1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Доклады Российской академии наук. Науки о жизни
  4. T. 496, № 1, 2021

Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 496, № 1, стр. 70-74

МЕЖХРОМОСОМНЫЕ КОНТАКТЫ ГЕНОВ рРНК В ТРЕХ ЛИНИЯХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА СВЯЗАНЫ С САЙЛЕНСИНГОМ ГЕНОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ МОРФОГЕНЕЗ

Н. А. Чуриков 1, *, Е. С. Клушевская 1, Ю. В. Кравацкий 1, Г. И. Кравацкая 1, Д. М. Федосеева 1

1 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук
Москва, Россия

* E-mail: tchurikov@eimb.ru

Поступила в редакцию 05.10.2020
После доработки 09.10.2020
Принята к публикации 10.10.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Для изучения влияния теплового шока на образование контактов генов рРНК с генами DUX в хромосоме 4 человека использовали метод 4С. Наши данные свидетельствуют о том, что эти контакты пропадают после теплового шока. Ранее было показано, что кластеры генов рРНК наиболее часто контактируют с областями супер-энхансеров, имеющих протяженные метки H3K27ac. Недавно было обнаружено, что супер-энхансеры вовлечены в образование разделения фаз в ядре. Вместе взятые эти данные свидетельствуют о том, что обратимые контакты кластеров генов рРНК вовлечены в механизмы регуляции с помощью разделения фаз в ядре.

Ключевые слова: гены рРНК, межхромосомные контакты, 4С, сайленсинг генов, морфогенез, эпигенетика

Укладка хромосом в ядре важна как для компактизации ДНК, так и для регуляции экспрессии генов. Появление новых молекулярных методов для полногеномного анализа трехмерных структур хромосом позволяет выявлять не только сближенные внутрихромосомные области, которые, прежде всего, связаны с компактной укладкой хромосом, но и более редкие межхросомосные контакты, которые вовлечены в эпигенетическую регуляцию экспрессии генов [1–4]. Ядрышки являются самыми крупными органеллами в ядрах. Они не отделены от хромосом мембранами и потенциально могут влиять на экспрессию генов в областях разных хромосом, контактирующих с ядрышками. Имеется пять кластеров генов рРНК, которые формируют ядрышки. Они расположены на коротких плечах пяти акроцентрических хромосом 13, 14, 15, 21 и 22 человека. Давно было обнаружено, что в политенных хромосомах дрозофилы ядрышки образуют устойчивые контакты с определенными областями в разных хромосомах [5]. Это позволяет предполагать как постоянство трехмерной организации хромосом, так и влияние ядрышек на конкретные области в разных хромосомах. С помощью метода 4С (circular chromosome conformation capture) было обнаружено, что ядрышки в клетках человека образуют наиболее частые контакты с областями хромосом, имеющими протяженные области (15–50 kb) меток активного хроматина H3K27ac, которые характерны для супер-энхансеров [6, 7]. Известно, что в раннем развитии гетерохроматизация генов рРНК, которые и формируют ядрышки, сопровождается репрессией или активацией разных генов мыши [8]. Недавно было обнаружено, что ядрышки в клетках человека линии HEK293T, происходящей из почки эмбриона, образуют частые контакты с генами, вовлеченными в дифференцировку и канцерогенез [9]. Поэтому было интересно выяснить, с какими генами ядрышки контактируют в клетках, имеющих разное происхождение.

В настоящей работе мы выявили гены, которые наиболее часто контактируют с ядрышками в двух новых линиях клеток человека – K562, которая происходит из клеток миелоидной лейкемии, и hESM01, содержащей эмбриональные стволовые клетки [10]. В результате нами впервые обнаружено, что в клетках человека, имеющих разное происхождение, ядрышки образуют наиболее устойчивые контакты с определенной группой генов. Она включает несколько сотен генов, контролирующих развитие. Среди них имеется более сотни генов, которые в ходе дифференцировки подвергаются концертному сайленсингу, приобретая метку репрессированного хроматина H3K27me3. Эти результаты позволяют предполагать, что при дифференцировке экспрессия этой группы генов в разных типах клеток выключается с помощью контактов с неактивными кластерами генов рРНК.

