Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 490, № 1, стр. 35-38

НЕЙРОЛЕПТИК ХЛОРПРОМАЗИН МОДУЛИРУЕТ Са2+-ОТВЕТЫ В МАКРОФАГАХ

З. И. Крутецкая 1*, Л. С. Миленина 1, В. Г. Антонов 2, академик РАН А. Д. Ноздрачев 13

1 Санкт-Петербургский государственный университет
Санкт-Петербург, Россия

2 Военно-медицинская академия им. C.М. Кирова
Санкт-Петербург, Россия

3 Институт физиологии им. И.П. Павлова Российской Академии наук
Санкт-Петербург, Россия

* E-mail: z.krutetskaya@spbu.ru

Поступила в редакцию 20.06.2019
После доработки 20.06.2019
Принята к публикации 20.06.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

С использованием флуоресцентного Са2+-зонда Fura-2AM впервые показано, что антагонист рецепторов сигма-1 – нейролептик хлорпромазин – значительно подавляет Са2+-ответы, индуцируемые иммуномодуляторами глутоксимом и моликсаном и ингибиторами эндоплазматических Са2+‑АТФаз тапсигаргином и циклопьязониковой кислотой, в перитонеальных макрофагах крыс. Полученные результаты свидетельствуют об участии рецепторов сигма-1 в комплексном сигнальном каскаде, вызываемом глутоксимом или моликсаном и проводящем к увеличению внутриклеточной концентрации Са2+, а также в регуляции депозависимого входа Са2+ в макрофагах.

Ключевые слова: хлорпромазин, рецепторы сигма-1, внутриклеточная концентрация Са2+, макрофаги

Рецепторы сигма-1, экспрессируемые в клетках различных типов, представляют собой уникальные молекулярные шапероны, расположенные в мембране эндоплазматического ретикулума на границе с митохондриями [1]. Взаимодействуя с белками-мишенями, такими как ионные каналы и рецепторы, рецепторы сигма-1 регулируют многие клеточные процессы в норме и патологии [1, 2]. Так, обнаружено, что, взаимодействуя с рецепторами инозитол-1,4,5-трифосфата, рецепторы сигма-1 модулируют процессы Са2+ сигнализации в клетках: мобилизацию Са2+ из депо и вход Са2+ из наружной среды [3].

Рецепторы сигма-1 имеют очень широкий фармакологический профиль. Их лигандами являются различные по химической структуре и фармакологическому действию соединения: антидепрессанты, нейролептики, анальгетики, противосудорожные и противокашлевые средства [4].

Ранее нами было впервые показано, что антагонист рецепторов сигма-1 галоперидол (производное бутирофенона) значительно подавляет обе фазы Са2+-ответов, вызываемых дисульфидсодержащими иммуномодуляторами глутоксимом® (Г, динатриевая соль окисленного глутатиона с d-металлом в наноконцентрации, “ФАРМА-ВАМ”, Россия) и моликсаном® (М, комплекс глутоксима и нуклеозида инозина, “ФАРМА-ВАМ”) [5] и ингибиторами эндоплазматических Са2+-АТФаз тапсигаргином (ТГ) и циклопьязониковой кислотой (ЦПК) [6] в перитонеальных макрофагах крыс.

Для подтверждения участия рецепторов сигма-1 в регуляции процессов Са2+ сигнализации в макрофагах представлялось целесообразным исследовать влияние другого, структурно отличного, антагониста рецепторов сигма-1 на Са2+-ответы, индуцируемые Г и М, а также ТГ и ЦПК, в перитонеальных макрофагах крыс, что и составило предмет настоящего исследования.

В экспериментах использовали антагонист рецепторов сигма-1 – нейролептик фенотиазинового ряда хлорпромазин (ХП, аминазин, торазин) [7], широко используемый для лечения шизофрении.

Эксперименты проводили на культивируемых резидентных перитонеальных макрофагах крыс популяции Wistar при комнатной температуре 20–22°С через 1–2 суток после начала культивирования клеток. Подробно процедура культивирования макрофагов и описание автоматизированной установки для измерения внутриклеточной концентрации Са2+, [Ca2+]i, на базе флуоресцентного микроскопа Leica DM 4000B (“Leica Microsystems”, Германия) изложены нами ранее [8]. Для измерения [Ca2+]i использовали флуоресцентный зонд Fura-2AM (“Sigma-Aldrich”, США). Возбуждение флуоресценции объекта производили при длинах волн 340 и 380 нм, эмиссию регистрировали при длине волны 510 нм. Для избежания фотовыгорания измерения проводили через каждые 20 с, облучая объект в течение 2 с. Значения [Ca2+]i рассчитывали по уравнению Гринкевича [9]. Статистический анализ проводили с применением критерия t Стьюдента. Достоверными считали различия при p ≤ 0.05. На рис. 1 и 2 приведены результаты типичных экспериментов. Данные представлены в виде графика изменения отношения интенсивностей флуоресценции Fura-2AM при длинах волн возбуждающего излучения 340 и 380 нм (F340/F380) во времени, отражающего динамику изменения [Ca2+]i в клетках в зависимости от времени измерения [10].

