Доклады Российской академии наук. Науки о Земле, 2021, T. 497, № 2, стр. 128-132

При обсуждении ранней химической эволюции основной упор обычно делается на путях синтеза пребиотиков, ведущих к важнейшим биомолекулам, таким как аминокислоты, пептиды, белки, сахара, нуклеиновые основания, нуклеотиды, которые являются элементами критически значимых полимерных структур живой клетки. В то же время сравнительно мало внимания уделяется низкомолекулярным факторам, таким как, например, стероидные гормоны, которые играют жизненно важную роль в качестве сигнальных и регуляторных органических веществ клетки. Будучи относительно простыми в химическом отношении, они могли занять свое место среди ключевых клеточных предэлементов на довольно ранней стадии химической эволюции и вступить в биотическую эру с полностью сформированной молекулярной структурой. В первую очередь это касается стероидных гормонов, имеющих углеродный скелет стеринов, что позволяет считать их биогенетически сравнительно простыми и, возможно, наиболее древними. Типичными их представителями являются стероидные гормоны растений или брассиностероиды (БС).

Открытие БС, в настоящее время признанных новым классом растительных гормонов, стало важным событием, указывающим на разностороннюю роль стероидов как гормональных регуляторов, характерных для большинства организмов, населяющих Землю [1]. Несмотря на то что в некоторых отношениях они довольно хорошо изучены, особенно как ключевые клеточные сигнальные агенты, характерные для всех видов растений [2], БС остаются малоизученными с точки зрения их видовой, структурной, органной и временной специфичности действия и биогенеза. Можно ожидать, что как полиоксигенированные стерины, структурно сходные с типичными для самых древних организмов, таких как иглокожие [3, 4], БС являются природными биорегуляторами очень древнего происхождения.

Таким образом, имея литературные данные о широком распространении различных стероидов, включая растительные стерины, в геологических окаменелостях [5–9], мы заинтересовались поиском в их составе стероидных гормонов растений. Задача казалась непростой из-за специфической химической структуры и свойств БС, а также их крайне низкого естественного содержания в растениях (на несколько порядков ниже содержания растительных стеринов). Опираясь на наш положительный опыт обнаружения и количественного определения БС в растительных источниках, и вдохновленные нашим недавним открытием этих фитогормонов в образцах сырой нефти [10], мы получили новые данные, показывающие, что молекулярная структура БС очень консервативна и стабильна, а фитогормоны современных структурных типов могли входить в состав растений в течение сотен миллионов лет, вероятно, на протяжении всего периода эволюции растений на Земле.

Стероиды природных отложений являются важными биомаркерами – органическими соединениями, присутствующими в современных и ископаемых отложениях, которые сохраняют структурные особенности своих биологических предшественников или могут напрямую отражать стероид-специфический состав объекта, из которого они произошли. Стероиды, обнаруженные в природных отложениях, представлены стеролами, станолами, станонами и стенонами. Они являются индикаторами истории формирования отложений, и их измеренное содержание в изученных источниках колеблется от 10^–6 до 10^–3% [5–9]. На сегодняшний день лишь несколько исследований посвящено качественному и количественному составу стероидных соединений в природных объектах, таких как торф [5, 6], лигнит [6–8], морские отложения [4] и некоторых других. Однако до недавнего времени в литературе не было данных по обнаружению БС в месторождениях полезных ископаемых. В то же время их открытие может пролить свет на биорегуляторные механизмы, которые контролируют рост, развитие и адаптацию растений на ранних стадиях эволюции, и нельзя исключать их участие в этих процессах в качестве биосигнальных молекул.

В данной работе на содержание БС исследованы шесть проб угля разного возраста и одна проба торфа. Образцы были взяты из месторождений Беларуси (табл. 1). Характеристика и датировка образцов проводились в Институте природопользования Национальной академии наук Беларуси. Образцы угля и торфа анализировали с использованием трех независимых методов: конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА-1) [11], двухэтапного иммуноферментного анализа (ИФА-2) [12] и тандемной высокоэффективной масс-спектрометрии (ВЭЖХ–МС–МС). На первой стадии эксперимента образцы угля (0.5 г) растирали и экстрагировали метанолом (3 мл) в течение 24 ч при комнатной температуре. Экстракты центрифугировали (3000 об/мин, 20 мин), жидкости супернатанта разбавляли буфером для анализа, проводили количественное определение БС по методу [12]. Полученные данные свидетельствуют о том, что все исследованные образцы содержали БС основных природных групп: 24-эпибрассинолида, брассинолида (кроме образца 2) и 28-гомобрассинолида (табл. 2).

