Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 490, № 1, стр. 55-58

РЕДАКТИРОВАНИЕ ГЕНОМА КАК ПОДХОД К ИССЛЕДОВАНИЮ ПЕРЕПРОГРАММИРОВАНИЯ ТРАНСКРИПЦИИ in vivo

Ю. Ю. Силаева 1*, В. А. Калмыков 1, Е. А. Варламова 12, Е. Н. Коршунов 1, Д. С. Коршунова 1, М. В. Кубекина 1, А. А. Штиль 12, И. Ронинсон 13, А. В. Дейкин 14**

1 Институт биологии гена Российской Академии наук
Москва, Россия

2 Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России
Москва, Россия

3 Университет штата Южная Каролина
Коламбия, США

4 Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии
Москва, Россия

* E-mail: silaeva@genebiology.ru
** E-mail: alexei@deikin.ru

Поступила в редакцию 10.12.2019
После доработки 10.12.2019
Принята к публикации 10.12.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

Опосредованное протеинкиназой CDK8 перепрограммирование транскрипции существенно для процессов, сопровождающихся интенсивной экспрессией генов. Конститутивный нокаут гена cdk8 летален на стадии морулы. Для исследования роли CDK8 во взрослом организме в геном мыши внесена мутация F97G в третий экзон гена cdk8. Согласно предварительным экспериментальным данным, эта мутация должна привести к уменьшению киназной активности CDK8. Для редактирования генома лабораторных мышей была использована технология CRISPR/Cas9, при которой внесение двуцепочечного разрыва происходило на расстоянии 128 пар нуклеотидов от планируемого сайта вносимой мутации. Для внесения мутации была использована матрица для гомологичной репарации в составе плазмидной ДНК, с гомологичными плечами 903 и 484 п.н. в 5'–3' область от точки двуцепочечного разрыва соответственно. В результате получены мыши с сайтспецифичнами целевыми мутациями в третьем экзоне гена cdk8. Показана высокая эффективность внесения мутации на расстоянии в 128 пар нуклеотидов от места двуцепочечного разрыва. Впервые получены животные с мутацией F97G в каталитическом домене CDK8. Полученные мутантные по гену cdk8 мыши будут в последующих исследованиях использованы для моделирования процессов, сопровождающихся перепрограммированием транскрипции.

Ключевые слова: редактирование генома млекопитающих, CRISPR/Cas9, генетически модифицированные животные, протеинкиназа CDK8

Технология редактирования генома CRISPR/ Cas9 позволяет создавать животных, несущих точечные мутации в геноме, которые в том числе могут приводить к аминокислотным заменам в активных центрах различных белков. Этот инструмент можно использовать для исследования функций отдельных доменов транскрипционных факторов.

Опосредованная CDK8 регуляция транскрипции существенна для процессов, сопровождающихся интенсивной экспрессией генов: в эмбриональном развитии, активации иммунокомпетентных клеток, гистогенезе [15]. В патологических ситуациях ингибирование CDK8 снижает про-пролиферативный эффект эстрогенов в клетках рака молочной железы и ограничивает рост метастатических очагов [6, 7]. CDK8 рассматривается как терапевтическая мишень; фармакологические ингибиторы перепрограммирования транскрипции проходят первоначальные испытания.

Исследования функций CDK8 ограничены трудностью моделирования in vivo: нокаут cdk8 в эмбрионах мышей летален [8]. Поэтому требуется редактирование генома взрослых особей. Первоначальный подход к решению этого вопроса – внесение “слабых” мутаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую киназный домен гена cdk8 мыши, и проверка выживаемости эмбрионов. В культуре клеток рака прямой кишки человека мутация в экзоне 3 гена cdk8 (замена остатка фенилаланина в положении 97 на глицин; F97G) приводит к снижению фосфорилирования STAT1 под влиянием гамма-интерферона [9]. Мы предположили, что внесение указанной мутации не окажется летальным для мыши, но снизит киназную активность CDK8.

Цель исследования – разработать методологию редактирования генома для получения жизнеспособных особей с мутацией гена cdk8.

Технология редактирования генома CRISPR/ Cas9 предусматривает различные формы доставки в клетки эндонуклеазы Cas9 (белок, РНК, ДНК) и матрицы для репарации (одно- или двухцепочечная ДНК, линеаризованная или плазмидная) в клетки. В каждом случае необходимо взвешивать все преимущества и недостатки различных комбинаций системы для достижения максимально эффективного результата. При этом в работах по получению генетически модифицированных животных эффективным считается эксперимент, приведший к получению жизнеспособного трансгена. Мы использовали вариант с двумя плазмидными векторами, внесением двухцепочечного разрыва в одной точке геномной ДНК и матрицей для репарации, содержащей короткие гомологичные плечи. В работе использованы мыши F1(CBAxC57BL/6) (питомник “Столбовая”). Технология получения генетически модифицированных животных и условия их содержания опубликованы нами ранее [10, 11]. Для внесения целевой мутации использовали систему CRISPR/Cas9; направляющие РНК подбирали с помощью Web-инструментов CHOP-CHOP [12]. Для идентификации потенциальных дополнительных сайтов узнавания “нежелательного” (off-target) редактирования использовали Web-инструмент E-CRISP-Evaluation [13]. Гены, кодирующие эндонуклеазу Cas9 и направляющие РНК, были встроены в вектор pX330 [14]. ДНК-матрица, используемая для гомологичной рекомбинации, клонирована в вектор pSK по сайтам рестрикции ApaI и XbaI.

