Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 498, № 1, стр. 221-226

В настоящее время в мире протонная терапия (ПТ) успешно используется для лечения наиболее распространенных и сложных видов рака, особенно опухолей головного мозга и в педиатрии [1, 2]. Для дальнейшего развития ПТ разрабатываются методы и подходы усиления действия протонного излучения с помощью FLASH-терапии [3] наноэнхансеров [4], использования схем гипофракционирования [5, 6] и сочетанного действия с другими видами излучений, обладающими синергетическими или аддитивными свойствами [7]. Наиболее современной в ПТ является технология тонкого сканирующего пучка протонов (ТСПП), которая позволяет с большой точностью облучать опухоли и значительно снижать нагрузку на окружающие здоровые ткани. В последние годы сформировалось представление о сложном клеточном строении злокачественных образований и присутствия в них опухолевых стволовых клеток (ОСК), обладающих способностью формировать опухоль и поддерживать ее рост. Многие факты указывают на то, что именно ОСК отвечают за радиорезистентность агрессивных опухолей и возникновение рецидивов после радиотерапии [8]. Излучения с высокими значениями линейной потери энергии, к которым относятся протоны, ионы углерода и нейтроны, способны преодолеть радиорезистентность ОСК за счет индукции в них нерепарируемых повреждений ДНК [9], что делает лечение злокачественных новообразований эффективным не только за счет подавления роста первичной опухоли, но и снижения частоты рецидивирования. В работах [10, 11] выявлена высокая эффективность нейтронов при лечении радиорезистентных и распространенных видов опухолей. В работе [12] по клоногенной активности клеток меланомы В-16 показано, что предварительное облучение нейтронами может усиливать действие фотонного излучения аддитивно или синергетически, а эффект зависит от соотношения доли нейтронов в суммарной дозе облучения.

Ранее нами было высказано предположение, что появление рецидивных опухолей асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) у мышей после гипофракционированного облучения ТСПП в дозах 30 + 30 Гр и 40 + 40 Гр происходит за счет сохранения единичных, наиболее радиоустойчивых ОСК [13]. Поскольку существует достаточно экспериментальных доказательств о роли ОСК в развитии отсроченных вторичных опухолей как на месте первичной, так и в другой локализации [14], то для повышения эффективности ПТ необходимо усиление воздействия на ОСК и снижение частоты рецидивирования.

Целью настоящей работы было исследование сочетанного действия двукратного облучения тонким сканирующим пучком протонов (ТСПП) в суммарной дозе 80 Гр и нейтронного излучения в дозе 5 Гр на рост солидной формы АКЭ и его отдаленные последствия (продолжительность ремиссии, частота рецидивов, лучевые реакции кожи, средняя продолжительность жизни (СПЖ)) у мышей-опухоленосителей.

Эксперименты проводили на 8–9-недельных самцах мышей колонии SHK с массой тела 24–28 г, которых содержали в стандартных условиях вивария [15]. Для индукции солидной АКЭ мышам внутримышечно вводили 2 × 10⁶ клеток в бедро левой задней лапы. Мыши с перевитыми опухолями были разделены на 4 группы по 15 животных: 1 – ТСПП двумя фракциями по 40 Гр через 24 ч; 2 – 5 Гр нейтронов + через 3 ч ТСПП двумя фракциями по 40 Гр через 24 ч; 3 – ТСПП двумя фракциями по 40 Гр через 24 ч + 5 Гр нейтронов через 3 ч после второй фракции протонов; 4 – контрольная, необлученные мыши с опухолями, подвергшиеся транспортировке к источникам излучений, анестезии и имитации условий облучения. Доза облучения нейтронами 5 Гр была выбрана с учетом величины относительной биологической эффективности (ОБЭ) непрерывных нейтронов на мышах и расчета доли нейтронов в суммарной дозе облучения около 15% для получения синергетического или аддитивного эффектов.

Локальное  облучение  мышей  проводили  на 5-й день после инокуляции АКЭ, когда опухолевый узел пальпировался у всех животных. Перед облучением мышей анестезировали ксилазин/золетилом. В качестве источника ТСПП использовали протонный синхротрон (Комплекс ПТ “Прометеус”, ФТЦ ФИАН, Протвино). Мышей индивидуально фиксировали на наклонной платформе в водном фантоме. Для установления объема облучения проводили конусно-лучевую компьютерную томографию мышей на встроенном в комплекс томографе и определяли объем опухоли у каждой мыши в специально разработанной трехмерной планирующей системе. Средний объем опухоли составил 0.45 ± 0.025 см³. Расчет дозы в заданном объеме проводили в программе планирования облучения, основанной на методе Монте-Карло с итеративной динамической оптимизацией по соотношению min/max дозы. Облучение опухоли проводили импульсно (длительность импульса 200 мс, 1 импульс в 2 с) с двух противоположных направлений, энергия протонов на выходе 96–104 МэВ, сигма пучка на входе в фантом 2.8–3.6 мм. Погрешность поглощенной дозы протонов составляла около 5%.

