные формы (“нифедипин ретард” и нифедипин в форме гастроинтестинальной терапевтической системы), безопасность и высокая эффективность которых подтверждены мультицентровыми исследованиями [3]. Необходимо расширение спектра пролонгированных биодоступных лекарственных форм нифедипина, которые смогли бы обеспечивать контроль процесса доставки, избегать передозировки и управлять терапевтическим эффектом.

В литературе описаны различные подходы к повышению биодоступности и снижению токсичности лекарственных средств c использованием полимеров-носителей [4–6]. Так, в работе [5] улучшение растворения нифедипина наблюдалось при использовании сополимера аминометакрилата с соотношением (нифедипин : сополимер аминометакрилата) = 1 : 4. Синтезированы трехкомпонентные рН‑чувствительные полимерные композиции на основе полилактида, полиметакриловой кислоты и метоксиполиэтиленгликоля монометакрилата в качестве умных систем доставки лекарств; при этом нифедипин инкапсулирован в ядра мицелл, имеющих сферическую форму размером 150–250 нм, методом диализа [6].

Пектин является одним из немногих полисахаридов, обладающих биомедицинской активностью, поэтому перспективен для доставки лекарств [7]. Биополимеры животного и растительного происхождения, такие как хитин и пектин, также широко применяются для повышения растворимости  плохо растворимых в воде ле- карственных соединений [7–9]. Добавлением нифедипина в расплавленную массу полиэтиленгликоля (ПЭГ 1450) при соотношении (лекарственное средство : ПЭГ) = 1 : 2 и последующем тщательном перемешивании получены твердые дисперсии [10]; прессованием полимерных композиций пектина с карбоксиметилцеллюлозой при различных соотношениях получены таблетки с 10%-й (масс./масс.) загрузкой целевого соединения [10]. На основе полисахаридов (пектин и альгинат натрия) и пластификаторов (пропиленгликоль и глицерин) разработаны трансдермальные пленки для доставки нифедипина, проведена оценка их механической прочности, эластичности и биоадгезивности, а также характеристик высвобождения нифедипина in vitro [11]. На основе альгината натрия и пектина, взятых в различных соотношениях, получены микрогранулы нифедипина пролонгированного действия и исследованы методами ИК-спектроскопии и дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) [12]. Методом свободнорадикальной полимеризации акриловой кислоты (мономер) с использованием пектина – N,N-метилен-бис(акриламида) – в качестве сшивающего агента и бензоилпероксида в качестве инициатора синтезированы чувствительные к рН среды биосовместимые гидрогели, способные пролонгировать высвобождение нифедипина. Этот сложный полимерный материал термостабилен, имеет пористую структуру и обеспечивает механическую стабильность лекарственной композиции [13]. Известны полисахаридные аэрогели на основе 4%-х растворов низкометоксилированного и высокометоксилированного пектинов, альгината, гуаровой и ксантановой камеди и абсолютного этанола (10 об. %). При этом инкапсуляция нифедипина проводилась путем диффузии из растворов этанола в гелевую матрицу [14]. Механохимическим способом в работе [15] получен супрамолекулярный комплекс нифедипина с полисахаридом арабиногалактан (1 : 10 по массе), проявивший гипотензивный эффект после однократного перорального введения.

Цель настоящего исследования состояла в оценке возможности комплексообразования цитрусового пектина с нерастворимым в воде гипотензивным лекарственным средством “Нифедипин”, исследовании физико-химических свойств и термостабильности полученных комплексов для расширения спектра эффективных нетоксичных лекарственных форм нифедипина для пероральной доставки.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы. Пектин цитрусовый (ПЦ) марки “Classic C-401” (“Herbstreith & Fox”, Германия), степень этерификации 65%. Нифедипин – фармсубстанция (Unik Chemicals, India). Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья “Альфа”, ГОСТ 5962–2013, (АО “Татспиртпром”, Россия).

Методика получения комплексов пектина с нифедипином. В колбу с дистиллированной водой засыпали пектин при постоянном перемешивании и температуре (50–55°С) до полного растворения и получали 2%-й раствор пектина (рН 3.27). Далее параллельно в двух колбах к раствору пектина (объем по 110 мл) добавляли раствор нифедипина в водном этаноле: для этого 0.250 г нифедипина растворяют в 50 мл водного этанола (80 об. %) и получали 0.5%-й раствор (рН 6.89).

