Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 490, № 1, стр. 62-66

Трехмерные структуры хромосом важны не только для упаковки ДНК в ядре, но и для цис-регуляции экспрессии генов. Этот вывод подтверждается обнаружением и изучением топологически ассоциированных доменов, ТАДов (TADs – Topologically Associating Domains) [1], которые соответствуют бэндам в политенных хромосомах дрозофилы. Однако имеются данные, согласно которым ТАДы лишь в некоторых случаях определяют взаимодействия промоторов и энханмеров. Из генетических наблюдений следует, что в регуляции экспрессии генов важную роль играют и межхромосомные контакты. Они происходят между аллелями в гомологичных хромосомах (трансвекция) [2]. Считается, что контакты между негомологичными хромосомами происходят намного реже [3]. С помощью гибридизации in situ физические контакты ядрышек в клетках слюнных желез дрозофилы были обнаружены в разных хромосомах, преимущественно в областях интеркалярного гетерохроматина [4]. Методы Hi-C позволяют довольно точно картировать внутри- и межхромосомные контакты. С помощью метода 4С было обнаружено, что гены рРНК человека образуют контакты со всеми хромосомами, особенно часто в перицентромерных районах, в районах горячих точек двухцепочечных разрывов ДНК, а также в областях, содержащих протяженные (15–50 т.п.н.) метки H3K27ac, которые соответствуют супер-энхансерам [5, 6]. Недавно было продемонстрировано, что супер-энхансеры вовлечены в механизмы регуляции экспрессии генов с помощью разделения фаз в ядре и образования транскрипционных конденсатов или микрокапель [7]. Это означает, что контакты генов рРНК с супер-энхансерами связаны с механизмами разделения фаз. Гетерохроматизация кластеров генов рРНК иницирует репрессию или активацию транскрипции в разных районах хромосом [8]. Все эти данные позволяют предполагать, что физические контакты генов рРНК могут участвовать в трансрегуляции многих генов. Недавно было обнаружено, что контакты генов рРНК могут быть связаны с сайленсингом генов в клетках человека и дрозофилы [9, 10]. Было обнаружено, что вокруг генов DUX человека, расположенных в субтеломерной области хромосомы 4, находятся довольно частые места контактов генов рРНК [9]. Межхромосомные контакты, необходимые для регуляции экспрессии генов, должны пропадать в процессе митоза и восстанавливаются после каждого цикла деления дифференцированных клеток. Для того чтобы выяснить, могут ли другие физиологические причины нарушать контакты генов рРНК с генами DUX в хромосоме 4, мы использовали тепловой шок.

В результате нами впервые обнаружено, что после теплового шока почти все контакты генов рРНК с областью, содержащий гены DUX в хромосоме 4, пропадают. Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что межхромосомные контакты генов рРНК обратимы и высокочувствительны к физиологическим воздействиям. Мы предполагаем, что обратимые межхромосомные контакты генов рРНК важны для глобальной регуляции экспрессии генов с помощью механизма разделения фаз в ядре.

Для анализа контактов генов рРНК в клетках HEK293T использовали метод 4С (Circular Chromosome Conformation Capture), как описано ранее [5]. Для амплификации областей генома, контактирующих с генами рРНК, использовали праймеры

Библиотеки для глубокого секвенирования готовили с помощью набора реактивов Illumina. Секвенирование биологических реплик 4C-рРНК проводили на приборе MiSeq (“Illumina”). Картирование чтений на геном человека версии hg19 проводили с помощью пакета программ BWA. Формат bedGraph использовали для анализа профилей контактов в браузерах IGB (Integrated Genome Browser, “Affymetrix”) и UCSC. Для отбора генов, контактирующих с генами рРНК, отбирали наиболее частые контакты генов рРНК (более 100 чтений 4C-рРНК). В экспериментах с тепловым шоком клетки HEK293T инкубировали 20 мин при температуре 43°C, а затем 2.5 ч при 37°C, как описано ранее [13]. Данные глубокого секвенирования 4C-рРНК помещены в базу данных GEO (accession number GSE49193).

Кластеры генов рРНК человека расположены на малых плечах пяти акроцентрических хромосом 13, 14, 15, 21 и 22. Ранее в хромосоме 4 человека было обнаружено много областей контактов генов рРНК [9]. Метод 4С позволяет количественно оценивать частоту контактов по числу чтений глубокого секвенирования. В данной работе мы детально изучили область контактов в субтеломерной области длиной 137 т.п.н. на длинном плече хромосомы 4. На рис. 1 показаны места контактов генов рРНК.

Рис. 1.