Контакты генов рРНК в клетках K562 и hESM01 выявляли с помощью метода 4С, как описано ранее [6, 9]. Препараты ДНК после процедуры 4C использовали для амплификации с помощью рРНК-специфических праймеров 5' TCTTTGAAAAAAATCCCAGAAGTGGT 3' и 5' AAGTCCAGAAATCAACTCGCCAGT 3'. Библиотеки для глубокого секвенирования получали, используя наборы реактивов Illumina. Чтение библиотек длиной по 150 нуклеотидов проводили на приборе Illumina HiSeq 1500. Полученные чтения (по две биологических реплики, каждая по 10 млн. чтений) картировали на геном человека версии hg19 с помощью пакета программ BWA. Данные реплик хорошо коррелировали – Pearson = 0.99. Результаты глубокого секвенирования 4C-рРНК помещены в базу данных GEO (accession number GSE49193).

Частоту контактов ядрышек с разными районами хромосом оценивали по числу картированных чтений 4С. В результате были получены списки генов, наиболее часто контактирующих с ядрышками. На рис. 1 представлена диаграмма Венна, показывающая перекрывание между генами, которые наиболее часто контактируют с ядрышками в трех линиях клеток. Видно, что 523 гена во всех трех линиях – общие. Анализ этих генов в базах Gene Ontology (GO) выявил, что они высоко ассоциированы с контактами между клетками, развитием и морфогенезом. Вместе с тем видно, что имеются значительные различия в местах контактов ядрышек в клетках разного происхождения. Так, в линии hESM01 имеется 2611 генов (около 53%), которые имеют контакты с ядрышками только в этой линии клеток. Этот результат свидетельствует о том, что около половины контактов ядрышек являются специфичными для данного типа клеток. Таким образом, имеются общие и специфические для каждого вида клеток контакты ядрышек с генами. Этот факт подтверждает наше предположение, согласно которому ядрышки участвуют в эпигенетической регуляции больших групп генов [9].

Рис. 1.

Анализ генов, контактирующих с ядрышками. (а) Диаграмма Венна, иллюстрирующая перекрывание между генами, контактирующими с ядрышками в трех линиях клеток человека. Для анализа были взяты гены, обнаруживающие 100 и более контактов с ядрышками (100 или более чтений 4С). (б) Анализ 523 генов, общих для трех линий клеток, в базе данных GO (https://go.princeton.edu/cgi-bin/GOTermFinder). Показаны пять наиболее частых ассоциаций этих генов с биологическими процессами. Числа у черных прямоугольников указывают число генов, ассоциированных с конкретным процессом.

Для дальнейшего анализа генов, общих для трех линий клеток, мы использовали ресурс Enrichr (http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/). В результате были получены новые интересные данные об этих 523 генах, регулирующих развитие. Например, в базе ENCODE Histone Modifications 2015 этого ресурса найдена высокая ассоциация (padj < 3.5 · 10–14) 90–140 генов с сайленсингом с помощью гистоновой метки H3K27me3. Концертный сайленсинг этих генов обнаружен в разных типах клеток: в клетках эпителия бронхов и почек, в моноцитах, в клетках эндотелия, кератиноцитах, миобластах и в ряде других. Эти данные свидетельствуют о том, что в процессе дифференцировки разных типов клеток человека большие группы генов, контактирующих с ядрышками, подвергаются сайленсингу с помощью метки H3K27me3. В табл. 1 приведены ассоциации с биологическими процессами 119 генов, контактирующих с генами рРНК, которые подвергаются сайленсингу с помощью метки H3K27me3 в клетках бронхиального эпителия. Результаты получены с помощью ресурса https://go.princeton.edu/cgi-bin/GOTermFinder. Видно, что репрессируются гены, которые необходимы для дифференцировки нейронов. Видимо, экспрессия этой группы генов не нужна, например, для дифференцировки бронхиального эпителия. Эти данные также свидетельствуют в пользу роли ядрышек в процессах эпигенетической регуляции экспрессии больших групп генов. В разных типах клеток эта группа генов, контролирующих развитие, подвергается концертному сайленсингу. Таким образом, в процессе дифференцировки может происходить выключение экспрессии одной и той же группы генов в разных типах клеток.