Рис. 1.

Влияние хлорпромазина на увеличение [Ca2+]i в макрофагах крыс, вызываемое глутоксимом. Здесь и на рис. 2 по оси ординат – отношение интенсивностей флуоресценции Fura-2AM при длинах волн возбуждающего излучения 340 и 380 нм (F340/F380 относительные единицы, отн. ед.); по оси абсцисс – время. а – макрофаги инкубировали в течение 20 мин в присутствии 100 мкг/мл глутоксима в номинально бескальциевой среде, затем вход Са2+ инициировали введением в наружную среду 2 мМ Са2+; б – клетки предварительно инкубировали в течение 10 мин с 25 мкг/мл хлорпромазина в бескальциевой среде, затем добавляли 100 мкг/мл глутоксима, через 20 мин вход Са2+ инициировали введением в наружную среду 2 мМ Са2+. Каждая регистрация получена для группы из 40–50 клеток и представляет собой типичный вариант из 6–8 независимых экспериментов.

Рис. 2.

Влияние хлорпромазина на Са2+-ответы, вызываемые тапсигаргином в макрофагах: а – клетки стимулировали 0.5 мкМ тапсигаргина в номинально бескальциевой среде, затем вход Са2+ инициировали введением в наружную среду 2 мМ Са2+; б – макрофаги предварительно инкубировали в течение 10 мин с 25 мкг/мл хлорпромазина в бескальциевой среде, затем добавляли 0.5 мкМ тапсигаргина, после чего вход Са2+ инициировали введением в наружную среду 2 мМ Са2+.

В контрольных экспериментах было показано, что инкубация макрофагов в течение 20 мин с 100 мкг/мл Г (рис. 1а) или 100 мкг/мл М (не представлено) в бескальциевой среде вызывает медленно нарастающее увеличение [Ca2+]i , отражающее мобилизацию Са2+ из внутриклеточных депо. В среднем (n = 6 для каждого из препаратов) через 20 мин после добавления агентов [Ca2+]i увеличивалась от базального уровня 90 ± 18 до 135 ± 18 нМ для Г и 134 ± 20 нМ для М. При введении в наружную среду 2 мМ Са2+ наблюдалось дальнейшее повышение [Ca2+]i , отражающее депозависимый вход Са2+ в цитозоль (рис. 1а). В среднем (n = 6) увеличение [Ca2+]i во время входа Са2+ составило 223 ± 22 и 202 ± 20 нМ для Г и М соответственно.

В наших экспериментах впервые было обнаружено, что преинкубация макрофагов с 25 мкг/мл ХП в течение 10 мин до введения 100 мкг/мл Г приводила к значительному подавлению как мобилизации Са2+ из депо (на 58.5 ± 4.6%, n = 7), так и последующего депозависимого входа Са2+ в клетку (на 59.1 ± 6.1%, n = 7), индуцируемых Г (рис. 1б). Сходные данные были получены в опытах по влиянию 25 мкг/мл ХП на Са2+-ответы, вызываемые 100 мкг/мл М (не представлено). В среднем (n = 8) ХП вызывал подавление мобилизации Са2+ из депо на 43.2 ± 8.9% и подавление депозависимого входа Са2+ в клетку на 52.3 ± 9.1%, индуцированных М.

Добавление 0.5 мкМ ТГ к макрофагам, находящимся в бескальциевой среде, вызывает незначительное увеличение [Ca2+]i, отражающее мобилизацию Са2+ из внутриклеточных Са2+-депо (рис. 2а). В среднем (n = 7) увеличение [Ca2+]i во время фазы мобилизации составило 26 ± 7 нМ (рис. 2а). При последующем введении в наружную среду 2 мМ Са2+ наблюдался депозависимый вход Са2+ в цитозоль (рис. 2а). В среднем (n = 7) увеличение [Ca2+]i во время входа Са2+ составило 160.2 ± ± 20.5 нМ. Сходные результаты мы получили при использовании 10 мкМ ЦПК (не представлено). В среднем (n = 7) увеличение [Ca2+]i, отражающее мобилизацию Са2+ из внутриклеточных Са2+-депо, составило 37.8 ± 9.8 нМ, а увеличение [Ca2+]i во время депозависимого входа Са2+ составило 150.2 ± 23.7 нМ.

