Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 490, № 1, стр. 31-34

Доставка лекарственных средств в ядра клеток-мишеней является перспективным подходом увеличения эффективности противораковой терапии [1]. Однако такая доставка затруднена из-за наличия естественных биологических барьеров: плазматической мембраны, мембраны эндосом, деградации в лизосомах, ядерной мембраны [2].

Системой доставки, позволяющей эффективно преодолевать эти барьеры, являются многофункциональные полипептидные конструкции – модульные нанотранспортеры (МНТ). Их лигандный модуль обеспечивает специфическое связывание транспортера с соответствующим рецептором; эндосомолитический модуль необходим для выхода из эндосом в цитозоль, модуль с сигналом ядерной локализации обеспечивает эффективный транспорт в ядро, модуль-носитель служит для объединения модулей в единую структуру [3].

В разработанных ранее МНТ лигандный модуль, представленный эпидермальным фактором роста (ЭФР) человека, располагался на С-конце молекулы транспортера [4] (далее МНТ-ЭФР). Основываясь на проведенных ранее работах in vitro [5] и in vivo [6–8], мы проверили возможность создания новых МНТ, в которых лигандный модуль, способный специфически связываться с рецептором  к ЭФР (рЭФР), был перенесен на N-конец молекулы (далее ЭФР-МНТ). Это делает С-конец доступным для модификации и расширяет возможности МНТ как платформы для переноса лекарств в ядро клетки-мишени. В качестве лигандного модуля новых МНТ были использованы ЭФР (для ЭФР-МНТ) или антителоподобный белок аффибоди Z₁₉₀₇ (Z₁₉₀₇-МНТ) [9]. Новые транспортеры были охарактеризованы по их способности проникать в ядра и цитотоксическому эффекту эмиттера ЭО ¹¹¹In, доставляемого МНТ в опухолевые клетки-мишени.

Известно, что связывание рЭФР ряда опухолевых клеток с природными лигандами приводит к активации рецептора с последующим запуском внутриклеточных каскадов, усиливающих пролиферацию [10], оказывая проонкогенный эффект. Поскольку в состав исследуемых МНТ входят лиганды к рЭФР, была произведена оценка возможного влияния новых транспортеров на рост клеток-мишеней.

Новые транспортеры были наработаны в клетках E. coli, штамм C3029 (“NEB”, Великобритания), трансформированными плазмидами, кодирующими ЭФР-МНТ и Z₁₉₀₇-МНТ. Ген Z₁₉₀₇ был синтезирован “General Biosystems”, США, на основе опубликованной аминокислотной последовательности [9] и клонирован на N-конец безлигандного МНТ. Модульные нанотранспортеры были очищены методом аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе (“Qiagen”, Германия).

Проверку способности МНТ к рецептор-опосредованной интернализации оценивали методом проточной цитометрии, для чего они были конъюгированы с Alexa Fluor 647 (“Molecular Probes”, США).

Оценку интернализации производили на клетках эпидермоидной карциномы человека A431, сверхэкспрессирующих рЭФР. Клетки культивировали в среде DMEM (“ПанЭко”, Россия) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (ФС) и гентамицина (50 мкг/мл) при 5% CO₂ и 37°С в CO₂-инкубаторе. Клетки были рассажены в 24-луночную плашку (2.5 × 10⁴ клеток/лунка). Спустя 2 суток к клеткам были добавлены по 100 нМ ЭФР-МНТ, MНT-ЭФР и Z₁₉₀₇-МНТ, меченных Alexa Fluor 647. Клетки инкубировали с МНТ 18 ч при 37°C при 5% CO₂ с или без избытка свободного ЭФР. Затем клетки с интернализованными транспортерами промывали, трипсинизировали, удаляя МНТ, находящиеся на поверхности клеток, центрифугировали при 200g в течение 10 мин и анализировали проточной цитометрией с использованием Epics Altra Flow Cytometer (“Beckman Coulter”, США) при возбуждении флуоресценции 633 нм и эмиссии при 675 нм. Для каждой пробы было проанализировано 0.5–1 × 10⁴ клеток. Добавление 2 мкМ свободного ЭФР существенно уменьшало среднюю интенсивность флуоресценции, соответствующей интернализованной клетками фракции МНТ, до 19 ± 1, 38 ± 1 и 42 ± 1% от исходного уровня для МНТ-ЭФР, Z₁₉₀₇-МНТ и ЭФР-МНТ соответственно. Этот результат свидетельствует о рецептор-опосредованном (рЭФР-специфическом) эндоцитозе данных МНТ клетками-мишенями.

Для исследования накопления МНТ в ядрах клеток-мишеней к МНТ был присоединен ¹¹¹In через бифункциональный хелатор p-SCN-Bn-NOTA, как описано ранее [11]. Клетки А431 были рассеяны в 12-луночную плашку (5 × 10⁵ клеток/лунка) в среде DMEM с 10% ФС. Спустя 2 суток клетки были инкубированы 2 ч с ¹¹¹In-NOTA-МНТ (0.6 МБк/мл, 1.9 мкг/мл) в свежей среде, после чего ядра клеток выделяли по описанной ранее методике [12] на льду. Полученные данные свидетельствуют, что все исследуемые МНТ способны к доставке ¹¹¹In в ядра клеток-мишеней, где эффективность действия эмиттера ЭО максимальна (табл. 1).

Исследование влияния МНТ на рост клеток-мишеней проводили на клетках аденокарциномы молочной железы человека MCF-7. За 7 суток до эксперимента клетки переводили на среду DMEM с 0.5% ФС, после чего рассаживали в 24-луночные плашки по 8 тысяч клеток в лунку или 96-луночные плашки по 3 тысячи клеток в лунку. На следующий день к клеткам добавляли МНТ или ЭФР в концентрации 100 нМ. Рост клеток оценивали с помощью МТТ-теста на 10-й день инкубации. Оптическую плотность формазана и фона измеряли с помощью планшетного фотометра Synergy 4 (“Biotek”, США) при 570 и 650 нм соответственно.

Было продемонстрировано, что ЭФР и ЭФР-МНТ приводят к достоверному увеличению роста опухолевых клеток-мишеней, тогда как Z₁₉₀₇-МНТ, МНТ-ЭФР и безлигандный МНТ не оказывают на него воздействия (рис. 1а). Необходимо отметить, что и другой тип МНТ, содержащий фолат в качестве лигандного модуля (МНТ-Ф) [11], в отличие от свободного фолата не вызывал увеличения пролиферации клеток в бесфолатной среде (б/ф) с 10% ФС (рис. 1б).

Рис. 1.

Влияние МНТ на пролиферативную активность клеток-мишеней MCF-7. а – влияние рЭФР-связанных МНТ. б – влияние МНТ-Ф. Среднее значение оптической плотности для контрольных клеток принято за 100% M ± m, n = 4. Звездочкой отмечены обозначены достоверно различающиеся результаты (p < 0.05).

Оценку цитотоксического эффекта ¹¹¹In, доставляемого внутрь опухолевых клеток-мишеней посредством МНТ, производили с помощью метода колониеобразования на клетках культуры А431. В качестве контроля использовали свободный ¹¹¹In. Клетки A431 рассевали в 24-луночную плашку (2 × 10⁴ клеток/лунка) в среде DMEM с 10% ФС. Спустя 2 суток среду заменяли и добавляли ¹¹¹In-NOTA-МНТ (0.02—6.5 МБк/мл), а также свободный ¹¹¹In (0.22–20 МБк/мл). Клетки инкубировали 48 ч при 37°C и 5% CO₂, после чего рассевали в 25-см² флаконы (2 ⋅ 10³ клеток на флакон) в среде DMEM/F12 с 10% ФС. Через 6 суток колонии фиксировали, окрашивали кристаллическим фиолетовым и подсчитывали.

Присоединение ¹¹¹In к МНТ существенно увеличивало его цитотоксичность, наибольший цитотоксический   эффект обнаруживался для ¹¹¹In-NOTA-Z₁₉₀₇-МНТ и ¹¹¹In-NOTA-MНT-ЭФР (табл. 2).

Таким образом, разработаны и охарактеризованы новые МНТ с лигандными модулями на N-конце молекулы: ЭФР-МНТ и Z₁₉₀₇-МНТ, которые способны доставлять эмиттеры ЭО в ядра опухолевых клеток-мишеней, сверхэкспрессирующих рЭФР. Продемонстрировано, что Z₁₉₀₇-МНТ и МНТ-Ф не влияют на пролиферативную активность клеток-мишеней, в отличие от ЭФР, фолата и ЭФР-МНТ, что даёт основания считать их перспективным средством направленной доставки противораковых средств.