Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 498, № 1, стр. 249-253

Пузырчатка является аутоиммунным буллезным дерматозом, который характеризуется тяжелым и прогрессирующим течением, высокой инвалидизацией и потенциальной летальностью. Болезнь развивается в связи с образованием в организме и дальнейшим взаимодействием аутореактивных антител (АТ) класса IgG с экстрацеллюлярным доменом Dsg3, что приводит к разрушению десмосом и потере межклеточной адгезии, т.е. к акантолизу [1].

В составе молекулы Dsg3 человека выделяют внутриклеточный, трансмембранный и экстрацеллюлярный домены. Антигенные сайты, с которыми и происходит взаимодействие аутореактивных АТ, располагаются в экстрацеллюлярном домене, состоящем из 5 фрагментов (EC1, EC2, EC3, EC4, EC5) [2]. Наиболее иммуногенными, т.е. против которых выделяется преимущественное количество патогенных аутореактивных АТ у больных, считаются фрагменты, располагающиеся на N-конце Dsg3, где образуются Ca²⁺-зависимые конформационные эпитопы [3].

Целью данной работы являлось получение рекомбинантного белка EC2-Fc Dsg3 человека, химическая иммобилизация его на носителе и анализ способности такого иммуносорбента селективно извлекать из сывороток пациентов с пузырчаткой специфические аутореактивные АТ.

С помощью полимеразно-цепной реакции (ПЦР) был амплифицирован фрагмент ДНК, кодирующий ЕС2-домен Dsg3 человека 159–268 а.о. в соответствии с P32926 базы последовательностей белков UniProt), а также получена нуклеотидная последовательность, соответствующая шарнирному участку и CH2-CH3 доменам IgG1 человека. Далее методом SOE-ПЦР данные фрагменты были объединены, при этом конечная экспрессионная кассета содержала последовательность Козак (CTCAAA), нативные лидерный (MMGLFPRTTGALAIFVVVILVHG) и прелидерный (ELRIETKGQYDEEEMTMQQAKRRQKR) пептиды Dsg3 человека. Наработку белка EC2-Fc проводили в клетках CHO методом транзиентной экспрессии, для чего была использована плазмида pcDNA3.4 (Invitrogen, США), в которую клонировали экспрессионную кассету по сайтам рестрикции NheI/XhoI. Очистку EC2-Fc из среды культивирования осуществляли методом аффинной хроматографии на протеин А-сефарозе. Аналитическая гель-фильтрационная хроматография была выполнена на колонке Superdex 200-10/300-GL (GE Healthcare, США). После проведения электрофореза в ПААГ-SDS белок EC2-Fc был выявлен как основная полоса, мигрирующая в соответствии с ожидаемой молекулярной массой 78 кДа. Продуктивность используемой транзиентной системы экспрессии составила до 110 мг/л среды культивирования.

Подобным образом также были получены гибридные белки EC1-Fc и EC4-Fc, содержащие фрагменты EC1 и EC4 экстрацеллюлярного домена Dsg3 соответственно.

Выделенный целевой белок с подтвержденной методом LC-MS/MS (анализ выполнен на приборе Orbitrap Tribrid Lumos, Thermo, США) аминокислотной последовательностью иммобилизовали на полимерном активированном носителе. В качестве носителя использовали макропористую, активированную бромгидриновыми -О-СН₂СН(ОН)-СН₂Вr группами матрицу WorkBeads 40/10000ACT (Bio-Works, Швеция).

Для оптимизации процесса иммобилизации использовали человеческий IgG. Разработан метод количественного связывания IgG (до 60 мг белка/мл носителя). Химическое связывание иммуноглобулина происходит в течение 1 ч в 0.5 М натрий-фосфатном буферном растворе при рН 8.5 при комнатной температуре. Иммобилизация через бромгидриновые группы при рН 8.5 приводит к прочной ковалентной связи с первичными аминогруппами без образования заряженных групп на поверхности. Остаточные активные группы носителя нейтрализовали обработкой 1 М раствором моноэтаноламина при рН 9.5 в течение 1 ч при комнатной температуре.

Рекомбинантный аффинный лиганд EC2-Fc иммобилизовали с концентрацией 5, 10, 15 и 28 мг/мл носителя. Такие концентрации выбраны исходя из возможности исследования свободного связывания и проявления потенциальных стерических препятствий в порах носителя при образовании сорбционного комплекса “ЕС2-Fc – АТ”.

