Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 490, № 1, стр. 11-14

Трансаминазы (ТА, EC 2.6.1.X) – это пиридоксаль 5'-фосфат (ПЛП)-зависимые ферменты, которые катализируют стереоселективный перенос аминогруппы с аминокислоты или амина на кетокислоту или кетон с образованием новых аминокислоты или амина и нового кетосоединения. Ферментативное трансаминирование – это реакция последовательного двойного замещения с промежуточным переносом аминогруппы на кофактор ПЛП; два субстрата последовательно связываются в одной области активного центра, все стадии реакции обратимы [1]. Как стереоселективные катализаторы переноса аминогруппы трансаминазы интересны для решения задач тонкого органического синтеза – асимметрического аминирования и разделения хиральных аминов [2]. Последнее десятилетие представило ряд ярких примеров применения TA в синтезе фармацевтических препаратов, в том числе ситаглиптина [3] и ингибитора Smo-рецептора [4]. Однако из-за особенностей реакции применение TA ограничено: обратимость реакции приводит к ингибированию продуктами, последовательное связывание двух субстратов в одном центре – к ингибированию субстратами. Эффективное применение TA невозможно как без преодоления этих двух ограничений, так и без разработки подходов к смещению равновесия реакции в сторону продуктов [2].

Как равновесный процесс трансаминирование характеризуется константой равновесия. Диапазон наблюдаемых констант равновесия для реакций трансаминирования составляет 0.016–100 [5, 6]; для некоторых реакций, например для катализируемого аланинглиоксилат трансаминазой человека переноса аминогруппы между глиоксилатом и L-аланином константа равновесия, достигает 9700 [7]. Цель настоящего исследования состояла в оценке влияния свойств кетосубстрата на равновесие реакции трансаминирования, катализируемой термостабильной трансаминазой из археи Thermoproteus uzoniensis (TUZN1299). Ранее было показано, что TUZN1299 активна с L-лейцином, L-изолейцином, L-валином, их неприродными гомологами и соответствующими кетокислотами, а также с положительно заряженными и серосодержащими аминокислотами. Оптимальный рН реакции трансаминирования между 4-метил-2-оксовалератом и L-аланином составил 8.0, оптимальная температура реакции превысила 95°С [8, 9]. Активность фермента не снижалась после пяти часов инкубации при 70°C; после 24 ч инкубации при 70°C потеря активности составила менее 40% [8]. Эти свойства позволили рассматривать TUZN1299 как фермент с высоким биотехнологическим потенциалом. В этом контексте нами проведен сравнительный анализ зависимости глубины превращения субстратов от специфичности TUZN1299 к кетосубстратам для реакций трансаминирования между L-лейцином и пируватом (1) и между L-лейцином и 2-оксобутиратом (2) при 65 °С:

Глубину превращения и константы равновесия обеих реакций рассчитывали из значений концентраций кетосоединений, определенных хроматографически на колонке Source 30S (GE Healthсare), уравновешенной 5 мМ H₂SO₄ с добавлением 5% ацетонитрила. Специфичность TUZN1299 при 65°С к субстратам определяли из зависимостей скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата с последующей обработкой кривой по уравнению Михаэлис–Ментен (табл. 1). Методы выделения и определения активности TUZN1299 приведены в работах [8, 9].

Как следует из табл. 1, при 65°С TUZN1299 наиболее специфична к 4-метил-2-оксовалерату. При этом 4-метил-2-оксовалерат значительно ингибирует активность TUZN1299 (рис. 1). По-видимому, по этой причине k_cat реакций деаминирования L-лейцина и аминирования 4-метил-2-оксовалерата ниже k_cat реакций деаминирования 2-аминобутановой кислоты и аминирования 2-оксобутирата, который не ингибирует активность TUZN1299 (рис. 1). Очевидно также, что L-аланин и пируват не являются специфическими субстратами для TUZN1299.

Рис. 1.

Зависимость отношения наблюдаемой скорости реакции V к максимальной скорости реакции V_max от концентрации 2-оксобутирата (1) и 4-метил-2-оксовалерата (2) в реакции трансаминирования, катализируемой TUZN1299, при 65°С в Na-фосфатном буфере, рН 8.0, в присутствии 20 м/M L-аланина.

