Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 499, № 1, стр. 338-343

Ферменты базидиальных грибов перспективны для применения в аналитических приложениях. В частности, большой интерес исследователей связан с изучением применимости экстраклеточных оксидаз грибов в создании диагностических тест-систем [1–4]. При этом следует сказать, что широкое применение секретируемых оксидаз базидиомицетов в биомедицинской аналитике сдерживается их недостаточной стабильностью. Для повышения резистентности грибных оксидаз к воздействию негативных факторов реакционной среды и сохранения каталитической функции при многократном использовании осуществляется их иммобилизация на разных типах носителей, в том числе наночастицах [5–8]. Одним из перспективных носителей для иммобилизации ферментов (например, экстраклеточных оксидаз базидиомицетов) являются модифицированные наноалмазы (МНА) взрывного синтеза, которые ранее были успешно использованы в создании индикаторных тест-систем для биомедицинской диагностики [9, 10].

Недавно в водных экстрактах из мицелия базидиомицета Neonothopanus nambi, содержащих экстраклеточные оксидазы гриба, мы обнаружили ФАД-содержащий фермент, который в отличие от известных пероксидаз катализировал реакцию соокисления фенола с 4-аминоантипирином (4-ААП) без добавления экзогенного пероксида водорода [11]. Результаты проведенных исследований позволили высказать гипотезу, что данный фермент является оксидазой со смешанной функцией и прогнозировать его пригодность для аналитических целей.

Настоящая работа посвящена созданию на основе МНА и обнаруженной экстраклеточной оксидазы базидиомицета N. nambi индикаторной системы и оценке ее применимости для многократного определения фенола в водной среде.

Мицелий базидиомицета N. nambi IBSO 3293 из Коллекции микроорганизмов CCIBSO 836 (ИБФ СО РАН, ФИЦ “КНЦ СО РАН”, Красноярск) был использован для выделения экстраклеточных грибных ферментов. Биомассу мицелия в виде пеллет шарообразной формы получали разработанной нами ранее технологией выращивания данного гриба в погруженных условиях с использованием картофельно-сахарозной среды (“HiMedia Laboratory”, Индия). Экстраклеточную оксидазу, катализирующую соокисление фенола с 4-ААП без участия экзогенной перекиси водорода, выделяли из мицелия N. nambi способом, изложенным нами в предыдущей работе [11]. Процедура выделения включала: обработку суспензии пеллет мицелия β-глюкозидазой (“Serva”, Германия) в деионизованной (ДИ) воде (Milli-Q system, “Millipore”, США) для извлечения экстраклеточных ферментов гриба, концентрирование водного экстракта, содержащего экстрагированные ферменты и их разделение гель-фильтрационной хроматографией концентрата на колонке с Sephadex G-200 (“Pharmacia”, Швеция) с использованием в качестве элюента водного раствора 50 мМ хлорида натрия.

После хроматографии фракции, содержащие наибольшую активность изучаемого фермента, объединяли и концентрировали ультрафильтрацией через мембрану с пределом исключения 10 кДа (“EMD Millipore Amicon, Darmstadt”, Германия). При концентрировании в образце проводили трехкратную замену ДИ воды для более полного удаления остатков элюента. Полученный концентрат (финальный препарат экстраклеточной оксидазы) использовали в экспериментах. Белковый состав финального препарата оценивали с помощью SDS-электрофореза в полиакриламидном геле [12], используя в качестве маркеров набор белков фирмы “Invitrogene Corporation” (США) с молекулярными массами 250, 150, 100, 75, 50, 37 и 25 кДа соответственно.

Активность изучаемой оксидазы во фракциях после хроматографии и финальном препарате оценивали реакцией соокисления фенола с 4-ААП. Для тестирования использовали 4-ААП (1-фенил-2,3-диметил-4-аминопиразолон) квалификации ч.д.а. (“Реахим”, Россия) и фенол (“Fluka”, Германия), растворы реагентов готовили in situ в ДИ воде. При измерении активности фермента реакционная смесь (600 мкл) содержала 5.96 мМ фенола, 0.49 мМ 4-ААП и 100 мкл тестируемого образца. После добавления всех компонентов реакции пробы перемешивали 3 с на Vortex-Genie 2 g-560E (“Scientific Industries, Inc.,” США) и инкубировали 30 мин при 22°C. Уровень оксидазной активности в пробах оценивали по выходу цветного продукта реакции (хинонимин), который регистрировали спектрофотометрически (UV-1800, “Shimadzu”, Япония) по величине поглощения при длине волны 506 нм. Активность фермента выражали в единицах оптической плотности на 1 мг белка. Концентрацию белка в образцах определяли микробиуретовым методом по величине поглощения при 330 нм (UV-1800), используя БСА (“Sigma”, США) в качестве стандарта [13].