Для внесения целевой мутации по результатам биоинформационного анализа выбрана направляющая РНК, комплементарная последовательности P1 (табл. 1, табл. S1 в дополнительных материалах) в интроне между экзонами 3 и 4. Точка целевой мутации отстоит от сайта внесения двухцепочечного разрыва в 5' область на 128 п.н. (рис. 1а).

Таблица 1.

Получение мышей с мутацией F97G в экзоне 3 гена cdk8

Использовано реципиентов Транспланти- ровано клеток Количество родивших самок Количество рожденных мышат Из них с мутацией F97G
22 137 4 8 1
Таблица S1.

Основные олигонуклеотидные последовательности, использованные в работе. Жирным шрифтом обозначены сайты узнавания рестриктазы XhoI и точки внесения мутаций

P1 CAGTCCGTGTACTGCCAACCTGG
P2 CTCGAGTTGTCCTTCTCCTACCAGCG
P3 CTCGAGAGCCTCATAGCAGAAACCGTC
P4 ACAGTTAGCTTCCACTGCACTAGGAGTCACCTTACAGAGTAACAGTCCGTGTACTGCCAACCTAGTGGCTTTTGCTTTGTCCA
P5 GACAAAGCAAAAGCCTCTAGGTTGGCAGTACACGGACTGTTACTCTGTAAGGTGACTCCTAGTGCAGTGGAAGCTAACTGTTT
P6 GACAAAGCAAAAGCCTCTAGGTTGGCAGTACACGGACTGTTACTCTGTAAGGTGACTCCTAGTGCAGTGGAAGCTAACTGTTT
P7 GACAAAGCAAAAGCCTCTAGGTTGGCAGTACACGGACTGTTACTCTGTAAGGTGACTCCTAGTGCAGTGGAAGCTAACTGTTT
P8 CTTAAGCACCCAAACGTCATCT
P9 TCTCAAGCCTGACTGAGAACAG
P10 5'-/ROX/TGCTGATCGGAAAGTATGGCTTCTCGGC/BHQ-2/-3'
P11 5'-TCTAGAGGACCTGAGTTTGATCAC-3'
P12 5'-ATGCTCACCCCAGAAGTACTAC-3'
P13 CTTAAGCACCCAAACGTCATCT
Рис. 1.

Генетическая конструкция для внесения мутации F97G в экзоне 3 гена cdk8 и результаты секвенирования животных F0. a – положение направляющей РНК в экзоне 3 и сайт разрезания; б – схема матрицы для гомологичной рекомбинации в составе вектора pSK. Указаны клонированная область генома, экзона 3, точки внесения мутаций в ген и в PAM сайт, а также место внесения разреза; в, г – анализ секвенирования по Сэнгеру 3'- и 5'-области экзона 3 гена cdk8 первичных генетически модифицированных животных. Приведены данные для ДНК дикого типа (CDK8wt), матрицы для репарации (pSK + CDK8) и мышей, в геноме которых выявлены мутации (CDK8 1.1, CDK8 1.2).

Мутантная матрица для гомологичной репарации была амплифицирована с геномной ДНК мыши с помощью праймеров P(2, 3). Для клонирования в pSK вектор в нуклеотидную последовательность праймеров внесены сайты узнавания рестриктазой XhoI. Затем в клонированную матрицу для гомологичной репарации (с “плечами” –983 + 484 п.н. по отношению к точке разреза) с помощью праймеров P(4, 5) внесены мутации в область PAM сайта TGG>TGT (для предотвращения повторного узнавания отредактированной области белком Cas9) и в область целевой мутации TTT(F97)>GGC(G97): P(6,7) (рис. 1б). Для микроинъекций смешивали плазмидные векторы с Cas9-sgRNA (px330) и матрицей для гомологичной репарации в составе вектора pSK в равных соотношениях (1 нг/мкл).

Генотип мышат через 10 дней после рождения анализировали с помощью ПЦР с праймерами (P8, 9) и зондом (P10), специфичным к мутантному аллелю. Для секвенирования по Сэнгеру областей генома, содержащих целевую мутацию и PAM сайт, с геномной ДНК с помощью праймеров (P11, 12) получен ампликон размером 1784 п.н. Важно отметить, что сайты отжига праймеров находятся за пределами “плечей” рекомбинационной матрицы. Секвенирование по Сэнгеру области генома, содержащей целевую мутацию, проводили с праймером (P13). Для секвенирования области генома, содержащей PAM сайт, использовали праймер (P14).

Продукт ПЦР с целевой мутацией был идентифицирован в геноме только одной мыши - cdk8 1.1 (рис 1в). Результаты секвенирования оценивали с помощью пакета алгоритмов SAM [15]; измененная матрица ДНК составила 20–25% от анализированной. Таким образом, редактирование области гена cdk8 позволило получить “мозаичную” трансгенную мышь (cdk8 1.1).

От мышей, в которых были найдены изменения в геноме, было получено потомство. В результате был получен один гетерозиготный самец, который содержит мутацию F97G в гене cdk8. Таким образом, показана высокая эффективность внесения мутации на расстоянии 128 п.н. от места двуцепочечного разрыва с использованием плазмидной матрицы для гомологичной репарации. Мыши с мутацией F97G в белке CDK8 введены в гетерозиготную линию.

Список литературы

  1. Fant C., Taatjes D. Regulatory Functions of the Mediator Kinases CDK8 and CDK19 // Transcription. 2019. V. 10. P. 76–90.

  2. Chen M., Liang J., Ji H., et al. CDK8/19 Mediator Kinases Potentiate Induction of Transcription by NFκB // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2017. V. 114. P. 10208–10213.

  3. Steinparzer I., Sedlyarov V., Rubin J.D., et al. Transcriptional Responses to IFN-γ Require Mediator Kinase-Dependent Pause Release and Mechanistically Distinct CDK8 and CDK19 Functions // Mol. Cell. 2019. pii: S1097-2765(19)30589-1.

  4. McDermott M., Chumanevich A., Lim C., et al. Inhibition of CDK8 Mediator Kinase Suppresses Estrogen Dependent Transcription and the Growth of Estrogen Receptor Positive Breast Cancer // Oncotarget. 2017. № 8. P. 12 558–12 575.

  5. Liang J., Chen M., Hughes D., et al. CDK8 Selectively Promotes the Growth of Colon Cancer Metastases in the Liver by Regulating Gene Expression of TIMP3 and Matrix Metalloproteinases // Cancer Res. 2018. V. 78. P. 6594–6606.

  6. Guo Z., Wang G., Lv Y., et al. Inhibition of CDK8/CDK19 Activity Promotes Treg Cell Differentiation and Suppresses Autoimmune Diseases // Front. Immunol. 2019. № 10.1988.

  7. Amirhosseini M., Bernhardsson M., Lång P., et al. Cyclin-Dependent Kinase 8/19 Inhibition Suppresses Osteoclastogenesis by Downregulating RANK and Promotes Osteoblast Mineralization and Cancellous Bone Healing // J. Cell Physiol. 2019. P. 1–14https://doi.org/10.1002/jcp.28321 [Epub ahead of print].

  8. Westerling T., Kuuluvainen E., Makela T. Cdk8 is Essential for Preimplantation Mouse Development // Mol. Cell Biol. 2007. V. 27. P. 6177–6182.

  9. Galbraith M., Andrysik Z., Pandey A., et al. CDK8 Kinase Activity Promotes Glycolysis // Cell Rep. 2017. V. 21. P. 1495–1506.

  10. Silaeva Yu., Kirikovich Yu., Skuratovskaya L., et al. Optimal Number of Embryos for Transplantation in Obtaining Genetic-Modified Mice and Goats // Russ. J. Dev. Biol. 2018. № 49. P. 356–361.

  11. Silaeva Y., Kalinina A., Vagida M., et al. Decrease in Pool of T Lymphocytes with Surface Phenotypes of Effector and Central Memory Cells under Influence of TCR Transgenic β-Chain Expression // Biochemistry (Moscow). 2013. V. 78. № 5. P. 549–559.

  12. Labun K., Montague T.G., Krause M., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR Web Toolbox beyond Genome Editing // Nucleic Acids Res. 2019. V. 47. № 1. P.171–174. https://doi.org/10.1093/nar/gkz365

  13. Heigwer F., Kerr G., Boutros M. E-CRISP: Fast CRISPR Target Site Identification // Nat. Methods. 2014. V. 11. P. 122–123.

  14. Cong L., Ran F., Cox D., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. // Science. 2013. V. 21, № 2. P. 265.

  15. Tang M., Cheng L., Jia R., et al. Identification of Transcription Factors and Single Nucleotide Polymorphisms of Lrh1 and Its Homologous Genes in Lrh1-Knockout Pancreas of Mice // BMC Med. Genet. 2014. V. 15. P. 43.

Дополнительные материалы отсутствуют.