Чтобы наиболее адекватно оценить константу равновесия реакции, целесообразно анализировать систему, которая достигает равновесного состояния с противоположных направлений, т.е. систему, которая изначально содержит как субстраты, так и продукты. Однако, поскольку 4-метил-2-оксовалерат ингибирует фермент при концентрациях выше 1 мМ, был применен другой подход: реакцию инициировали в системе, которая содержала только субстраты (L-лейцин и кетосубстрат) в концентрациях 10 мМ, установление равновесия контролировали по уменьшению концентрации 2-оксобутирата или пирувата и по накоплению 4-метил-2-оксовалерата (рис. 2). Начальные скорости реакций (1) и (2) составили 1.2 и 4.5 U/mg соответственно. Равновесие в реакциях было достигнуто через 4 и 2 ч соответственно. Добавление свежей аликвоты фермента в равновесную смесь через 5 ч не привело к изменению достигнутых концентраций компонентов. Концентрации пирувата, 2-оксобутирата и 4-метил-2-оксовалерата были скорректированы с учетом термического разрушения, которое не превысило 5% по истечении 5 ч. L-лейцин, L-аланин и 2-аминобутановая кислота были стабильны при 65°С. Значения константы равновесия реакций (1) и (2) составили 0.08 и 1.66 соответственно. Степень превращения L-лейцина в реакции с пируватом составила около 20%, а в реакции с 2-оксобутиратом превысила 50%. Равновесная концентрация 4-метил-2-оксовалерата достигла 2.1  и 5.63 мМ соответственно. Важно отметить, что в обеих реакциях равновесная концентрация 4-метил-2-оксовалерата превысила порог ингибирования (рис. 1).

Рис. 2.

Установление равновесия в реакции транс- аминирования, катализируемой TUZN1299, в 50 мМ Na-фосфатном буфере, рН 8.0 при 65°С. а – 1.2 мкМ TUZN1299, 10 мМ L-лейцина, 10 мМ пирувата; 1 – убыль пирувата, 2 – накоплению 4-метил-2-оксовалерата. б – 1.2 мкМ TUZN1299, 10 мМ L-лейцина, 10 мМ 2-оксобутирата; 1 – убыль 2-оксобутирата, 2 – накопление 4-метил-2-оксовалерата.

Очевидно, что глубина превращения L-лейцина выше в реакции со специфическим субстратом 2-оксобутиратом, чем в реакции с неспецифическим пируватом. При этом в обеих системах накопление 4-метил-2-оксовалерата неизбежно приводит к снижению скорости прямой реакции. В то же время реакция (2) останавливается при более высокой концентрации 4-метил-2-оксовалерата. Другими словами, в реакции со специфическим 2-оксобутиратом ингибирующий эффект продукта 4-метил-2-оксовалерата ниже и глубина аминирования 2-оксобутирата выше, чем аналогичные характеристики в реакции с пируватом. Учитывая имеющиеся кинетические параметры (табл. 1), можно утверждать, что отношение [S]/K_m > 1 является исходным условием для 2-оксобутирата и быстро достигается для 4-метил-2-оксовалерата в реакции (2). Тогда k_cat становится параметром, который характеризует специфичность TUZN1299 к субстрату в этой системе [10]. Тогда 2-оксобутират в насыщающей концентрации оказывается “специфичнее” 4-метил-2-оксовалерата. Достигнутое преимущество 2-оксобутирата, по-видимому, приводит к сдвигу равновесия в сторону продуктов в реакции (2). Специфичности TUZN1299 к пирувату оказывается недостаточно для достижения сходной глубины превращения в реакции (1).

Таким образом, эффективность аминирования кетосубстрата в реакциях (1) и (2) и степень ингибирования TUZN1299 продуктом – 4-метил-2-оксовалератом – зависят от природы кетосубстрата. Специфичный кетосубстрат, который не ингибирует TUZN1299, сдвигает равновесие в сторону продуктов. Для эффективного аминирования кетосоединений с применением TUZN1299 рекомендуется учитывать свойства образующегося кетопродукта и подбирать аминосубстрат так, чтобы k_cat аминирования кетосубстрата в прямой реакции оказывалась выше k_cat аминирования кетопродукта в обратной реакции при насыщающих концентрациях обоих кетосоединений.