Для детального изучения были выбраны образцы бурого угля 5 и 6, содержание всех групп БС в которых было наибольшим (как следует из табл. 2). Образцы угля (10 г) растирали и экстрагировали метанолом (35 мл) в течение 24 ч при комнатной температуре. Экстракты фильтровали на фильтре из пористого стекла. Полученные метанольные экстракты упаривали и остаток распределяли между циклогексаном (40 мл) и 80%-водным метанолом (3 × 15 мл). Объединенный 80%-ный водный экстракт упаривали до водного остатка, который распределяли между этилацетатом (40 мл) и 0.25 М Na₂HPO₄ (3 × 15 мл). Этилацетатную фракцию промывали водой (3 × 15 мл) и упаривали досуха. Остаток растворяли в метаноле (1.5 мл) и подвергали препаративной тонкослойной хроматографии (20 × 20 см) на силикагеле, используя смесь хлороформ–метанол (88 : 12) в качестве элюента. Зону, содержащую БС (R_f 0.4–0.6), собирали и элюировали метанолом, растворитель упаривали. Остаток растворяли в метаноле (300 мкл) и разделяли обращенно-фазовой высокоэффективной хроматографией, используя 70%-водный ацетонитрил в качестве подвижной фазы со скоростью потока 1.5 мл/мин. УФ-детектирование проводили на длине волны 204 нм. Растворители перед использованием дегазировали. Фракции каждые 2 мин, начиная с 10 мин (10–12, 12–14, 14–16, 16–18, 18–20 мин), отдельно собирали и упаривали. Остаток растворяли в метаноле (3 мл) и аликвоту в 100 мкл упаривали, остаток растворяли в 0.5 мл буфера для анализа и использовали для ИФА-1 по методу [13]. Оставшуюся часть собранной фракции упаривали и использовали для анализа с помощью ВЭЖХ–МС–МС. Для ВЭЖХ–МС–МС использовался хроматограф Agilent 1200, оснащенный масс-спектрометром Agilent Triple Quad 6410. Все стандартные БС были количественно определены с помощью мониторинга множественных реакций (MRM) в положительном режиме. Результаты, полученные с помощью ИФА-1 и ВЭЖХ–МС–МС в образцах 5 и 6, представлены в табл. 3.

На основании полученных данных ИФА-1 и ВЭЖХ–МС–МС можно сделать вывод, что в образце   5 основными фракциями являются 24-эпибрассинолид (3.8 и 1.8 нг/г соответственно), 24-эпикастастерон (8.9 и 2.5 нг/г) и кастастерон (4.2 и 1.0 нг/г). Основными обнаруженными представителями БС в образце 6 являются также 24-эпибрассинолид (5.8 нг/г по данным ВЭЖХ–МС–МС и 9.4 нг/г по данным ИФА-1) и 24-эпикастастерон (3.2 и 11.2 нг/г), а также заметное количество кастастерона (1.9 и 0.4 нг/г). Представители группы 28-гомобрассинолида (28-гомокастастерон и 28-гомобрассинолид) были зарегистрированы в обоих образцах в небольших количествах или не обнаружены вовсе. Удивительным фактом является отсутствие (или наличие в недетектируемом количестве) брассинолида в изученных образцах угля, при этом его биосинтетический предшественник кастастерон был обнаружен двумя методами и в обоих образцах.

Следует отметить, что различия в результатах ИФА-2 и ИФА-1 связаны с разными методами пробоподготовки и, соответственно, степенью участия конкурирующих антигенов. В случае ИФА-2 результаты немного выше, потому что был проанализирован неочищенный экстракт, содержащий весь набор конкурирующих антигенов, включая другие БС. Более низкие результаты, полученные с помощью ИФА-1, обусловлены предварительным фракционированием сырого экстракта методом препаративной ВЭЖХ. В то же время уровни стероидных гормонов растений, измеренные различными методами (ИФА-2, ИФА-1 и ВЭЖХ–МС–МС), сопоставимы, и использованная методология может быть применена к другим образцам минералов.

Таким образом, на основе изучения образцов угля и торфа мы можем сделать вывод, что эти минералы растительного происхождения содержат значительное количество БС, состав которых меняется в зависимости от отложений, глубины и других факторов. Количественное содержание БС сопоставимо с таковым в растительных объектах [14] и лекарственных травах [15].

Обнаружение брассиностероидов в угольных месторождениях показывает уникальную стабильность этих молекул в различных условиях окружающей среды. Органические молекулы подобной структуры раньше никогда не находили в таких объектах, и их открытие приводит к нескольким важным выводам: 1) БС могут занимать место среди самых древних органических молекул, используемых Природой в качестве биорегуляторов; 2) если это так, то наследование отзывчивости к этим гормонам более молодыми организмами может быть объяснением множественных эффектов стероидных гормонов растений у животных и человека; 3) несмотря на сложную химическую структуру, БС очень стабильны в различных условиях, и, благодаря своей высокой активности, стимулирующей рост растений, могут являться важными компонентами, обеспечивающими эффективность широко используемых агропрепаратов на основе торфа; 4) заметный уровень содержания гормонов в отложениях – новое подтверждение растительного происхождения углей.

Результаты нашего исследования способствуют пониманию того факта, что молекулярная основа биорегуляторных механизмов очень консервативна, а стероидные гормоны, имеющие структуру, аналогичную современным, возможно, контролировали процессы роста, развития и адаптации растений на протяжении длительного периода эволюции.