Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 490, № 1, стр. 77-80

Постоянство физико-химических параметров крови, жидкостей внутренней среды является важнейшим условием полноценной жизни человека и млекопитающих животных [1]. Прием пищи, воды, жизнь в разных климатических условиях неизбежно отражаются на осмоляльности сыворотки крови, концентрации в ней различных веществ. Согласно современным представлениям, после того как вода всосалась в кишечнике, наступает гипоосмоляльность крови. Эти изменения физико-химических параметров жидкостей внутренней среды воспринимают интерорецепторы, в том числе осморецепторы. Сигналы от них влияют на поведение (чувство жажды), изменяется секреция вазопрессина, что вызывает перестройку деятельности почек [2, 3]. С учётом исключительного значения стабильности осмоляльности крови для поддержания объёма клеток различных органов возникло предположение, что могут существовать физиологические механизмы, смягчающие сдвиги гомеостаза и ускоряющие восстановление осмоляльности крови при поступлении избытка воды во внутреннюю среду. Задача настоящей работы состояла в изучении последовательности включения физиологических механизмов осмотического гомеостаза, обеспечивающих поддержание постоянства осмоляльности сыворотки крови.

Эксперименты проведены на крысах линии Вистар. Животные имели свободный доступ к воде и получали стандартный гранулированный корм (ООО “Аллер Петфуд”, Россия). Утром в день эксперимента крыс не кормили, но они могли пить воду без ограничения. Содержание животных и проведение экспериментов выполнялось в соответствии с Российскими и международными правилами по работе с лабораторными животными. Для воздействия на систему осморегуляции неанестезированным крысам вводили воду зондом в желудок в объёме 5 мл на 100 г массы тела. Окситоцин (“Sigma-Aldrich”, США) и эксенатид, миметик глюкагоноподобного пептида-1 (ГПП-1), растворяли в 0.9%-м растворе NaCl. Синтез эксенатида был выполнен на кафедре химии природных соединений химического факультета СПбГУ под руководством М.И. Титова. Внутримышечно инъецировали окситоцин или эксенатид в дозах 0.015 нмоль в объёме 0.1 мл на 100 г массы тела. Контролем служили животные с введением водной нагрузки и инъекцией 0.1 мл 0.9%-го раствора NaCl на 100 г массы тела.

Во время опыта крыс помещали в индивидуальные клетки-пеналы с проволочным дном, через которое моча по воронке стекала в пробирку. Диурез регистрировали при спонтанных мочеиспусканиях в течение 2 ч. Кровь у крыс брали из сонной артерии под золетиловым наркозом в дозе 5 мг на 100 г массы тела. Пробы крови для определения концентрации ГПП-1 собирали в охлажденные пробирки с К₃ЭДТА, центрифугировали при температуре t = +4°С на Mikro 22R (“Hettich”, Германия), образцы плазмы крови до проведения анализа хранили при t = –20°С.

Концентрацию ГПП-1 определяли с применением наборов GLP-1 Total ELISA (“Millipore”, США), для измерения концентрации окситоцина в моче использовали иммуноферментные наборы ELISA (“Enzo Life Sciences”, США). Считывание оптической плотности осуществляли в 96-луночных планшетах по методике тест-системы на автоматическом ридере ELx808 (“Bio-Tek Instruments”, США). Для получения сыворотки крови использовали центрифугу Mikro 20 (“Hettich”, Германия), 8000 об/мин, 15 мин. Осмоляльность проб сыворотки крови и мочи определялась криоскопическим методом на микроосмометре 3320 (“Advanced Instruments”, США). Концентрация ионов Na и K в сыворотке крови измерялась с помощью ионоселективного блока на автоматическом биохимическом анализаторе Erba XL-200 (“Erba-Lachema”, Чехия). Измерение концентрации ионов Mg и Ca в пробах проводилось в воздушно-ацетиленовом пламени на атомном абсорбциометре АА-6200 (“Shimadzu”, Япония).

Показатели функций почек рассчитывали по стандартным формулам и нормализовали на массу тела. Все данные представлены в виде М ± m. Сравнение между группами проводили с использованием одно- или двухфакторного дисперсионного анализа и теста Холм–Шидака для попарного сравнения средних. Различия считали статистически значимыми при р < 0.05.

После введения воды по зонду в желудок крысе её всасывание в кишечнике вызывает снижение осмоляльности сыворотки крови и концентрации в ней ионов натрия и кальция (рис. 1, табл. 1), концентрация ионов Mg и К не уменьшалась. Гипоосмоляльность сыворотки приводит к поступлению воды в клетки по осмотическому градиенту, что увеличивает их объём. Эти изменения постепенно устраняются организмом благодаря выведению почкой осмотически свободной воды (рис. 2).

Рис. 1.

Динамика осмоляльности Р_осм и концентрации глюкогоноподобного пептида-1 (ГПП-1) в сыворотке крови у крыс после водной нагрузки. Стрелка – введение воды в желудок. Количество обследованных животных в каждой точке на всех рисунках – 10. *p < 0.05 по сравнению с исходным периодом в контроле (0 мин).

Рис. 2.

Динамика выведения осмотически свободной воды ${{С}_{{{{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}{\text{O}}}}}$ почкой после водной рагрузки (ВН) и инъекции 0.015 нМ окситоцина (ОТ) с ВН или 0.015 нМ эксенатида (экс) с ВН. Стрелка – введение ВН и инъекция регуляторных пептидов. *p < 0.01 по сравнению с ВН.

Естественно, физиологические изменения в организме после питья избытка воды могут неблагоприятно отражаться на водно-солевом гомеостазе, развивается гипоосмоляльность, этот эффект смягчается системой осморегуляции. Один из таких способов был установлен много лет назад: это условный рефлекс на питье воды, что увеличивало диурез [4]. Нами было показано, что в ответ на питьё воды растёт секреция в кровь ГПП-1 [5] и окситоцина [6]. Физиологически важно проанализировать, есть ли зависимость между изменением осмоляльности сыворотки крови и секрецией ГПП-1, как функционирует каскадная система и обеспечивает ли она смягчение резких сдвигов осмоляльности жидкостей внутренней среды. Критерием эффекта был избран расчёт времени, необходимого для выделения почкой 50% воды, которая была введена по зонду в желудок. Основой расчёта служило измерение времени экскреции почкой не общего объёма мочи, а выделения осмотически свободной воды [7], так как введенная в желудок вода и осмотически свободная вода идентичны по физико-химических характеристикам практически полному отсутствию в них растворенных веществ.

Введение воды в желудок вызывает увеличение концентрации ГПП-1 наряду с уменьшением осмоляльности сыворотки крови (рис. 1). Этот гормон быстро разрушается в сыворотке, поэтому для инъекции крысе был использован его миметик – эксенатид, который воспроизводит физиологический эффект ГПП-1, но медленнее инактивируется [8]. Инъекция эксенатида ускоряет выведение осмотически свободной воды почкой (рис. 2). У крыс контрольной группы после водной нагрузки выведение почкой 50% воды за счёт экскреции осмотически свободной воды требует 112 ± 4 мин, после инъекции эксенатида и водной нагрузки этот эффект достигается вдвое быстрее, он снижается и при инъекции окситоцина (рис. 3). Введение воды увеличивает количество окситоцина, выделяемого с мочой. За 120 мин в контроле экскреция окситоцина составляла 289 ± 29 пг, после 5% водной нагрузки 711 ± 77 пг (р < 0.002). Полученные результаты показывают, что организм млекопитающих обладает механизмами противодействия сдвигу физико-химических параметров жидкостей внутренней среды (рис. 2, 3). Этот эффект после питья воды основан на стимуляции секреции ГПП-1, с током крови он достигает почек, в котором уменьшается реабсорбция жидкости в проксимальном отделе нефрона. Бòльшие объёмы жидкости поступают в дистальные отделы нефрона, в них реабсорбируются ионы и образуется осмотически свободная вода. Эффект ГПП-1, как и окситоцина, состоит в том, что быстрее выделяется осмотически свободная вода почкой (рис. 2, 3) и восстанавливается осмотический гомеостаз.

Рис. 3.

Время Т экскреции почкой крыс 50% введенной воды. 1 – водная нагрузка (ВН), 2 – инъекция 0.015 нМ эксенатида с ВН, 3 – инъекция 0.015 нМ окситоцина с ВН. ^#p < 0.01 по сравнению с ВН.

Таким образом, полученные результаты качественно меняют существующие представления о механизме восстановления водно-солевого гомеостаза при гипергидратации. По современным концепциям в основе реакции организма на потребление воды лежит стимуляция осморецепторов после всасывания воды в кишечнике [3, 9]. Полученные данные показывают, что в организме сформировалась каскадная система смягчения физико-химических сдвигов сыворотки крови после введения воды в желудок. Она может включать условный рефлекс, повышение секреции ГПП-1, усиление секреции окситоцина, уменьшение секреции вазопрессина нейрогипофизом. На повышение концентрации этих гормонов почка реагирует уменьшением реабсорбции жидкости в этом сегменте нефрона [10], что снижает всасывание ультрафильтрата в этом канальце и бòльший объем жидкости достигает дистальных отделов нефрона [9], где ускоряется образование и выведение осмотически свободной воды почкой, восстановление осмоляльности крови.