Впервые обнаружено, что преинкубация макрофагов с 25 мкг/мл ХП в номинально бескальциевой среде в течение 10 мин до введения 0.5 мкМ ТГ вызывает значительное подавление обеих фаз Са2+-ответа, индуцированного ТГ (рис. 2б). Так, подавление фазы мобилизации Са2+ из депо составило 59.3 ± 8.2% (n = 7), а депозависимого входа Са2+ – 68.2 ± 10.4% (n = 7). Сходные результаты были получены в опытах с применением 10 мкМ ЦПК (не представлено). Подавление ХП мобилизации Са2+ из депо составило 40.2 ± 9.1% (n = 7), а подавление депозависимого входа Са2+ – 57.6 ± ± 11.3% (n = 7).

Таким образом, в настоящей работе мы впервые на перитонеальных макрофагах крыс показали, что антагонист рецепторов сигма-1 нейролептик фенотиазинового ряда ХП подавляет обе фазы Са2+-ответов, вызываемых Г или М, а также ТГ и ЦПК, в макрофагах. Результаты согласуются с данными исследований других авторов, которые обнаружили, что ХП подавляет мобилизацию Са2+ из депо и последующий депозависимый вход Са2+, вызываемые АТФ или ТГ, в клетках лейкоза человека (линия HL-60) [11] и ингибирует депозависимый вход Са2+, индуцируемый брадикинином или ТГ в клетках феохромоцитомы крыс (линия PC12) [12]. Обнаружено также, что антагонисты сигма-1 рецепторов (BD1063 и BD1047) ингибируют вход Са2+, индуцируемый гистамином в эндотелиальных клетках подкожной вены ноги человека [13]. Кроме того, известно [14], что ХП ингибирует потенциалзависимые Са2+-каналы в клетках разных типов.

Результаты настоящей и более ранних работ [5, 15] о подавлении лигандами рецепторов сигма-1 Са2+-ответов, вызываемых Г и М в макрофагах, свидетельствуют об участии рецепторов сигма-1 в комплексном сигнальном каскаде, запускаемом Г или М и приводящем к увеличению [Ca2+]i в перитонеальных макрофагах крыс. Результаты указывают также на нежелательность совместного применения в клинической практике препаратов Г или М и нейролептика ХП.

Полученные нами данные свидетельствуют также об участии рецепторов сигма-1 в регуляции депозависимого входа Са2+, индуцируемого дисульфидсодержащими иммуномодуляторами и ингибиторами эндоплазматических Са2+-АТФаз, в перитонеальных макрофагах крыс и позволяют рассматривать рецепторы сигма-1 в качестве нового регуляторного компонента сигнального комплекса депозависимого входа Са2+ в макрофагах.

Список литературы

  1. Rousseaux C.G., Greene S.F. // J. Recept. Signal Transduct. 2016. V. 36. P. 327–388.

  2. Su T.-P., Hayashi T., Maurice T., et al. // Trends Pharmacol. Sci. 2010. V. 31. P. 557–566.

  3. Hayashi T., Su T.-P. // Cell. 2007. V. 131. P. 596–610.

  4. Cobos E.J., Entrena J.M., Nieto F.R., et al. // Curr. Neuropharmacol. 2008. V. 6. P. 344–366.

  5. Крутецкая З.И., Миленина Л.С., Наумова А.А., Бутов С.Н., Антонов В.Г., Ноздрачев А.Д. // ДАН. 2017. Т. 472. № 6. С. 723–725.

  6. Крутецкая З.И., Миленина Л.С., Наумова А.А., Бутов С.Н., Антонов В.Г., Ноздрачев А.Д. // ДАН. 2018. Т. 480. № 5. С. 613–616.

  7. Itzhak Y., Ruhland M., Krahling H. // Neuropharmacol. 1990. V. 29. P. 181–184.

  8. Миленина Л.С., Крутецкая З.И., Наумова А.А., Бутов С.Н., Крутецкая Н.И., Антонов В.Г. // Цитология. 2015. Т. 57. № 7. С. 518–525.

  9. Grynkiewicz G., Poenie M., Tsien R.Y. // J. Biol. Chem. 1985. V. 260. P. 3440–3450.

  10. Xie Q., Zhang Y., Zhai C., et al. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 16 559–16 566.

  11. Harper J.L., Daly J.W. // Drug Dev. Res. 1999. V. 47. P. 107–117.

  12. Choi S.-Y., Kim Y.-H., Lee Y.-K., et al. // British J. Pharmacol. 2001. V. 132. P. 411-418.

  13. Amer M.S., McKeown L., Tumova S., et al. // British J. Pharmacol. 2013. V. 168. P. 1445–1455.

  14. McNaughton N.C., Green P.J., Randall A.D. // Acta Physiol. Scand. 2001. V. 173. P. 401–408.

  15. Крутецкая З.И., Миленина Л.С., Наумова А.А., Бутов С.Н., Антонов В.Г., Ноздрачев А.Д. // ДАН. 2018. Т. 481. № 5. С. 570–572.

Дополнительные материалы отсутствуют.