Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 496, № 1, стр. 61-65

Разнообразные биолюминесцентные системы находят широкое применение в различных областях биологии и медицины, а люциферин-люциферазная реакция лежит в основе множества аналитических методов, применяемых in vivo и in vitro [1–3]. Несмотря на то что явление биолюминесценции изучается достаточно давно, далеко не все варианты механизмов, лежащих в ее основе, уже описаны. На сегодняшний день путь биосинтеза люциферина из стандартных клеточных метаболитов полностью изучен только для систем морских бактерий и высших грибов порядка Agaricales (более 80 видов) [4–7]. Биолюминесцентная система грибов описана недавно, однако возможность ее применения для анализа в различных гетерологических системах уже доказана экспериментально. Так, она послужила основой для создания автономно биолюминесцирующих дрожжей, клеток млекопитающих и растений [5, 8].

Ключевым ферментом для процесса биолюминесценции грибов является люцифераза, которая катализирует окисление люциферина грибов (3-гидроксигиспидина) кислородом. Процесс сопровождается выделением кванта света. Люцифераза гриба Neonothopanus nambi (nnLuz) относится к новому семейству белков, представители которого также были найдены в геномах других видов светящихся грибов. Изучение строения и свойств nnLuz позволит усовершенствовать инструментарий на основе биолюминесцентной системы грибов и расширить область ее применения в биомедицинских исследованиях.

Биоинформатические ресурсы, использующие различные базы данных, могут предсказать пространственную организацию люциферазы грибов, однако отсутствие охарактеризованных гомологов nnLuz снижает достоверность таких предсказаний. Исследования структуры люциферазы гриба N. nambi при помощи программного обеспечения TMHMM-server и I-TASSER предсказывают наличие 6 α-спиралей и 6 β-слоев в изучаемом белке (рис. 1).

Рис. 1.

Предсказание пространственной структуры люциферазы N. nambi (I-TASSER).

Кроме того, согласно полученным данным, протяженный α-спиральный участок на N-конце изучаемого белка длиной в 40 аминокислотных остатков предположительно является трансмембранным. Биоинформатические предсказания пространственной структуры белков нуждаются в экспериментальной проверке, однако определение структуры белков, связанных с мембраной методами кристаллографии и ЯМР-спектроскопии, является сложной задачей. Получение функционального фрагмента люциферазы N. nambi, лишенного предсказанного трансмембранного домена, позволило бы упростить структурный анализ. Для решения этой задачи мутантные формы nnLuz, не содержащие первых 6, 9, 12, 15, 21, 25, 28, 31, 34, 37 и 40 N-концевых аминокислотных остатков, получали методом ПЦР для последующего клонирования в вектор pET-23b, который затем использовали для трансформации клеток E. coli штамма BL21-CodonPlus.

Биолюминесцентный анализ лизатов клеток бактерий, несущих указанные мутантные гены, показал, что функциональность люциферазы грибов сохраняется при отсутствии части N-концевых аминокислотных остатков, вплоть до 37. Пример такого анализа можно видеть на рис. 2.

Рис. 2.

Анализ биолюминесценции лизатов клеток бактерий, несущих гены мутантных форм nnLuz, не содержащих первых 25, 28, 31, 34, 37 и 40 N-концевых аминокислотных остатков. В качестве отрицательного контроля был использован лизат не трансформированных клеток E. coli штамма BL21-CodonPlus.

Биолюминесцентный анализ мутантных форм люциферазы N. nambi, полученных методом случайного мутагенеза, показал, что замены аминокислот V49R, D127N, R136Q, S144T/R, D173N, R176Q/P, E237K/Q, E238K/R приводят к нарушению функционирования фермента и, вероятно, играют ключевую роль в процессе катализа. Данные мутанты были получены в условиях повышенного содержания ионов марганца (640 мкМ) и неравных концентраций нуклеотид-3-фосфатов (dATP – 200 мкМ, dGTP – 400 мкМ, dTTP – 1 мМ, dCTP – 1 мМ). Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей описанных люцифераз высших грибов с помощью ресурса Uniprot демонстрирует наличие консервативных участков, общих для всех белков данного семейства (рис. 3), при этом данные консервативные участки включают в себя некоторые указанные выше положения (R136, D173, R176, E237, E238). Согласно описанному ранее механизму биолюминесцентной реакции грибов [9], субстрат сначала депротонируется в процессе основного катализа и только потом вступает в реакцию с кислородом.

Рис. 3.

Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей люцифераз грибов Armillaria gallica, A. mellea, A. ostroyae, Micena chlorophos, M. citricolor, Neonothopanus nambi, N. gardneri, Omphalotus olearius, Panellus stipticus. Положения вносимых мутаций выделены красными рамками.

Как правило, в процессе такого катализа ключевую роль играют заряженные аминокислотные остатки лизина, гистидина, аспартата или глутамата, поэтому нельзя исключить, что аминокислотные остатки в положениях R136, D173, R176, E237, E238 входят в состав активного центра люциферазы. Для оценки роли конкретных аминокислотных остатков для структуры и функционирования nnLuz было решено использовать методику аланинового скрининга, подразумевающую замену аминокислотных остатков в определенных положениях на аланин.

Для получения мутантных форм nnLuz в генетическую последовательность люциферазы дикого типа (nnLuz WT) вносили изменения с помощью ПЦР по методу Quick change [10]. Указанные генетические последовательности входили в состав векторов, содержащих также промотор глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (pGAP), терминатор алкогольоксидазы (AOXt) и предназначенных для трансформации клеток дрожжей Pichia pastoris. Культивацию и трансформацию дрожжей проводили по стандартной методике [11]. Съемку дрожжевых колоний осуществляли по методу Drop-test [12] на приборе Fusion-Pulse.7 (Vilber Lourmat). Сравнение функциональной активности модифицированной nnLuz, аминокислотные остатки V49, D127, R136, S144, D173, R176, E237, E238 которой были заменены на аланин, показало отсутствие люминесцентной активности всех экспериментальных линий, за исключением мутанта V49A, в случае которого было детектировано увеличение сигнала в 1.7 раза (рис. 4).

Рис. 4.

Сравнение мутантов nnLuz в дрожжевой культуре Pichia pastoris. (а) Свечение дрожжевых колоний, экспрессирующих мутантные и нативную формы nnLuz в ответ на добавление люциферина (верхнее фото), эти колонии в видимом свете (нижнее фото); (б) Нормированная люминесценция nnLuz дикого типа (nnLuz WT) и мутантной формы nnLuz V49A в ответ на добавление люциферина. Полученный сигнал был нормирован на значения сигнала nnLuz WT.

Таким образом, в результате данной работы установлены положения некоторых ключевых аминокислотных остатков, непосредственно влияющих на функционирование люциферазы гриба N. nambi. Также было показано, что отсутствие вплоть до тридцати семи N-концевых аминокислотных остатков, формирующих гипотетический трансмембранный участок, практически не влияет на активность изучаемого фермента. Полученные результаты могут быть в дальнейшем использованы для получения образца nnLuz, пригодного для исследования методами кристаллографии и ЯМР-спектроскопии, с целью экспериментального установления пространственной структуры люциферазы гриба N. nambi.