Физическая карта района хромосомы 4 человека длиной 137 т.п.н. и места контактов генов рРНК в ней. Вверху красным цветом показаны десятичные логарифмы числа чтений 4С-рРНК для двух биологических реплик 4С-рРНК после теплового шока (hs+). Ниже, синим цветом, аналогично показано распределение контактов генов рРНК в клетках, не подвергнутых тепловому шоку (hs–). Координаты хромосомы указаны для версии генома человека hg19 (браузер IGB). Некоторые эпигенетические характеристики района приведены согласно данным ENCODE в браузере UCSC для той же версии генома. Указаны треки Genome Segmentations для лимфобластоидных клеток GM12838, эмбриональных стволовых H1-клеток человека H1-hESC и для клеток хронической миелоидной лейкемии K562; данные RNA-Seq для ряда клеточных линий; области открытого хроматина в 125 линиях клеток (трек DNase Clusters); места связывания факторов транскрипции (Transcription Factor ChIP-Seq Clusters) и результаты экспериментов ChIA-PET.

Представлены данные для двух биологических реплик в экспериментах без теплового шока и после него. Видно, что данные в параллельных репликах практически одинаковы. В исходных клетках имеются многочисленные контакты генов рРНК в районе, содержащем гены DUX, и вокруг них. Однако после теплового шока почти все контакты пропадают.

В указанном районе хромосомы 4 область контактов генов рРНК приходится на область репрессированного хроматина, который показан серым или белым цветом на треках состояний хроматина (рис. 1). Только в клетках лимфобластомы (GM12838) гены DUX транскрибируются (показано зеленым). В ряде лимфобластоидных линий, указанных на треках RNA-Seq, также обнаружены транскрипты генов DUX. В наших экспериментах RNA-Seq на клетках HEK293T транскрипты DUX не были обнаружены как до теплового шока, так и после него. В эмбриональных стволовых клетках человека (H1-hESC) данный район репрессирован, хотя в нем и обнаруживается слабый энхансер (показано желтым) в районе гена FRG2, а также видны сайты стартов транскрипции (показано красным). Известно, что гены DUX являются жизненно важными и определяют развитие зиготы человека [12]. Они кодируют факторы транскрипции, содержащие по два гомеобокса. Известно, что гомеодоменсодержащие факторы транскрипции контролируют раннее развитие. Они узнают специфические нуклеотидные последовательности ДНК и запускают транскрипцию определенных генов.

В 125 клеточных линиях, использованных ENCODE для анализа ДНКаза-I гиперчувствительных сайтов, область отрытого хроматина (трек DNase Clusters) в данном районе хромосомы 4 приходится лишь на район гена FRG2 и совпадает с местом связывания факторов транскрипции (трек Txn Factor ChIP). Следовательно, в этих линиях, как и в линии HEK293T, область генов DUX гетерохроматизирована и закрыта для экзогенной нуклеазы.

Независимо на образование хромосомных контактов данной области генома указывают результаты ChIA-PET (Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing) (рис. 1, нижний трек в данных UCSC). Этот метод использует иммунопреципитацию препаратов хроматина после лигирования контактирующих областей хроматина. Данные для антител к РНК полимеразе II свидетельствуют о том, что области хромосомных контактов расположены вокруг генов DUX и гена FRG2.

Таким образом, гены DUX в клетках HEK293T репрессированы и область хромосомы 4, в которой они расположены, контактирует с кластерами генов рРНК. Тепловой шок вызывает нарушение этих контактов. При этом сохраняется репрессированное состояние генов. Эти факты, взятые вместе с данными о том, что в дифференцировке репрессия генов рРНК инициирует репрессию или активацию транскрипции в разных районах хромосом [8], дает основания предполагать, что с генами DUX контактируют неактивные кластеры генов рРНК. В результате происходит трансрепрессия субтеломерной области хромосомы 4, содержащей гены DUX.

Каким образом межхромосомные контакты генов рРНК могут приводить к активации или репрессии соответствующих генов? В последние годы активно обсуждается механизм обратимого разделения жидких фаз в ядре (liquid-liquid phase separation), и образования транскрипционных конденсатов (transcriptional condensates) или микрокапель в ядре, которые являются безмембранными органеллами. Такое разделение фаз может объяснять пространственное сближение разных компартментов ядра и образование межхромосомных контактов [13]. Имеются данные о том, что геномные повторы, к которым относятся гены рРНК и гены DUX, вовлечены в эти механизмы [14, 15]. Поэтому мы предполагали, что механизмы разделения фаз могут объяснять обратимый и быстрый характер формирования контактов кластеров генов рРНК с разными областями хромосом. Действительно, высокая чувствительность контактов генов рРНК к тепловому шоку указывает на динамический характер этих межхромосомных контактов.

Полногеномный анализ изменений в контактах генов рРНК и в экспрессии генов, контактирующих с кластерами генов рРНК под действием теплового шока, будет опубликован отдельно. В настоящее время мы анализируем, какие группы генов образуют контакты с генами рРНК в разных типах клеток, а также изучаем образования транскрипционных конденсатов с участием генов рРНК.