Таблица 1.

Ассоциации 119 генов, контактирующих с генами рРНК и подвергающимися сайленсингу с помощью метки H3K27me3 в клетках бронхиального эпителия

Термин онтологии генов Частота кластера генов Частота ге-нов в геноме Padj Фальшивые позитивы Гены, аннотированные с термином
nervous system development 48 of 119 ge-nes, 40.3% 2425 of 19751 genes, 12.3% 1.03e-11 0.00 EPHA5, ASTN2, UNC5C, DSCAML1, ZNF804A, HAPLN1, PLCB1, CSMD3, FGF14, PTPRD, AUTS2, COL25A1, GPC6, SH3GL2, RELN, NRG3, PRKG1, SDK1, APBA1, ATP8A2, DCC, UNC5D, LRP2, PCDHAC1, PLXNA4, KIRREL3, CTNND2, ALK, HDAC9, CA10, ROBO1, GABRA5, SEZ6L, HECW1, CNTN4, ROBO2, CNTN5, TRPC4, EPHB1, NRG1, SCN8A, SATB2, EPHA6, DAB1, NTM, SEMA6D, CLSTN2, SYNDIG1
modulation of chemical synaptic transmission 21 of 119 ge-nes, 17.6% 452 of 19751 genes, 2.3% 3.84e-10 0.00 CACNA1D, STXBP5L, DGKI, CNTN4, PLCB1, SYN3, FGF14, GRM7, PLCL1, GRM1, RELN, NRG3, EPHB1, DLGAP1, APBA1, SORCS3, DCC, CACNB2, SLC24A2, GRID1, CLSTN2
regulation of trans-synaptic signaling 21 of 119 ge-nes, 17.6% 453 of 19751 genes, 2.3% 4.01e-10 0.00 CACNA1D, STXBP5L, DGKI, CNTN4, PLCB1, SYN3, FGF14, GRM7, PLCL1, GRM1, RELN, NRG3, EPHB1, DLGAP1, APBA1, SORCS3, DCC, CACNB2, SLC24A2, GRID1, CLSTN2
generation of neurons 35 of 119 ge-nes, 29.4% 1552 of 19751 genes, 7.9% 4.23e-09 0.00 EPHA5, ASTN2, UNC5C, DSCAML1, ZNF804A, CSMD3, PTPRD, AUTS2, COL25A1, SH3GL2, RELN, NRG3, PRKG1, SDK1, ATP8A2, DCC, UNC5D, LRP2, KIRREL3, PLXNA4, CTNND2, ALK, HDAC9, ROBO1, GABRA5, HECW1, CNTN4, ROBO2, EPHB1, NRG1, SATB2, EPHA6, DAB1, NTM, SEMA6D