Источником нейтронов служил портативный нейтронный генератор непрерывного действия НГ-14 (МРНЦ им. А.Ф. Цыба – филиал ФГБУ “НМИРЦ” Минздрава России, Обнинск) с энергией нейтронов 14.1 МэВ. Для локального облучения мышей фиксировали на платформе таким образом, чтобы область опухоли находилась в поле облучения нейтронами. Погрешность определения поглощенной дозы составляла 12–15%.

После облучения у животных регистрировали динамику роста АКЭ, лучевые реакции кожи, длительность ремиссии, частоту рецидивов АКЭ, СПЖ мышей-опухоленосителей. Динамику роста АКЭ определяли по объему опухоли дважды в неделю в течение месяца. Лучевые реакции кожи наблюдали согласно клинико-морфологической классификации Радиотерапевтической онкологической группы и Европейской организации по исследованию и лечению рака RTOG/EORTC-95 [16]. Статистическую оценку различий между группами, имеющими нормальное распределение, проводили с помощью t-критерия Стьюдента; в остальных случаях использовался непараметрический U-критерий Манна–Уитни. Для сравнения результатов эксперимента, где показатели выражались в долях, достоверность различий оценивали по критерию углового преобразования Фишера.

На рис. 1 показаны кривые роста АКЭ у мышей после облучения. При всех вариантах лучевого воздействия наблюдалось полное подавление роста первичной опухоли у мышей в течение месяца.

Рис. 1.

Динамика роста АКЭ у мышей после облучения пучком протонов 40 + 40 Гр и их сочетанного воздействия с нейтронами в дозе 5 Гр. Данные представлены как среднее значение ± SD. p ≤ 0.01 по сравнению с контролем.

Ранее нами была показана высокая эффективность подавления роста опухолей у мышей при гипофракционированном облучении ТСПП в дозах 60 и 80 Гр [6]. И по критерию подавления роста АКЭ мы не могли ожидать модификации эффекта при комбинированном воздействии с нейтронами. Используемая нами модель тестирования новых схем радиотерапии позволяла на фоне подавления первичной опухоли в этом же временном периоде оценить кожные лучевые реакции, частота и тяжесть проявления которых влияют на общее состояние мышей-опухоленосителей в период ремиссии и могут участвовать в развитии более отдаленных последствий (время появления рецидива, частоту рецидивов, продолжительность жизни).

У мышей оценивали тяжесть и течение лучевых поражений кожи в области облучения. Время латентного периода развития повреждений для всех групп было 10–12 сут. Во 2-й группе кожные реакции на 13-е сутки наблюдались у 100% мышей, в 1-й группе – у 70.8%, а в 3-й только у 43% мышей. Период проявления выраженных лучевых поражений кожи составлял 5–7 сут для всех групп, однако тяжесть кожных реакций была различна: во 2-й группе самая тяжелая 4-я степень поражений, характеризуемая появлением язв и некрозов, наблюдалась у 87.5%, в 1-й группе – у 46%, а в 3-й только у 14% мышей. Кроме того, в 3-й группе, где наблюдали самую низкую частоту общего количества кожных реакций, у 29% мышей лучевые поражения не развивались более 1-й степени (умеренная эритема, эпиляция, сухой эпидермит). Различия по частоте встречаемости и тяжести протекания лучевых поражений между группами были статистически значимы (p < 0.05). В 3-й группе наблюдалась самая благополучная картина лучевых последствий: низкая доля мышей с поражениями кожи, большая часть которых была небольшой степени выраженности. По нескольким критериям повреждений кожи показано, что предварительное облучение нейтронами в дозе 5 Гр перед гипофракционированным ТСПП значительно усиливает эту категорию побочных последствий, что приводит к дополнительной интоксикации мышей, связанной с острым и хроническим воспалением, и может влиять на более отдаленные последствия.