Процесс сорбции антител к ЕС2-фрагменту Dsg3 был изучен на примере сыворотки больного вульгарной пузырчаткой. Для проведения сорбции в статических условиях использовали сорбенты в объеме 50 мкл, содержащие 5, 10, 15 и 28 мг лиганда ЕС2-Fc/мл носителя. Процесс иммуносорбции на колонке с рекомбинантным белком ЕС2-Fc в качестве лиганда оценивали методом двухэтапного конкурентного иммуноферментного анализа [4]. Активность аутоантител к полноразмерному экстрацеллюлярному домену Dsg3 человека оценивали в тест-системе “Anti-Dsg3 ELISA (IgG)” (Euroimmun, Германия). Взаимодействие АТ с отдельными фрагментами в виде EC1-Fc, ЕС2-Fc, EC4-Fc и отрицательным контролем для оценки неспецифической сорбции, БСА, определяли в иммунологических планшетах (Greiner-bio, Германия) с иммобилизованными соответствующими рекомбинантными белками в концентрации 10 мкг/мл.

Образцы сыворотки до и после взаимодействия с сорбентом в разведении 1:100 преинкубировали в течение 3 ч в лунках с сорбированными полноразмерным экстрацеллюлярным доменом Dsg3 человека, отдельными фрагментами экстрацеллюлярного домена Dsg3 человека, слитыми с Fc-доменом и БСА. Реакцию сыворотки с каждым фрагментом рассчитывали в соответствии с формулой (%):

где А_Pos – активность сыворотки после предынкубации с полноразмерным экстрацеллюлярным доменом Dsg3 (положительный контроль); А_R – активность сыворотки после предынкубации в планшете с отдельным фрагментом экстрацеллюлярного домена Dsg3 человека; А_Neg – активность после предынкубации с БСА (отрицательный контроль) [4].

Активность аутореактивных АТ сыворотки к полноразмерному экстрацеллюлярному домену Dsg3 человека, выраженная в условных единицах (RU), составила 310–320 RU/мл; активность к ЕС2 – 140 RU/мл.

Определение статической емкости проводили путем внесения в колонку, объем которой составлял 50 мкл, сыворотки больного пузырчаткой с известным содержанием антител к ЕС2-фрагменту Dsg3 человека. Объем сыворотки был кратным 1, 3, 4, 5 и 6 объемам колонки и содержал 7–42 RU аутореактивных АТ, специфично взаимодействующих с ЕС2-Fc, иммобилизованным на носителе.

После добавления сыворотки суспензию перемешивали на шейкере в течение 1 ч, затем декантировали равновесный раствор и определяли содержание в нем несвязавшихся антител к полноразмерному экстрацеллюлярному домену Dsg3 человека и к эпитопу ЕС2. Количество сорбированных АТ определяли по разнице их значений в растворах до и после сорбции. На основании полученных данных строили графики насыщения аффинных сорбентов в зависимости от соотношения матрица/лиганд и количества аутоантител к ЕС2.

Динамическую емкость адсорбции AT к ЕС2-Fc и возможность регенерации определяли на сорбенте с содержанием привитого ЕС2-Fc-лиганда в количестве 15 мг/мл носителя. Объем сорбента в колонке составлял 200 мкл. За один цикл сорбции через колонку пропускали 1 мл сыворотки, что соответствует пяти объемам колонки, при скорости потока 50 см/ч. После каждого цикла аффинного связывания колонку регенерировали 0.1 М раствором глицина с 5 мМ CaCl₂ и уравновешивали ФСБ буфером, затем пропускали через колонку новую порцию сыворотки. Всего было проведено три цикла аффинного связывания/регенерации, при этом в проскоке после каждого цикла определяли содержание несвязавшихся аутоантител к полноразмерному экстрацеллюлярному домену Dsg3 человека и к фрагментам ЕС1, ЕС2, ЕС4. На основании полученных данных были построены иммунные профили сыворотки до и после взаимодействия с сорбентом.

Исследование стабильности состава плазмы крови при контакте с полученным аффинным сорбентом проводили в соответствии со статьей [5] путем сравнения ряда показателей (прозрачность, цветность, рН, белок, фракционный состав, активность фактора VIII) до и после пропускания плазмы через колонку (5 объемов колонки при скорости 50 cм/ч).