Взаимодействием 2%-го раствора пектина с раствором нифедипина на магнитной мешалке (250 об. мин^–1) при температуре 50°С в течение 2 ч получен комплекс 1. Значение рН реакционной среды составляло 3.89, плотность – 0.980 г см^–3 при температуре измерений 25.4°С. Комплекс 2 в течение первого часа аналогично синтезировали на магнитной мешалке (250 об. мин^–1) при температуре 50°С, далее колба с реакционной средой в течение второго часа при температуре 40°С обрабатывалась в ультразвуковой ванне (УЗВ) при частоте ультразвука 35 кГц (компания “Сапфир”, Россия). Значение рН реакционной среды составило 3.92, плотность – 0.987 г см^–3, температура измерений 25.4°С. Комплексы с нифедипином осаждали этанолом (гидромодуль 1 : 1.5) при комнатной температуре; при этом образовывался гель желтого цвета. Колбу с осажденным продуктом на ночь оставляли в холодильнике и последующее отделение осадка проводили центрифугированием (4000 об. мин^–1, 30 мин). Целевой продукт 1 дополнительно промывали этанолом для очистки комплексов от физически сорбированного нифедипина и высушивали при 55°С в cушильном шкафу SNOL (АВ “UMEGA”, Литва). Массы высушенного измельченного комплекса цитрусового пектина с нифедипином (ПЦ-НДП) составили 1.702 г (комплекс 1) и 1.663 г (комплекс 2).

Методы исследования. Удельное оптическое вращение растворов пектина и комплексов пектина с нифедипином измеряли на поляриметре Perkin-Elmer 341 (США) (концентрация c дана в г/100 мл, длина волны 589 нм, температура 20°С).

Кинематическую вязкость растворов пектина и комплексов пектина с нифедипином определяли с использованием капиллярного вискозиметра Оствальда (температура 20°С, диаметр 0.56 мм, K = 0.009820). Время истечения растворов (0.5%): цитрусового пектина – 363.10 с, комплекса 1 – 343.31 c, комплекса 2 – 339.90 с.

Спектры ультрафиолетового (УФ) и видимого поглощения регистрировали при комнатной температуре на двухлучевом спектрометре Perkin-Elmer Lambda-35 с использованием кварцевых кювет (10 мм). В качестве источников излучения использовали дейтериевую (в области 900–325 нм) и галогеновую (в области 352–200 нм) лампы. ИК-спектры пектина и комплексов пектина с нифедипином (в таблетках KBr) регистрировали в интервале 4000–400 см^–1 на ИК-Фурье спектрометре Tensor 27 (Bruker, Германия).

Для исследования термического разложения использовали сопряженную систему прибора синхронного термического анализа ТГ/ДСК STA449-F3 (“Netzsch”, Германия) с ИК-Фурье спектрометром Tensor 27. Исследуемые образцы массой 8.0–10.8 мг помещали в алюминиевые тигли с перфорированной крышкой и нагревали до 350°C совместно с пустым тиглем в качестве образца сравнения. Измерения ТГ/ДСК проводили при скорости нагревания 10 K мин^–1 в потоке аргона 50 мл мин^–1. Разрешение прибора Tensor 27 – 4 см^–1. Газовая ячейка и транспортная линия между ТГ/ДСК и ИК-Фурье спектрометром были нагреты до 200 и 195°C соответственно.

Электронные микрофотографии нифедипина и комплексов пектина с нифедипином получены на сканирующем электронном микроскопе полевой эмиссии SU8000 (Hitachi, Япония). Изображения были получены в режиме регистрации вторичных и отраженных электронов при ускоряющем напряжении 0.5 кВ.

Готовили исходный раствор нифедипина с концентрацией 1 × 10^–4 г мл^–1 в 96%-м этиловом спирте. Затем в мерные колбы вместимостью по 10 мл вносили по 5.0, 2.5, 1.25, 0.625 и 0.313 мл исходного раствора и доводили до метки (10 мл) этиловым спиртом; в результате получили растворы нифедипина с концентрацией 5 × 10^–5, 2.5 × 10^–5, 1.25 × 10^–5, 6.25 × 10^–6, 3.125 × 10^–6 г мл^–1 соответственно.

УФ-спектры растворов нифедипина регистрировали в диапазоне от 200 до 600 нм (кварцевые кюветы, 10 мм). Спектры содержат максимумы поглощения при 235 и 333 нм. Кроме того, на основе раствора пектина с концентрацией 5 × 10^–4 г мл^–1 и растворов нифедипина с концентрациями 5 × 10^–5, 2.5 × 10^–5, 1.25 × 10^–5, 6.25 × 10^–6, 3.125 × 10^–6 г мл^–1 были приготовлены стандартные растворы; на основании данных их УФ-спектров в области 313 нм построен калибровочный график зависимости поглощения от концентрации нифедипина.

Количественное содержание нифедипина в комплексах 1 и 2 установлено методом элементного анализа по содержанию азота.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В работе исследовано взаимодействие цитрусового пектина с нифедипином в условиях ультразвуковой обработки и без ультразвука, получены водорастворимые комплексы 1 и 2 пектина с нифедипином (ПЦ–НДП). Общая формула комплексов представлена на схеме 1.

Схема 1

Полученные комплексы 1 и 2 представляют собой аморфные порошки желтовато-бежевого цвета, без запаха. Характеристики (рН, оптическое вращение и кинематическая вязкость) водорастворимых фракций комплексов пектина с нифедипином и цитрусового пектина в контрольном опыте представлены в табл. 1. Взаимодействие пектина с нифедипином характеризуется изменением рН, сдвигающегося в область значений 3.36–3.37 при увеличении количества нифедипина, участвующего в комплексообразовании, что продемонстрировано для 0.5%-х растворов комплексов 1 и 2, полученных при различных условиях (табл. 1). Все соединения оптически активны; кинематическая вязкость 0.5%-х растворов комплексов 1 и 2 ниже по сравнению с таковой для раствора пектина (с = 0.5%).

УФ-спектры цитрусового пектина и водорастворимых фракций комплексов пектина с нифедипином получены для 0.1%-х растворов. Следует отметить, что водный раствор пектина не имеет характеристических полос в УФ-области спектра (рис. 1). УФ-спектр нифедипина регистрировали в растворе этанола. Высокая чувствительность метода УФ-спектроскопии обусловливает необходимость дополнительного разведения данного раствора до концентрации 0.01%. УФ-спектр этанольного раствора нифедипина имеет максимумы поглощения при 235 и 333 нм и минимумы поглощения при 217 и 280 нм (рис. 1). При анализе УФ-спектров комплексов 1 и 2 отмечается смещение основных полос поглощения, принадлежащих нифедипину (λ 235 → 274 нм, λ 333 → 313 нм). Согласно теории Малликена [16], такой характер изменений в УФ-спектрах свидетельствует о возможном образовании комплекса пектин–нифедипин (рис. 1).

Рис. 1.

УФ-спектры водных растворов пектина, водорастворимых фракций комплексов цитрусового пектина с нифедипином и раствора нифедипина в этаноле.

Количественный анализ содержания нифедипина в комплексах 1 и 2 представлял собой сложную задачу. Состав комплексов определяли методом элементного анализа по содержанию азота, найдено количественное содержание нифедипина в комплексах: в комплексе 1–5.4%, в комплексе 2–6.5%. Это позволило установить стехиометрию полученных комплексов: на одну молекулу нифедипина приходится 30–35 циклогексозных фрагментов пектинового полисахарида.

На рис. 2 представлены микрофотографии образцов лекарственного препарата “Нифедипин” (а), цитрусового пектина (б) и комплекса 1 пектина с нифедипином (в) в качестве примера. На микрофотографии видно, что нифедипин имеет кристаллическую структуру (рис. 2а), что согласуется с литературными данными [1, 5]. Ранее нами было установлено, что цитрусовый пектин представляет собой аморфный порошок [9]. На поверхности полученного комплекса 1 (рис. 2в) проявляются морфологические изменения пектиновой матрицы в составе комплекса, которая характеризуется объемным распределением частиц (при увеличении в 70 раз). На основании полученных результатов мы предполагаем равномерное распределение нифедипина в объеме пектина, что косвенно указывает на комплексообразование.

Рис. 2.

Микрофотографии образцов нифедипина (а), цитрусового пектина (б), комплекса 1 (в), полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа.

ИК-спекры образцов цитрусового пектина, нифедипина и комплексов пектина с нифедипином 1 и 2, полученных разными способами, представлены на рис. 3. В ИК-спектре пектина присутствуют интенсивные полосы поглощения, характерные для валентных колебаний группы OH с максимумом при 3429 см^–1, колебаний связей C–H в области 2928 см^–1, валентных колебаний C=O в областях 1747 и 1634 см^–1 (группы СOOR и СOOH). В области 1300–1400 см^–1 проявляются деформационные колебания связей CH (1331 и 1371 см^–1). Интенсивные полосы в области 1016–1147 см^–1 соответствуют валентным колебаниям связей C–C и C–O пиранозных циклов. В области 700–900 см^–1 наблюдается ряд полос поглощения, характерных для внеплоскостных колебаний связей C–H. В ИК-спектре нифедипина присутствуют полосы поглощения в области 2900–3330 см^–1, характерные для валентных колебаний связей N–H аминогрупп, а также интенсивные полосы, соответствующие асимметричным (1523–1531 см^–1) и симметричным (1346–1349 см^–1) колебаниям нитрогруппы. В ИК-спектре нифедипина имеются характеристические полосы, относящиеся к колебаниям сложноэфирных групп (1700 и 1680 см^–1). В области 1600–1400 см^–1 наблюдается ряд полос поглощения, характерных для бензольного и дигидропиридинового циклов.