neuron development 30 of 119 ge-nes, 25.2% 1134 of 19751 genes, 5.7% 4.31e-09 0.00 ALK, EPHA5, UNC5C, ROBO1, GABRA5, DSCAML1, CNTN4, HECW1, ZNF804A, CSMD3, PTPRD, AUTS2, ROBO2, COL25A1, SH3GL2, RELN, PRKG1, EPHB1, SDK1, ATP8A2, DCC, UNC5D, LRP2, EPHA6, DAB1, SEMA6D, KIRREL3, NTM, PLXNA4, CTNND2
neurogenesis 36 of 119 ge-nes, 30.3% 1654 of 19751 genes, 8.4% 5.30e-09 0.00 EPHA5, ASTN2, UNC5C, DSCAML1, ZNF804A, CSMD3, PTPRD, AUTS2, COL25A1, SH3GL2, RELN, NRG3, PRKG1, SDK1, ATP8A2, DCC, UNC5D, LRP2, KIRREL3, PLXNA4, CTNND2, ALK, HDAC9, ROBO1, GABRA5, HECW1, CNTN4, ROBO2, TRPC4, EPHB1, NRG1, SATB2, EPHA6, DAB1, NTM, SEMA6D
neuron differentiation 33 of 119 ge-nes, 27.7% 1394 of 19751 genes, 7.1% 5.70e-09 0.00 EPHA5, UNC5C, DSCAML1, ZNF804A, CSMD3, PTPRD, AUTS2, COL25A1, SH3GL2, RELN, PRKG1, SDK1, ATP8A2, DCC, UNC5D, LRP2, KIRREL3, PLXNA4, CTNND2, ALK, HDAC9, ROBO1, HECW1, CNTN4, GABRA5, ROBO2, EPHB1, NRG1, SATB2, EPHA6, DAB1, NTM, SEMA6D
neuron projection development 28 of 119 ge-nes, 23.5% 1002 of 19751 genes, 5.1% 7.26e-09 0.00 ALK, EPHA5, UNC5C, ROBO1, DSCAML1, CNTN4, HECW1, ZNF804A, CSMD3, PTPRD, AUTS2, ROBO2, COL25A1, SH3GL2, RELN, PRKG1, EPHB1, SDK1, ATP8A2, DCC, UNC5D, LRP2, EPHA6, DAB1, SEMA6D, KIRREL3, PLXNA4, CTNND2
neuron projection morphogenesis 23 of 119 ge-nes, 19.3% 666 of 19751 genes, 3.4% 1.15e-08 0.00 EPHA5, UNC5C, ROBO1, DSCAML1, CNTN4, HECW1, PTPRD, AUTS2, ROBO2, COL25A1, SH3GL2, RELN, EPHB1, ATP8A2, DCC, UNC5D, LRP2, EPHA6, DAB1, SEMA6D, KIRREL3, PLXNA4, CTNND2
synaptic signaling 24 of 119 ge-nes, 20.2% 738 of 19751 genes, 3.7% 1.35e-08 0.00 CACNA1D, STXBP5L, DGKI, GABRA5, CNTN4, PLCB1, SYN3, PTPRD, FGF14, GRM7, PLCL1, GRM1, RELN, NRG3, EPHB1, DLGAP1, NRG1, APBA1, SORCS3, DCC, CACNB2, SLC24A2, GRID1, CLSTN2

