Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 490, № 1, стр. 7-10

В работе [1] показано, что экспрессия мРНК гистидинбогатого гликопротеина (HRG) при инвазивной карциноме неспецифического типа (ИКНТ) наблюдалась в 70% случаев, но также обнаружена и при незлокачественных заболеваниях молочной железы (НЗ), что, на наш взгляд, связано с экспрессией в бипотатах НЗ иммуногистохимических (ИГХ) маркёров эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП): коллагена II типа (CII), бета-1-интегрина (CD29) и кадгерина-Е (CDH1). Известно, что анализ на уровне транскриптов не всегда может отражать клеточные функции вследствие различных биологических механизмов, в то время как протеом более точно отражает функциональное состояние клетки [2, 3]. Опухолевые клетки секретируют характерные белки, которые могут обнаруживаться в крови и других жидкостях организма [4]. Это побудило нас расширить исследования и изучить концентрации HRG и CDH1, потеря которого как раз свидетельствует об ЭМП.

Целью работы явилось определение концентрации гистидинбогатого белка и кадгерина-Е в супернатантах клеток крови и биоптатов ткани при влиянии на них поликлональных активаторов и изучение в биоптатах экспрессии иммуногистохимических маркёров при опухолях молочной железы.

Материалом служила периферическая кровь и биоптаты молочной железы 23 пациентов, 12 из которых имели ИКНТ, а 11 – НЗ (фиброаденоматоз и фиброаденомы с гиперплазией и без неё). Все исследования были проведены в соответствии с Хельсинской декларацией. От каждого пациента получено информированное согласие на проведение исследования. Этический комитет ФГБОУ ВО НГМУ дал разрешение на проведение этого исследования.

Для индуцирования продукции HRG и CDH1 использовали комплекс поликлональных активаторов (ПА) (АО “Вектор-Бест”, Россия). Биоптаты, полученные методом трепанобиопсии, делили на две части по 8 мм³. Одну часть инкубировали в питательной среде DMEM-F12 для определения спонтанной продукции, а другую – в таком же объёме среды при 37°С в течение 72 ч с комплексом ПА для определения индуцированной продукции, после чего клетки осаждали центрифугированием при 2000 об/мин, 15 мин и получали супернатант. Супернатант иммунокомпетентных клеток (ИКК) крови получали следующим образом: цельную кровь в количестве 1 мл помещали в стерильный флакон с 4 мл питательной среды DMEM-F12 и культивировали при 37°С в течение 24 ч, затем осаждали центрифугированием в вышеуказанном режиме. Концентрации HRG и CDH1 в супернатантах определяли иммуноферментным анализом с использованием специфичных наборов производства “Cloud-Clone Corp.” (США) согласно стандартной инструкции. Индекс влияния поликлональных активаторов (ИВПА) на продукцию протеинов биоптатами опухолей высчитывали по формуле ИВПА = А/Б, где А – концентрация протеина в супернатанте после инкубации биоптата с ПА, а Б – концентрация протеина в супернатанте биоптата без стимуляции ПА.

Кроме того, в срезах биоптатов молочной железы определяли экспрессию маркёров ЭМП: CII, CD29 и CDH1. ЭМП представляет собой сложный и динамический процесс, который включает в себя трансдифференцировку клеток посредством изменений в состоянии клетки [5, 6]. Иммуногистохимическое исследование экспрессии CII, CD29 и CDH1 проводили на парафиновых срезах опухолей с использованием набора Vectastain Universal Elite ABC Kit (“Vector Laboratories”, USA) [7]. Анализ экспрессии изучаемых маркёров проводился с помощью морфометрического комплекса на базе микроскопа Микромед-6, цифровой камеры DSM 510 и программного обеспечения ImageJ 1.42g (Национальный институт здоровья, США). Для каждого пациента оценивалось по 10 изображений (площадь каждого составляла 95 578 мкм²). Подсчитывали относительное количество клеток, либо экспрессирующих (Э), либо не экспрессирующих каждый маркёр (Н). Для удобства оценки использовали отношения Э/Н для CII и CD29 и Н/Э для CDH1.

Статистическую обработку данных выполняли с использованием непараметрического критерия Манна–Уитни при помощи Statistica V6.0.

При определении HRG в супернтатантах ИКК крови и в супернатантах биоптатов при спонтанной и индуцированной продукции (табл. 1) были получены статистически значимо более высокие концентрации в супернатантах ИКК крови (p = 0.002) и при спонтанной продукции биоптатами (p = 0.016) больных ИКНТ по сравнению с НЗ молочной железы.

При определении CDH1 в супернтатантах клеток крови, при спонтанной и индуцированной продукции в супернатантах биоптатов ткани молочной железы (табл. 1), концентрация CDH1 в супернатантах биоптатов больных ИКНТ, индуцированных ПА (p = 0.007), была статистически значимо выше по сравнению с показателями НЗ.

При сравнении ИВПА на продукцию HRG и CDH1 статистически значимые более высокие ИВПА на продукцию CDH1 были получены при НЗ молочной железы (p = 0.002) за счет индуцированной ПА продукции протеина по сравнению с ИКНТ (табл. 1).

Статистически значимых различий по показателям экспрессии ИГХ маркёров в препаратах биоптатов (табл. 2) между ИКНТ и НЗ не было получено (CII p = 0.268; CD29 p = 0.097; CDH1 p = 0.196). Эти результаты свидетельствуют о том, что несмотря на имеющиеся у пациентов незлокачественные заболевания в их биоптатах были обнаружены клетки, экспрессирующие CII и CD29 и потерявшие способность к экспрессии CDH1, следовательно, данные клетки находятся в состоянии ЭМП. Этот процесс приводит к потере эпителиальных особенностей и приобретению мезенхимальных свойств, таких как подвижность, инвазивность и устойчивость к апоптозу, т.е. к появлению клеточной атипии, что в конечном счете может приводить к их трансформации в злокачественный фенотип [8], которая, однако, зависит от способности иммунной системы индивидуума элиминировать атипические клетки.