Таким образом, в результате определения статической емкости было показано следующее: при проведении сорбции с использованием возрастающей нагрузки на сорбенты установлено, что с повышением концентрации привитого лиганда EC2-Fc от 5 до 15 мг/мл матрицы количество сорбируемых специфических аутореактивных АТ возрастает от 280 RU/мл сорбента до 530 RU/мл сорбента (рис. 1).

Сорбент с содержанием 15 мг EC2-Fc/мл носителя связывает около 80% всех добавленных АТ, тогда как сорбенты с концентрацией закрепленного ЕС2-Fc 5 мг/мл и 10 мг/мл сорбируют лишь 70% добавленных АТ. Если оценить величину связывания в расчете на 1 мг привитого лиганда EC2-Fc, то можно видеть, что при снижении количества закрепленных лигандов эффективность связывания возрастает. Для сорбента с концентрацией 15 мг EC2-Fc/мл эта величина составляет 30–35 RU АТ/мг привитого лиганда, а для сорбента 5 мг EC2-Fc/мл увеличивается до 55 RU АТ/мг привитого лиганда. Полученный результат свидетельствует о том, что в диапазоне исследованных концентраций, вероятно, начинают проявляться стерические препятствия при аффинном связывании АТ, обусловленные значительными размерами как лиганда, так и сорбируемых иммуноглобулиновых молекул. Тем не менее анализ полученных данных показал, что возможности увеличения емкости далеко не исчерпаны. Для исследования закономерностей роста емкости с возрастанием поверхностной концентрации привитого аффинного лиганда нами был получен сорбент с концентрацией закрепленных групп EC2-Fc 28 мг/мл носителя, что на наш взгляд близко к предельным возможным значениям эффективной работы иммобилизованных ЕС2-Fc лигандов.

Действительно, эта величина составляет 50% от максимально возможной концентрации привитого иммуноглобулина, полученной нами на этом сорбенте, и должна быть близка к максимально возможной концентрации аффинного комплекса “лиганд-антитело” с учетом его размера. Нами установлено, что такой сорбент количественно связывает добавленные АТ из объема сыворотки, в 7 раз превышающей объем сорбента, тогда как сорбент, содержащий 15 мг EC2-Fc/мл сорбента, способен связать не более 80% антител из 5-6 объемов добавленной сыворотки, т.е. сорбционная емкость увеличивается с возрастанием количества закрепленных лигандов, но не пропорционально увеличению их количества.

В процессе определения динамической емкости было установлено, что после первого и второго циклов сорбции остаточная активность сыворотки по отношению к ЕС2 в элюате составила около 50% от исходного содержания, после третьего около 40% (табл. 1). Соответственно после каждого цикла с колонкой связывается 40–50% АТ к ЕС2, что соответствует динамической сорбционной емкости на уровне 300–400 RU АТ/мл сорбента.

Селективность взаимодействия оценивали до и после цикла аффинного связывания при динамической сорбции по изменению эпитопного профиля сыворотки (табл. 2).

Из табл. 2 видно, что содержание АТ к EC1-Fс и EC4-Fс, а также полноразмерному экстрацеллюлярному домену Dsg3 человека уменьшилось на 18–22%, тогда как концентрация АТ к EC2-Fc снизилась на 46%. Полученные значения демонстрируют высокую селективность сорбента, а по величине сорбции соответствуют результатам динамического связывания АТ. Примерно одинаковое относительное снижение антител к EC1-Fс, EC4-Fс и полноразмерному экстрацеллюлярному домену Dsg3 указывает на дополнительный механизм неселективного связывания с аффинным сорбентом.

Анализ характеристик плазмы крови после пропускания ее через сорбент показал, что для ряда изученных параметров заметных изменений не происходит, что свидетельствует об инертности сорбента к плазме крови.

В результате проделанной работы впервые был получен иммуносорбент на основе рекомбинантного отдельного фрагмента EC2 экстрацеллюлярного домена Dsg3 человека, способного селективно связывать аутореактивные АТ к указанному домену. Сорбент инертен по отношению к компонентам плазмы крови. Высокая емкость сорбента и эффективность связывания в динамическом режиме позволяют надеяться на получение эффективных сорбентов для гемосорбции.