Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 490, № 1, стр. 15-18

Селенит натрия (СН) и метилселениновая кислота (МСК) являются широко используемыми потенциальными противоопухолевыми селенсодержащими соединениями, что было неоднократно подтверждено в ряде исследований [1–11]. Известно, что гибель клеток при воздействии на них СН и МСК сопряжена с ЭР-стрессом [1, 2, 11, 12], который связан с сигнальными путями, объединёнными общим триггерным механизмом и представленных триадой трансмембранных белков: PERK, IRE1 и ATF6. Целью данной работы было исследование изменения экспрессии ключевых участников ATF4 и XBP1s двух сигнальных путей: PERK и IRE1 соответственно методом Вестрен-блот анализа при обработке раковых клеток линии F-9 (тератокарцинома семенников мыши) СН и МСК в концентрациях 1 и 10 мкМ.

Ранее нами установлено, что воздействие на клетки F-9 1-мкМ и 10-мкМ СН приводило к снижению жизнеспособности клеток [12], однако не было проведено аналогичных экспериментов относительно МСК. Для установления варианта гибели (апоптоз/некроз) изучаемых клеток после 24 ч воздействия на них СН и МСК в концентрациях 1 и 10 мкМ использовали набор реагентов Apoptosis/Necrosis Detection Kit (“Abcam”, США) в тандеме с флуоресцентной микроскопией. Данный флуоресцентный анализ позволяет детектировать живые клетки (синие, окрашенные CytoCalcein Violet 450), апоптотические (зеленые, окрашенные Apopxin Green) и некротизированные (красные, окрашенные 7-AAD). Клетки F-9 до обработки селенсодержащими соединениями высевали на 96-луночный планшет в среде ДМЕМ, содержащей 10%-ю сыворотку и подращивали в CO₂-инкубаторе до 5 ⋅ 10⁵ клеток/лунку в течение 24 ч, после чего к клеткам добавляли СН и МСК в соответствующих концентрациях. Спустя 24 ч клетки ресуспендировали в буфере для анализа согласно протоколу производителя. Для выявления апоптотических клеток использовали Apopxin Green Indicator, визуализировали с применением канала FITC (Ex/Em = 490/525 нм). Для обнаружения здоровых клеток использовали CytoCalcein 450 (Ex/Em = 405/450 нм), для выявления некротизированных клеток – 7-аминоактиномицин D (Ex/Em = 550/650 нм).

На рис. 1 представлены результаты качественного анализа, дающие информацию о наличии/отсутствии апоптоза или некроза в исследуемых раковых клетках. Они свидетельствуют о том, что после 24-часовой обработки 10-мкМ СН и 10-мкМ МСК в 100% визуализированных клеток наблюдался апоптоз. При воздействии на клетки 1-мкМ СН большая часть клеток не утратила своих адгезивных свойств, остались жизнеспособными, хотя их морфология изменилась (наблюдалось ошаривание клеток). Интересно, что при обработке клеток 1-мкМ МСК приблизительно 50% клеток подверглись апоптозу, тогда как остальные 50% остались жизнеспособными.

Рис. 1.

Флуоресцентный анализ жизнеспособности раковых клеток линии F-9 после 24 ч воздействия на клетки СН и МСК в концентрациях 1 и 10 мкМ. Живые клетки окрашены CytoCalcein Violet 450 (синие), апоптотические клетки окрашены Apopxin Green Indicator (зеленые).

Для установления сигнальных путей, активируемых при обработке исследуемых клеток СН и МСК в каждом конкретном случае, проверили, как меняется экспрессия их ключевых участников методом Вестерн-блоттинга. Для этого клетки подвергали воздействию 1-мкМ и 10-мкМ СН и МСК в течение 24 ч, после чего клетки были лизированы буфером PBS 1× (рН 7.4), содержащем 1 мM PMSF. Количество общего белка в каждом образце измерили колориметрическим методом Бредфорда. Разделение белков проводили методом ПААГ-электорофореза в 12%-м геле, количество белков в каждом из образцов (клеточный лизат) составило 50 мкг. Использовали коммерческие первичные антитела против ATF4-транскрипционного фактора, XBP1-(X-box связывающего белка 1) и контрольного белка GAPDH в разведении 1 : 200, а также вторичные с пероксидазой хрена фирмы Abcam, (США) в разведении 1 : 2000 (рис. 2).

Рис. 2.

Вестерн-блоттинг анализ экспрессии белков (XBP1s, ATF4 и GAPDH) в лизатах раковых клеток F-9 после 24 ч воздействия на них СН и МСК в концентрациях 1 и 10 мкМ методом иммунноблотинга: 1 – количество белка в интактных клетках, 2 –количество белка после воздействия на клетки 1-мкМ СН, 3 – 10-мкМ СН, 4 – 1-мкМ МСК, 5 – 10-мкМ МСК.

Количественную оценку белков проводили с использованием хемидокументирующей системы Fusion Solo (Viber, Франция). Данный эксперимент повторялся трижды (рис. 3). Установлено, что при обработке клеток 1-мкМ МСК экспрессия сплайсированной формы XBP1s значительно усиливалась, что может свидетельствовать об активации IRE1-сигнального пути. XBP1-транскрипционный фактор, который принимает участие в регуляции экспрессии генов, необходимых для функционирования иммунной системы и в регуляции ответа на ЭР-стресс. Активированный IRE1 (индозитол-требующий фермент 1) катализирует удаление нетрадиционного интрона (26 нуклеотидов) из повсеместно экспрессируемой мРНК XBP1u (несплайсированный XBP1, 29.5 кДа), что вызывает сдвиг рамки в кодирующей последовательности XBP1 и трансляцию изоформы XBP1s (сплайсированный XBP1, 55 кДа).

Рис. 3.

Количественная оценка содержания белков XBP1s и ATF4 относительно GAPDH в лизатах раковых клеток F-9 после 24 ч воздействия на них СН и МСК: 1 – количество белка в интактных клетках, 2 – количество белка после воздействия на клетки 1-мкМ СН, 3 – 10- мкМ СН, 4 – 1-мкМ МСК, 5 – 10-мкМ МСК.

Во всех остальных образцах обработанных клеток как СН, так и МСК уровень экспрессии XBP1u и XBP1s приблизительно одинаковый. В случае активации PERK-сигнального пути ожидалось выявить усиление экспрессии ATF4-транскрипционного фактора, вызванное фосфорилированием eIF2α – ключевого участника трансляции белков. Однако при обработке клеток СН и МСК в исследуемых концентрациях уровень экспрессии ATF4 не отличался от контроля (интактные раковые клетки F-9). Возможно, апоптоз раковых клеток, в которых не наблюдалось усиления экспрессии ни ATF4, ни XBP1s, вызван активацией третьего сигнального пути ATF6, что требует более детального анализа и подтверждения в дальнейших исследованиях.