Для иммобилизации выделенной из гриба N. nambi экстраклеточной оксидазы использовали МНА со средним размером кластеров (d₅₀) в гидрозолях 50 нм (Zetasizer Nano ZS, “Malvern Instruments Ltd.”, Англия), которые получали из коммерческих детонационных наноалмазов (ООО “Реал-Дзержинск”, Россия) разработанным ранее способом [14]. Сухой порошок МНА получали высушиванием гидрозоля в роторном испарителе Rotavapor R-215 (“Buchi”, Швейцария). Для экспериментов готовили гидрозоль с концентрацией МНА 10.0 мг/мл добавлением ДИ воды к навеске порошка наночастиц.

В экспериментах использованы также: каталаза из печени быка (активность фермента – 80 000 U/mg) (“Serva”, Германия), ФАД (“Sigma”, США), соли металлов FeSO₄ и CuSO₄ квалификации ч.д.а. (“Реахим”, Россия). Для исследований растворы перечисленных реагентов готовили in situ в ДИ воде.

Комплекс МНА–оксидаза получали адсорбцией фермента на наночастицы. Для этого финальный ферментный препарат смешивали с гидрозолем МНА при весовом соотношении компонентов 1 : 3 (белок : наночастицы). Полученную суспензию инкубировали при 25°С в течение 1 ч при постоянном перемешивании со скоростью 150 об/мин (шейкер OS-10, “BIOSAN”, Латвия). МНА с адсорбированным ферментом собирали центрифугированием при 16 000 g (Centrifuge 5415R, “Eppendorf”, Германия) в течение 10 мин при 4°С. Супернатант отбирали для оценки количества фермента, не связавшегося с МНА. Полученный осадок трижды отмывали раствором 120 мМ NaCl для проверки десорбции оксидазы, иммобилизованной на МНА. Осадок наночастиц каждый раз ресуспендировали в новой порции промывочного раствора, собирали центрифугированием и отбирали супернатант для оценки оксидазной активности. Отмытый комплекс МНА–оксидаза ресуспендировали в ДИ воде и использовали для экспериментов.

Тестирование активности фермента, иммобилизованного на МНА, проводили так же, как изложено выше. После проведения реакции комплекс МНА–оксидаза удаляли из реакционной смеси центрифугированием (Centrifuge 5415R) и определяли в супернатанте количество образовавшегося продукта. Активность фермента выражали в единицах оптической плотности на 1 мг белка, адсорбированного на наночастицы. При изучении применимости полученной индикаторной системы (комплекс МНА–оксидаза) для многократного определения фенола использовали водные пробы с одинаковой концентрацией аналита. В этом случае после проведения реакции комплекс собирали центрифугированием и отбирали супернатант для спектральной оценки (UV-1800) образовавшегося продукта. Осадок трижды промывали ДИ водой для удаления остатков компонентов и продукта реакции, каждый раз ресуспендируя наночастицы в новой порции промывочного раствора и собирая центрифугированием. Отмытый комплекс МНА–оксидаза ресуспендировали в ДИ воде и добавкой фенола и 4-ААП вновь запускали реакцию.

Все эксперименты по оценке активности фермента и комплекса МНА–оксидаза проводили в трех повторностях. Планки погрешностей определяли как стандартное отклонение среднего значения из 3 повторов.

В данной работе мы установили, что экстра-клеточная оксидаза, выделенная из базидиомицета N. nambi с помощью описанной выше технологии, хотя и не является гомогенной, однако имеет высокую степень чистоты (рис. 1). Из представленных данных SDS-электрофореза видно, что финальный препарат выделенного фермента содержит практически один доминантный белок с молекулярной массой около 60 кДа. При этом следует заметить, что величина молекулярной массы данного фермента в денатурирующих (рис. 1) условиях совпадает с величиной его молекулярной массы в нативных условиях, установленной нами ранее при гель-фильтрационной хроматографии [11]. Это позволяет говорить, что изучаемая экстраклеточная оксидаза базидиомицета N. nambi является мономерным ферментом.

Рис. 1.

Электрофореграмма финального препарата экстраклеточной оксидазы, выделенной из мицелия базидиомицета N. nambi. На треках SDS-электрофореза: 1 – маркерные белки с молекулярной массой 250, 150, 100, 75, 50, 37 и 25 кДа соответственно, 2 – препарат выделенного фермента.

В экспериментах мы показали, что инкубация финального препарата фермента с МНА сопровождается эффективной адсорбцией выделенной оксидазы на наночастицы. При выбранных экспериментальных условиях (весовое соотношение компонентов – белок : наночастицы, время инкубации, температура и скорость перемешивания смеси) на МНА адсорбировалось более 85% белка. При этом мы установили, что изучаемая оксидаза прочно связывается с наночастицами. По крайней мере, адсорбированный фермент не элюировался при последовательных трехкратных промывках комплекса МНА–оксидаза раствором 120 мМ хлорида натрия. Регистрируемый в суммарном объеме промывок выход продукта реакции соокисления составлял не более 1.5–2%, по сравнению с выходом в исходном препарате фермента.

В исследованиях мы установили, что иммобилизованная на МНА оксидаза проявляет свою каталитическую функцию и обеспечивает образование продукта в реакции соокисления фенола с 4-ААП без добавления пероксида водорода (рис. 2а). При этом следует сказать, что в сравнительных экспериментах мы обнаружили интересный эффект. Как видно из представленных данных (рис. 2а), в присутствии комплекса МНА–оксидаза наблюдается значительно больший (на порядок и более) выход продукта, по сравнению с выходом в присутствии свободного фермента. Мы предполагаем следующий механизм этого эф-фекта.

Рис. 2.

Выход цветного продукта реакции соокисления фенола с 4-ААП, отражающий эффективность функционирования экстраклеточной оксидазы из базидиомицета N. nambi в образцах с одинаковым количеством фермента. (а): 1 – свободная оксидаза (финальный препарат фермента), 2 – иммобилизованная оксидаза (комплекс МНА–фермент); (б): свободная оксидаза без (1) и в присутствии 50 µМ Fe²⁺ (2) и 50 µМ Cu²⁺ (3) соответственно. Данные рассчитаны на 1 мг белка и нормированы в рядах измерений на значение выхода продукта при измерении активности свободной оксидазы в финальном ферментном препарате.

В предыдущей работе мы высказали гипотезу, что изучаемая экстраклеточная оксидаза базидиомицета N. nambi является ферментом со смешанной функцией [11]. Согласно этой версии, данная оксидаза при наличии фенола в водной среде сначала генерирует пероксид водорода, который затем используется в реакции соокисления фенола с 4-ААП. Об образовании пероксида водорода под действием изучаемого фермента свидетельствуют результаты экспериментов, в которых было показано, что добавки в реакционную смесь экзогенной каталазы (концентрации в пробе 2–4 мкг/мл) снижают выход продукта реакции на 23–35%, по сравнению с контролем.

При этом ранее мы установили, что МНА катализируют образование цветного продукта в реакции окислительного азосочетания (фенол – 4-ААП – Н₂О₂) за счет поверхностных микропримесей ионов железа и меди [15]. В этой работе было показано, что предварительная обработка МНА хелатором двухвалентных ионов ЭДТА с последующей отмывкой наночастиц от избытка реагента снижала выход продукта катализируемой ими реакции в два раза и более.

Учитывая изложенные выше факты, мы предполагаем, что более эффективное образование продукта при использовании комплекса МНА–оксидаза происходит двумя путями – ферментативно (за счет иммобилизованной оксидазы) и неферментативно (с участием ионов Fe²⁺ и Cu²⁺ на поверхности МНА). В пользу этого свидетельствуют результаты дополнительных исследований, в которых было установлено, что добавки ионов железа или меди (концентрация в пробе 50 µМ) в содержащую свободный фермент реакционную смесь увеличивали выход продукта по сравнению с контролем в 2 и 4 раза соответственно (рис. 2б).

В свою очередь, полученные данные позволяют рассматривать МНА как усилитель реакции соокисления и прогнозировать увеличение чувствительности системы индикации фенола, создаваемой на основе МНА и экстраклеточной оксидазы базидиомицета N. nambi. Мы предполагаем также, что эффект МНА, как усилителя, может быть использован и для повышения эффективности иных диагностических систем, создаваемых на основе МНА и других оксидазных ферментов, катализирующих образование пероксида водо-рода.

В модельных экспериментах нами была продемонстрирована применимость полученного индикаторного комплекса МНА–оксидаза для многократного определения фенола в водной среде (рис. 3). Из представленных данных видно, что, по крайней мере, при последовательном пятикратном использовании одного и того же образца комплекса для тестирования проб с одинаковой концентрацией аналита регистрируется практически одинаковый выход цветного продукта реакции соокисления фенола с 4-ААП. Наблюдаемое в ходе последовательных измерений снижение выхода продукта может быть вызвано частичной инактивацией фермента. В частности, это может происходить при многократном ресуспендировании и осаждении комплекса МНА–оксидаза на стадиях его отмывок от остатков компонентов и продукта реакции.

Рис. 3.

Выход продукта реакции соокисления (фенол – 4-ААП) при последовательном многократном использовании комплекса МНА–оксидаза для определения фенола в водных пробах с одинаковой концентрацией аналита. Данные рассчитаны на 1 мг белка и нормированы на значения выхода продукта при первом тестировании аналита.

В исследованиях мы установили, что иммобилизованная на МНА оксидаза из базидиомицета N. nambi проявляет функциональную активность и катализирует образование продукта реакции соокисления фенола с 4-ААП после длительного хранения водной суспензии комплекса МНА–фермент при 4°C (рис. 4). Из представленных данных видно, что даже после двух месяцев хранения в этих условиях адсорбированный на наночастицы фермент обеспечивал выход до 70% продукта реакции, по сравнению с выходом, который наблюдался при использовании свежеприготовленного комплекса МНА–оксидаза. Мы предполагаем, что снижение активности оксидазы при длительном хранении, как и частичная ее инактивация при многократном использовании комплекса МНА–оксидаза (рис. 3), не являются следствием потери ферментом ФАД. В модельных экспериментах было показано, что предварительная инкубация в присутствии ФАД (концентрации в пробе 0.1, 1.0 и 10 µМ) водных образцов фермента, длительное время (два месяца) хранившихся при 4°С, не увеличивала выход продукта реакции, по сравнению с контролем (рис. 4, вставка).

Рис. 4.

Выход продукта реакции соокисления фенола с 4-ААП, катализируемой комплексом МНА–оксидаза, в зависимости от времени его хранения в ДИ воде при 4°C. Данные рассчитаны на 1 мг белка и нормированы на значения выхода продукта при тестировании аналита с использованием свежеприготовленного комплекса. На вставке приведен пример образования продукта реакции, катализируемой свободным ферментом после хранения его водных образцов два месяца при 4°С: без (1) и после (2) предварительной инкубации в присутствии 10 µМ ФАД. Данные рассчитаны на 1 мг белка и нормированы на значения выхода продукта в контроле.

Таким образом, на основе экстраклеточной оксидазы из базидиомицета N. nambi в качестве сенсора и МНА детонационного синтеза, как носителя, создана система индикации фенола. Установлено, что при адсорбции фермент прочно связывается с наночастицами и проявляет каталитическую активность в реакции соокисления фенола с 4-ААП без участия экзогенного пероксида водорода. Обнаружен эффект значительно большего выхода продукта реакции при использовании комплекса МНА–оксидаза, по сравнению с выходом в присутствии свободного фермента. Высказано предположение, что более эффективное образование продукта в присутствии комплекса обеспечивается участием ферментативного (за счет иммобилизованной оксидазы) и неферментативного (за счет примесей ионов Fe²⁺ и Cu²⁺ на поверхности МНА) механизмов. В свою очередь, выявленный эффект позволяет прогнозировать увеличение чувствительности созданной системы индикации. В модельных экспериментах показана применимость комплекса МНА– оксидаза для многократного определения фенола в водных образцах. Установлено, что иммобилизованный на наночастицы фермент проявляет активность при длительном (два месяца) хранении водной суспензии комплекса МНА–оксидаза при 4°С и катализирует образование продукта реакции соокисления. В целом результаты выполненных исследований открывают перспективы конструирования на основе МНА и экстраклеточной оксидазы гриба N. nambi новой эффективной многоразовой индикаторной системы для экологического мониторинга загрязнений водной среды фенолом. Получение данного фермента в гомогенном виде для установления его структуры и функциональных особенностей является приоритетной задачей дальнейших исследований.