Средняя продолжительность безрецидивного периода в 1-й группе составила 85 сут, а в группах с сочетанным воздействием срок ремиссии был ниже и составлял 43 и 60 сут. СПЖ мышей без рецидивов в группах с сочетанным воздействием была меньше (118 и 124 сут) по сравнению с группой мышей, облученных только протонами (278 сут). Первые рецидивные опухоли у мышей во всех группах появлялись примерно через 35–45 сут после облучения, однако динамика гибели мышей с рецидивами в группах сочетанного воздействия резко отличалась: мыши гибли в течение следующих 2–3 мес по сравнению с группой, облученной только ТСПП, в которой этот период составил 10 мес (рис. 2).

Рис. 2.

Динамика гибели мышей с рецидивами после облучения протонами 40 + 40 Гр и их сочетанного воздействия с нейтронами в дозе 5 Гр.

На рис. 3 представлены кривые выживаемости мышей без рецидивов, выявлено, что в группах после сочетанного воздействия животные гибли значительно быстрее, чем при облучении только протонами, и максимальная продолжительность жизни во 2-й группе составила 7 мес, в 3-й группе – 11 мес, а в 1-й – 21 мес.

Рис. 3.

Динамика гибели мышей без рецидивов после облучения протонами 40 + 40 Гр и их сочетанного воздействия с нейтронами в дозе 5 Гр.

Таким образом, по критериям длительности ремиссии, частоты рецидивов и продолжительности жизни мышей-опухоленосителей показано, что дополнительное воздействие нейтронов как до, так и после гипофракционированного облучения ТСПП значительно ухудшает эти показатели эффективности терапии. Известно, что облучение опухолей такими частицами с высокой ЛПЭ, как нейтроны и ионы углерода, вызывает значительные радиационные повреждения в клетках, окружающих опухоль [17]. Ранее нами было показано при гипофракционированном облучении ТСПП разных объемов АКЭ, что облучение точного пальпируемого размера опухоли приводит к меньшей частоте рецидивирования у мышей по сравнению с объемом опухоли, который также рекомендован в клинической практике, но захватывает окружающие ткани с учетом сложных размеров опухоли, ее локализации или дыхания пациента [13]. В нашей работе, при облучении нейтронами в дозе 5 Гр был облучен большой объем здоровой ткани, находящийся за опухолью, что могло негативно сказаться на частоте рецидивирования опухоли и выживаемости мышей. Локальное облучение нейтронами опухоли в области бедренной кости мыши, в костном мозге которой находится в 7–8 раз больше миелокариоцитов, чем в голени или предплечье, видимо, дополнительно угнетает кроветворение, что приводит к сокращению продолжительности жизни в группах после сочетанного облучения. Кроме того, возможно, эти эффекты обусловлены способностью нейтронов к прогрессирующему увеличению ОБЭ, обратно пропорциональному дозе, при котором падение дозы с расстоянием вдоль пучка нейтронов сопровождается более высокими значениями ОБЭ в нормальных тканях за пределами мишени [11].

Таким образом, в нашей работе было показано, что комбинированное облучение мышей нейтронами в дозе 5 Гр как до, так и после двукратного облучения ТСПП, эффективно подавляло рост солидной АКЭ в течение месяца после воздействия. По частоте и тяжести лучевых поражений кожи, наблюдаемых через 15–40 сут после терапии, облучение нейтронами после ТСПП приводило к значительному улучшению этих показателей по сравнению с ТСПП, однако облучение нейтронами перед ТСПП оказалось более повреждающим, чем в других вариантах. В отдаленные сроки после комбинированного облучения у мышей-опухоленосителей было выявлено значительное ухудшение таких показателей, как частота рецидивирования и СПЖ. Значение последовательности воздействия излучений с разной ЛПЭ на индукцию биологических эффектов при сочетанном облучении также показано в работе по исследованию действия протонов и ионов углерода на выживаемость опухолевых клеток в культуре [18]. В работе [19] при сочетанном действии равных доз гамма-излучения и протонов (32 Гр) по критериям индукции патологических митозов, апоптотической гибели опухолевых клеток и снижения их пролиферативной активности показано усиление действия ТСПП.

Полученные в нашей работе результаты на модели контроля опухолевого роста АКЭ у мышей показывают, что регистрация как краткосрочных, так и отдаленных последствий, позволяет более полно оценить эффективность схем облучения, выявить разнонаправленный характер проявления реакций, системно подойти к преимуществам и недостаткам метода при выборе лечения опухоли в зависимости от локализации, размера, формы, близости к критическим органам, а также учесть возможный вклад лучевых повреждений кожи при выборе стратегии терапии. Используемый подход оценки противоопухолевой эффективности сочетанного действия излучений на животных может быть полезным для отработки новых схем лучевой терапии, расширения спектра клинических показаний и совершенствования ПТ.