Триметильная метка H3K27me3 в гистоне H3 вносится белковым комплексом PRC2 (Polycomb repressive complex) в нуклеосомах целевых генов для их репрессии и обеспечения клеточной идентичности [13]. Ранее мы обнаружили, что места контактов ядрышек часто содержат метку активного хроматина – H3K27ac, которая содержит ацетилированный тот же 27-й лизин гистона H3 [9]. Следовательно, ядрышки могут контактировать с генами, вызывая либо их активацию, либо сайленсинг. Известно, что эти контакты динамичны и могут изменяться при физиологических воздействиях, что свидетельствует в пользу регуляторной роли ядрышек [12, 14].

Пока неясно, как гены рРНК, контактируя с разными генами, могут вызывать активацию или репрессию соответствующих генов. Имеющиеся данные позволяют предполагать, что это происходит с помощью механизма разделения жидких фаз в ядре (liquid-liquid phase separation) [12]. Такое разделение фаз и образование транскрипционных микрокапель (transcriptional condensates) может происходить с участием ядрышек, которые являются самыми большими органеллами в ядре. Тот факт, что супер-энхансеры вовлечены в механизмы образования разделения фаз в ядре [15], и что гены рРНК часто контактируют с областями супер-энхансеров, имеющих протяженные метки H3K27ac [6, 9, 12], дает основание считать, что ядрышки, являясь крупными органеллами, регулируют большие группы генов с помощью механизма разделения фаз. Известно, что активные кластеры генов рРНК находятся во внутренней области ядрышка, в фибриллярных центрах. Тем не менее образование фаз может приводить к образованию компартментов, содержащих активаторы транскрипции или репрессоры транскрипции [15, 16]. Мы предполагаем, что активные кластеры генов рРНК образуют транскрипционно активные микрокапли, а репрессированные кластеры – неактивные конденсаты. Разные области хромосом попадают в эти микрокапли, что обеспечивает активацию или репрессию больших групп генов при дифференцировке. При этом соответствующие гены сближаются с ядрышками. В настоящее время мы изучаем колокализацию разных генов с ядрышками с помощью FISH.

Список литературы

  1. Dekker J., Rippe K., Dekker M. Capturing chromosome conformation. // Science. 2002. V. 95 P. 1306–1311. https://doi.org/10.1126/science.1067799

  2. Sidorenko D.S., Sidorenko I.A., Zykova T.Y., Goncharov F.P., Larsson J., Zhimulev I.F. Molecular and genetic organization of bands and interbands in the dot chromosome of Drosophila melanogaster. // Chromosoma. 2019. V. 128, P. 97–117. https://doi.org/10.1007/s00412-019-00703-x

  3. Ghavi-Helm Y., Jankowski A., Meiers S., Viales R.R., Korbel J.O., Furlong E.E.M. // Highly rearranged chromosomes reveal uncoupling between genome topology and gene expression. Nat Genet. 2019. V. 51 (8), P. 1272–1282. https://doi.org/10.1038/s41588-019-0462-3

  4. Sarnataro S., Chiariello A.M., Esposito A., Prisco A., Nicodemi M. Structure of the human chromosome interaction network. // PLoS One. 2017. V. 12 (11): e0188201. doi: . eCollection 2017.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0188201

  5. Ananiev E.V., Barsky V.E., Ilyin Y.V., Churiko, N.A. Localization of nucleoli in Drosophila melanogaster polytene chromosomes. // Chromosoma. 1981. V. 81. P. 619–628. PMID:6790245

  6. Tchurikov N.A., Fedoseeva D.M., Sosin D.V., Snezhkina A.V., Melnikova N.V., Kudryavtseva A.V., Kravat-sky Y.V., Kretova O.V. Hot spots of DNA double-strand breaks and genomic contacts of human rDNA units are involved in epigenetic regulation. // J. Mol. Cell. Biol. 2015. V. 7. P. 366–382. https://doi.org/10.1093/jmcb/mju038

  7. Hnisz D., Abraham B.J., Lee T.I., Lau A., Saint-André V., Sigova A.A., Hoke H.A., Young R.A. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. // Cell. 2013. V. 155. P. 934–947. Epub 2013 Oct 10.https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.09.053

  8. Savić N., Bär D., Leone, S., Fromme S.C., Weber F.A., Vollenweider E., Ferrari E., Ziegler U., Kaech A., Sha-khova O., Cinelli P., Santoro R. lncRNA maturation to initiate heterochromatin formation in the nucleolus is required for exit from pluripotency in ESCs. Cell Stem // Cell. 2014. V. 15. P. 720–734. https://doi.org/10.1016/j.stem.2014.10.005

  9. Tchurikov N.A., Fedoseeva D.M., Klushevskaya E.S., Slovohotov I.Y., Chechetkin V.R., Kravatsky Y.V., Kretova O.V. rDNA Clusters Make Contact with Genes that Are Involved in Differentiation and Cancer and Change Contacts after Heat Shock Treatment. // Cells. 2019 Nov 5; 8 (11): 1393. https://doi.org/10.3390/cells8111393

  10. Lagarkova M.A., Shutova M.V., Bogomazova A.N., Vassina E.M., Glazov E.A., Zhang P., Rizvanov A.A., Chestkov I.V., Kiselev S.L. Induction of pluripotency in human endothelial cells resets epigenetic profile on genome scale. // Cell Cycle 9: 937–946 (2010).

