Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 490, № 1, стр. 19-23

Одним из типов антиоксидантов, наиболее активно используемых в фармацевтике, являются природные полифенолы растительного происхождения, проявляющие полезные свойства при терапии целого ряда метаболических заболеваний [1]. Полифенолы опосредуют своё защитное действие с помощью нескольких механизмов, которые в настоящее время интенсивно исследуются. Антиоксидантная активность полифенолов реализуется как путём непосредственного гашения свободных радикалов, так и предотвращением их образования путём хелатирования железа. Кроме того, полифенолы способны активировать антиоксидантные ферменты и ингибировать ферменты, продуцирующие активные формы кислорода (АФК) (липоксигеназы, НАДН-оксидазы, ксантиноксидазы) [2]. Наряду с выраженными антиоксидантными свойствами выявлена способность полифенолов модулировать процесс внутриклеточной передачи сигнала с участием протеинкиназы С и таким образом влиять на различные процессы в клетке [2]. Однако многие аспекты действия полифенолов по-прежнему остаются малоизученными.

Известно, что митохондрии играют фундаментальную роль в процессе поддержания клеточного гомеостаза. Нарушение митохонриальных функций с образованием избыточного количества свободных радикалов наблюдается при некоторых метаболических заболеваниях, включая старение, диабет, канцерогенез, ожирение [3].

Показано, что полифенолы оказывают существенное действие на функции митохондрий. Так, полифенол стильбенового ряда ресвератрол (РСВ) стимулирует экспрессию гена SIRT1 (НАД-зависимой деацетилазы) и улучшает окисление жирных кислот в митохондриях в условиях дефицита карнитинпальмитоилтрансферазы 2 [4]. Положительное влияние на функции митохондрий как в системе in vitro, так и в опытах in vivo оказывают и другие природные полифенолы – мирицитрин, кверцетин, лютеолин, эпигаллокатехин галлат [5, 6]. Было обнаружено, что проантоцианидины также могут смягчать митохондриальные дисфункции, индуцированные пероксидом водорода, за счёт поддержания мембранного потенциала и работы цепи переноса электронов и подавления продукции кислородных радикалов митохондриями [7]. Биофлавоноид гесперидин улучшает энзиматический статус комплексов I–IV цепи переноса электронов [8]. Однако помимо позитивного воздействия полифенолов на митохондриальные функции отмечено и противоположное действие этих соединений на органеллы, связанное с общим нарушением биоэнергетики и запусканием апоптозных реакций [9]. Точный механизм, посредством которого природные полифенолы модулируют функции и динамику митохондрий, остаётся неизвестным.

В данной работе изолированные митохондрии дрожжевых организмов, являющихся прекрасной экспериментальной моделью эукариотической клетки, использовались для выявления механизмов антиоксидантного действия стильбеновых и флавоноидных полифенолов. В качестве объекта исследования использовали дрожжеподобные грибы Dipodascus (Endomyces) magnusii, штамм ВКМ Y-261. Клетки дрожжей выращивали на полусинтетической среде с глицерином (1%) в качестве основного источника углерода, как описано в [10]. Биомассу собирали на поздней логарифмической стадии роста (10–13 г сырого веса на 1 л культуральной среды). Выделение митохондрий осуществляли по методу, описанному ранее [10].

Принимая во внимание тот факт, что митохондриальный компартмент клетки, а именно комплексы I и III цепи переноса электронов, является основным источником свободных радикалов в клетке, на первом этапе работы был исследован уровень АФК в митохондриальной суспензии. Для оценки этого показателя в присутствии полифенолов ресвератрола (РСВ), пиносильвина (ПС), дигидромирицетина (ДГМ), эпигаллокатехина (ЭГК) и дигидрокверцетина (ДГК) (рис. 1) при помощи флуоресцентного красителя Amplex Red (AR) (стоковый 10 мM раствор в ДМСО) митохондрии добавляли в среду для исследования дыхательной активности, содержащую 600 мМ маннит; 20 мМ Tris-HCl, pH 7.4; 0.2 мМ KH₂PO₄; 20 мМ пируват + малат; 0.4 мг/мл митохондриального белка. Затем разносили митохондриальную суспензию по лункам 96-луночного иммунологического планшета для флуоресцентных исследований. Туда же вносили экспериментальные образцы полифенолов в концентрации 10 мкМ, после чего добавляли Amplex Red (Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay Kit, “Sigma”) в конечной концентрации 25 мкМ. Реакцию запускали внесением в реакционную среду пероксидазы хрена (RZ = 0.6 = 150–170 ед/мг), применяя стоковый раствор с концентрацией 0.2 мг/мл. Измерение флуоресценции при длине волны λ = 590 ± 25 нм при возбуждении λ = 530 ± ± 35 нм проводили на фотометре-флуориметре Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader “BeoTek” (США) в течение 15 мин с последующим анализом данных в программе Microsoft Excel.

Рис. 1.

Структурные формулы полифенолов: ресвератрола (1); дигидромирицетина (2); пиносильвина (3); эпигаллокатехина (4); дигидрокверцетина (5).

Результаты исследований представлены на рис. 2. Как видно, базовый уровень продукции АФК в митохондриях дрожжей D. magnusii оказался довольно высоким – более 280 тыс. относительных единиц флуоресценции (рис. 2). Внесение природных полифенолов в концентрации 10 мкМ приводило к уменьшению генерации АФК: в случае РСВ на 65%, ПС и ДГМ примерно на 30%, ЭГК и ДГК на 15% (рис. 2).

Рис. 2.

Влияние полифенолов на скорость генерации АФК (перекиси водорода) in vitro митохондриями дрожжей D. magnusii.

Известно, что некоторые полифенолы и, в частности, наиболее изученный РСВ способны непосредственно взаимодействовать с компонентами электрон-транспортной цепи и регулировать F₀F₁-ATФаза/ATP-синтазную активность [11], уменьшая скорость поглощения кислорода митохондриями животных. Для более детального исследования эффектов полифенолов на изолированных митохондриях дрожжей мы оценивали действие соединений, проявивших наибольшую эффективность в подавлении образования АФК (РСВ, ДГМ и ПС), на дыхательную активность и параметры сопряжения органелл. Потребление кислорода митохондриальной суспензией измеряли полярографически in vitro при 25° С в ячейке с электродами, закрытыми фторопластовой плёнкой, с постоянной разностью потенциалов 660 мВ. Результаты экспериментов представлены в табл 1. Как и в исследованиях по генерации АФК в митохондриальной суспензии, все протестированные полифенолы продемонстрировали подавление дыхательной активности митохондрий (табл. 1). РСВ, ингибирующий скорость дыхания в состоянии до добавления АТФ (состояние 4) более чем в 3 раза и скорость дыхания в состоянии после добавления АТФ (состояние 3) более чем в 5 раз оказался наиболее эффективным. Внесение ПС также уменьшало скорость дыхания митохондрий примерно в 3 и 4 раза в состоянии 4 и 3 соответственно (табл. 1). В то же время ДГМ, уменьшающий уровень генерации АФК в той же степени, что и ПС (рис. 2), ингибировал дыхательную активность митохондрий дрожжей примерно на 20% (табл. 1). Интересно отметить, что параметры сопряжения (показатели дыхательных контролей) в присутствии ДГМ улучшались на 25 и 9%, при добавлении ПС – снижались на 20 и 33% в случае ДК_L и ДК_Ch, соответственно, в то время как при внесении РСВ они практически не изменялись (табл. 1).

Ранее на изолированных митохондриях мозга было выявлено ингибирование поглощения кислорода в присутствии РСВ [11]. Поскольку полифенол не блокировал активность комплекса IV, авторы заключили, что его действие может быть связано с блокированием участка между комплексами I и III. В этом контексте Дескирет-Думас и соавт. [12] продемонстрировали, что низкие концентрации РСВ модулируют отношение НАД+/НАДН за счёт увеличения активности работы I комплекса в митохондриях печени. ДГМ оказывает антиоксидантное действие при индуцированном окислительном стрессе в эндотелиальных клетках человека HUVECs [13]. Однако механизм его действия на изолированные митохондрии также остаётся предметом дискуссий.

Наши результаты продемонстрировали, что природные полифенолы РСВ, ПС и ДГМ также способны ингибировать скорости поглощения кислорода митохондриями дрожжевых грибов D. magnusii. Можно предположить, что уменьшение уровня генерации АФК в присутствии этих метаболитов (рис. 2) обусловлено уменьшением скорости дыхания митохондрий в состоянии 4 (табл. 1). Аналогичные данные были получены в работе [14], свидетельствующей об уменьшении продукции перекиси водорода за счёт уменьшения скорости дыхания митохондрий в состоянии 4 под действием РСВ, однако точный механизм этого явления не был объяснён. Более того, нельзя исключить непосредственное антиоксидантное действие полифенолов на митохондриальные компоненты.

Положение и количество гидроксильных групп в бензольном кольце полифенолов может играть ключевую роль в проявлении их антиоксидантных свойств [15]. Полученные в работе результаты показали, что стильбеновые полифенолы РСВ и ПС, демонстрирующие сходное ингибирование дыхательной активности изолированных митохондрий (табл. 1), в разной степени влияли на скорость генерации АФК (рис. 2), что, вероятно, обусловлено наличием дополнительной гидроксильной группы в молекуле РСВ. Среди сходных по своей структуре исследованных флавоноидов ДГМ, обладающий тремя гидроксильными группами в бензольном кольце Б, был эффективнее как ЭГК с таким же строением кольца Б, так и ДГК, содержащего два гидроксильных остатка в бензольном кольце Б, хотя и в оптимальном для взаимодействия с АФК орто-положении [19 ] . Учитывая менее выраженную способность ДГМ ингибировать интенсивность митохондриального дыхания по сравнению со стильбеновыми полифенолами, можно предположить, что его антиоксидантное действие в основном обусловлено непосредственным взаимодействием с АФК.