Рис. 3.

ИК-спектры пектина, нифедипина, комплексов пектина с нифедипином (ПЦ–НДП): комплекс 1 и комплекс 2 (УЗВ).

В ИК-спектрах комплексов пектина с нифедипином 1 и 2 (рис. 3) присутствуют полосы групп OH (3434–3435 см^–1), полосы, соответствующие валентным колебаниям связей C–H (2929–2930 см^–1) и C=O (1735–1736 и 1627–1628 см^–1), которые смещены по сравнению со спектром пектина (OH в области 3429 см^–1, C–H в области 2928 см^–1, валентных колебаний C=O в областях 1747 и 1634 см^–1), что свидетельствует об образовании водородной связи и подтверждает взаимодействие цитрусового пектина с нифедипином. Деформационные колебания различных групп в комплексах 1 и 2 в области 1200–1500 см^–1 не претерпевают значительных изменений, по сравнению с таковыми в чистом пектине.

Было проведено исследование термического поведения комплексов 1 и 2, а также исходных соединений (пектина и нифедипина) методом синхронного термического анализа (термогравиметрия/дифференциальная сканирующая калориметрия с ИК-Фурье спектроскопией, ТГ/ДСК–ИК-Фурье), который регистрирует изменение массы образца в зависимости от температуры. ТГ/ДСК-кривые пектина, комплексов пектина с нифедипином, полученные разными способами, и нифедипина представлены на рис. 4а–г. На ТГ/ДСК-кривых пектина и его комплексов с нифедипином (рис. 4а–в) видно, что при нагревании наблюдаются две стадии потери массы.

Рис. 4.

ТГ/ДСК-кривые: пектин (а), комплекс 1 (б); комплекс 2 (в); нифедипин (г). ТГ – сплошная линия, ДТГ – пунктирная линия, ДСК – штриховая линия.

По данным ИК-Фурье спектроскопии газообразных продуктов нагревания первая стадия сопровождается потерей воды: 6.58% (комплекс 2) с максимумом на ДТГ-кривой при 96.7°C и эндотермическим пиком на ДСК-кривой при 95.4°С; 8.31% (комплекс 1) – при 97.8°C (ДТГ) и 110.5°С (ДСК); 6.96% (пектин) – при 94.2°C (ДТГ) и 91.3°С (ДСК) (см. табл. 2). Максимум потери массы на второй стадии: 51.82% (комплекс 2) наблюдается при температуре 239.1°C (ДТГ) с соответствующим экзотермическим пиком на ДСК-кривой при 243.7°C; 50.48% (комплекс 1) – при 237.6°C (ДТГ) и 241.8°C (ДСК), 51.50% (пектин) – при 238.5°C (ДТГ) и 242.6°C (ДСК). Согласно ИК-Фурье спектрам газообразных продуктов, на второй стадии происходит декарбоксилирование и разложение пектина и комплексов 1 и 2. В отличие от пектина и комплексов 1 и 2, нагревание чистого нифедипина, помимо плавления при 178.4°С, сопровождается одной стадией потери 69.2% массы при 304°C с экзотермическим пиком на ДСК-кривой при 303°C. Синхронный термический анализ синтезированных комплексов пектина с нифедипином 1 и 2 показал термостабильность полученных лекарственных композиций, сравнимую с исходным пектином, но меньшую, чем у нифедипина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, на основе доступного растительного водорастворимого биополимера полиуронидной природы, а именно пектина, обладающего широким спектром биологической активности, получены молекулярные комплексы пектина с нифедипином 1 и 2, установлена их стехиометрия, исследованы физико-химические свойства (кинематическая вязкость, рН, растворимость, термостабильность) и их микроструктура. Методами ИК и УФ-спектроскопии подтверждено межмолекулярное взаимодействие цитрусового пектина с гидрофобным гипотензивным лекарственным препаратом “Нифедипин”; методом элементного анализа установлено количественное содержание нифедипина в комплексах: в комплексе 1–5.4 мас. %, в комплексе 2–6.5 мас. %. Результаты исследований подтверждают целесообразность и эффективность использования цитрусового пектина для комплексообразования с нифедипином, практически не растворимым в воде, для получения новой нетоксичной водорастворимой лекарственной формы, востребованной в терапии больных артериальной гипертензией и сопутствующей стенокардией. В дальнейшем запланировано последующее изучение in vitro кинетики высвобождения нифедипина, связанного с пектином в комплекс, и фармакокинетики in vivo.