  11. Кретова О.В., Федосеева Д.М., Кравацкий Ю.В., Алембеков И.Р., Словохотов И.Ю., Чуриков Н.А. Гомеотические гены DUX4, контролирующие развитие эмбриона человека на стадии двух бластомеров, окружены областями, которые образуют контакты с кластерами генов рРНК. // Молекулярная биология. 2019. Т. 53, С. 268–273 Kretova O.V., Fedoseeva D.M., Kravatsky Y.V., Alembekov I.R., Slovohotov I.Y., Tchurikov N.A. Homeotic DUX4 Genes that Control Human Embryonic Development at the Two-Cell Stage Are Surrounded by Regions Contacting with rDNA Gene Clusters. // Mol Biol (Mosk). 2019 Mar–Apr; 53 (2): 268–273. https://doi.org/10.1134/S0026898419020083.

  12. Чуриков Н.А., Клушевская Е.С., Кравацкий Ю.В., Кравацкая Г.И., Федосеева Д.М., Кретова О.В. Межхромосомные контакты генов рРНК с генами DUX в хромосоме 4 человека чувствительны к тепловоме шоку. // ДАН. Науки о жизни, 2020. Т. 490. С. 62–66. Tchurikov N.A., Klushevskaya E.S., Kravatsky Y.V., Kravatskaya G.I., Fedoseeva D.M., Kretova O.V. Interchromosomal Contacts of rDNA Clusters with DUX Genes in Human Chromosome 4 Are Very Sensitive to Heat Shock Treatment. // Dokl Biochem Biophys. 2020 Jan; 490 (1): 50–53. https://doi.org/10.1134/S1607672920010032

  13. Lavarone E., Barbieri C.M., Pasini D. Dissecting the role of H3K27 acetylation and methylation in PRC2 mediated control of cellular identity. // Nat Commun V. 10. P. 1679 (2019). https://doi.org/10.1038/s41467-019-09624-w

  14. Кретова О.В., Федосеева Д.М., Кравацкий Ю.В., Клушевская Е.С., Алембеков И.Р., Словохотов И.Ю., Чуриков Н.А. Область контактов кластеров генов рРНК с геном FANK1 соответствует неактивному хроматину. // Молекулярная биология. 2020. Т. 54. С. 262–266. Kretova O.V., Fedoseeva D.M., Kravatsky Y.V., Klushevskaya E.S., Alembekov I.R., Slovohotov I.Y., Tchurikov N.A. Contact Sites of rDNA Clusters with FANK1 Gene Correspond to Repressed Chromatin. // Mol Biol (Mosk). 2020 Mar-Apr;54(2):262-266. https://doi.org/10.31857/S002689842002007X

  15. Shrinivas K., Sabari B.R., Coffey E.L., Klein I.A., Boija A., Zamudio A.V., Schuijers J., Hannett N.M., Sharp P.A., Young R.A., Chakraborty A.K. Enhancer Features that Drive Formation of Transcriptional Condensates. // Mol Cell. 2019. V. 75. P. 549–561.e7. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2019.07.009

  16. You K., Huang Q., Yu C., Shen B., Sevilla C., Shi M., Hermjakob H., Chen Y., Li T. PhaSepDB: a database of liquid-liquid phase separation related proteins. // Nucleic Acids Res. 2020 V. 48 (D1): D354–D359. https://doi.org/10.1093/nar/gkz847

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Доклады Российской академии наук. Науки о жизни

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал