Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 503, № 1, стр. 208-212

POU2F1 оверэкспрессируется во многих злокачественных опухолях и опухолевых клеточных линиях. При этом высокий уровень белка POU2F1 коррелирует с крайне неблагоприятным прогнозом течения заболевания [1–7]. Так, в работе Sharpe и соавт. [3] показан повышенный уровень экспрессии POU2F1 в клеточных линиях карциномы головы и шеи по сравнению с образцами нераковых клеток тех же тканей у тех же пациентов. Нокдаун POU2F1 приводил к существенному снижению пролиферации и роста в клеточных линиях этих типов опухолей. Показано, что POU2F1 регулирует регенерацию и опухолевую трансформацию в клеточной линии HCT116 (клетки опухоли прямой кишки) [5] и других опухолей [4, 6–9].

Интересно, что уровень обнаруженного белка POU2F, зачастую не коррелирует с уровнем соответствующей мРНК. Так, например, в костном мозге обнаружено высокое содержание мРНК POU2F1, но соответствующего белка в этой ткани незначительное количество. В прямой кишке, наоборот, количество соответствующей мРНК сравнительно небольшое, а количество белка – одно из самых высоких. Это возможно, если экспрессия POU2F1 регулируется в значительной степени на уровне трансляции.

Нами была обнаружена новая изоформа POU2F1Z, трансляция которой многократно возрастает при клеточном стрессе. Одной из функций этой изоформы является защита клеток от повреждающего действия различных видов стресса [10]. мРНК POU2F1Z экспрессируется во всех тканях и клетках человека, но на максимальном уровне она обнаруживается в коре головного мозга и в лимфоидных клетках. В частности, высокий уровень экспрессии белка POU2F1Z был обнаружен нами в опухолевых клетках лимфомы Беркитта Namalwa. Интересно, что у человека обнаружены сразу две мРНК (MT294127 и AK091438.1), с которых транслируется один и тот же белок POU2F1Z (UniProt KBP14859-3). Эти мРНК транскрибируются с двух альтернативных промоторов гена POU2F1 и отличаются 5-концевыми последовательностями. По сравнению с хорошо изученными изоформами POU2F1A и POU2F1L, POU2F1Z содержит дополнительный экзон Z, расположенный между экзонами 3 и 4. При сплайсинге этот экзон привносит в последовательность мРНК стоп-кодон, а следом – ATG-кодон, совпадающий с “основной” рамкой считывания белка POU2F1. Для получившейся мРНК с этого привнесенного триплета ATG синтезируется изоформа POU2F1Z с новым N-концевым доменом, а с ATG-кодона, расположенного в первом экзоне, синтезируется короткий пептид (рис. 1).

Рис. 1.

Схема строения двух изоформ мРНК POU2F1, с которых транслируется одинаковый белок POU2F1Z. Экзон Z формируется из последовательности транспозона Tigger2. uORF – короткая открытая рамка считывания на 5'-конце мРНК, трансляция которой начинается с ATG-кодов альтернативных экзонов A(U) или L. Звездочкой обозначены стоп-кодоны. Начало трансляции изоформы POU2F1Z обозначено ATG в области экзона Z.

В нормальных условиях синтез этого короткого пептида (uORF) ингибирует трансляцию последующей длинной рамки считывания (белка POU2F1Z), но в условиях клеточного стресса синтез короткого пептида подавляется и активируется трансляция белка POU2F1Z [10].

Ранее мы показали, что активация трансляции POU2F1Z начинается под действием повреждающих агентов и защищает клетки от гибели [10]. Мы предполагаем, что такой механизм защиты может существенно повышать устойчивость раковых клеток к действию химиотерапевтических препаратов и немедикаментозным способам лечения злокачественных опухолей.

В данной работе мы исследовали возникновение изоформы POU2F1Z в процессе эволюции, а также провели поиск и сравнительный анализ этой изоформы у животных подтипа Craniata.

В рамках исследования происхождения экзона Z мы провели выравнивание его последовательности с геномами различных млекопитающих и обнаружили в хромосомах у разных видов довольно много мест встраивания последовательностей, имеющих значимую гомологию с экзоном Z. Мы предположили, что экзон Z может представлять собой мобильный элемент, и на следующем этапе прогнали его последовательность через базу данных мобильных элементов в GeneBank NCBI. Мы обнаружили, что экзон Z, с которого транскрибируется изоформа POU2F1Z, представляет собой фрагменты копии ДНК-транспозона Tigger2, встроившегося в ген POU2F1 между 3 и 4 экзонами, и соответствует участку 2150 – 2461 п.н. данного транспозона.

Рис. 2.

Фрагмент транспозона Tigger2, встроенный в ген POU2F1. Экзоны обозначены прямоугольниками. Стрелками обозначены старты транскрипции. Линиями обозначены участки места сплайсинга. У всех приматов фрагмент Tigger2 содержит делецию (обозначено пунктиром). У всех приматов, кроме лемуров и галаго, фрагмент Tigger2 содержит сайты сплайсинга, стоп-кодон и ATG-кодон. У лемуров и галаго, несмотря на наличие фрагмента Tigger2 в гене POU2F1, образование изоформы мРНК POU2F1Z невозможно, также как и у других млекопитающих, у которых в гене POU2F1 отсутствует транспозон Tigger2.

Tigger2 – это древний ДНК транспозон, который обнаруживают в геномах млекопитающих, в том числе человека. Длина полного реконструированного варианта составляет 2718 п.н. Он включает ген транспозазы (c 603 по 2483 п.н.) и фланкирован инвертированными повторами длиной 24 п.н. Полный вариант Tigger 2 в геномах млекопитающих не был обнаружен, однако повсеместно обнаруживаются различные его фрагменты [11].

Далее мы провели исследование с целью определить, в какой именно момент эволюционного развития животных подтипа Craniata Tigger 2 встроился в ген POU2F1.

Для этого был произведен анализ последовательностей ортологов POU2F1 животных подтипа Craniata, содержащихся в базе данных NCBI. Всего нами было проанализировано 279 видов. Из базы данных Dfam [12] была получена скрытая марковская модель для транспозонаTigger2. При помощи HMMER (ver.3.3.2) [13] был произведен поиск фрагментов Tigger2 в полученных из NCBI последовательностях POU2F1. Для данного анализа мы посчитали необходимым использовать именно метод поиска, основанный на скрытых марковских моделях, реализуемый в HMMER, поскольку показано, что он более чувствителен (по сравнению с blastn и другими методами, основанными на поиске гомологий с единственной последовательностью) в задачах поиска фрагментов древних транспозонов [14].

Из базы NCBI были получены файлы с аннотациями референсных геномов попавших в нашу выборку видов. Из полученных аннотаций были извлечены фрагменты, соответствующие ортологам POU2F1. Полученные аннотации, а также результаты HMMER были наложены на соответствующие референсные сиквенсы генов.

Мы обнаружили, что изоформа POU2F1Z является примат-специфической и отсутствует у других видов животных. Кроме того, в отличие от остальных приматов, Tigger2 не был обнаружен в гене POU2F1 долгопятов.

Мы показали, что во всех исследуемых генах POU2F1 приматов встроенная копия Tigger2 разбита на несколько частей и имеет делецию в области 1341 (–44) – 2119 пн. В генах POU2F1 лемуров и галаго делетированная копия Tigger2 разбита на три части, тогда как в генах POU2F1 остальных приматов – на четыре. Известно, что кодирующая область транспозона Tigger2 расположена на участке 603–2483 пн, из чего следует, что попавшие в состав гена участки Tigger2 не могут кодировать полноценную транспозазу, однако могут сохранять свойства ее отдельных доменов.

На сегодняшний день в базах данных для всех приматов имеются только смоделированные версии последовательностей мРНК POU2F1 и транслируемых с них белков. Однако, по данным моделирования, мРНК и белок изоформы POU2F1Z экспрессируются уже у макак – низших представителей обезьян Старого Света.

В дальнейшем для того, чтобы определить, происходит ли экспрессия мРНК и белка изоформы POU2F1Z в организмах приматов, мы анализировали участок копии Tigger2, встроенный в ген POU2F1 приматов и соответствующий человеческому экзону Z.

При анализе сайтов сплайсинга экзона Z человека мы выяснили, что среди обезьян соответствующие последовательности полностью гомологичны последовательностям сайтов сплайсинга экзона Z человека, за исключением ночных обезьян, у которых в акцепторном сайте предположительного экзона Z присутствует одна нуклеотидная замена. У лемуров и галаго имеются значительные отличия от сайтов сплайсинга экзона Z человека, и можно предположить, что несмотря на наличие фрагмента Tigger2 в этой области гена, в мРНК этот участок не попадает, так как альтернативный сплайсинг этой области невозможен (рис. 2).

Также в исследуемом участке встроенной копии Tigger2 анализировали последовательности предположительных стоп-кодона и ATG-кодона на соответствие таковым в экзоне Z человека. Выяснилось, что стоп-кодоны TAG на данном участке полностью гомологичны для всех приматов, за исключением макак, у которых предположительным соответствующим стоп-кодоном является TAA (рис. 2).

Соответствующие точки начала трансляции (ATG-кодон) присутствуют у всех приматов, за исключением лемуров и галаго (рис. 2), у которых вместо ATG-кодона присутствуют триплеты CTC и GTG соответственно.

Чтобы понять, какие именно события вызвали разделение копии Tigger2 внутри гена POU2F1 на несколько частей, с помощью базы данных мобильных элементов Dfam, был проанализирован участок гена POU2F1 приматов со встроенной копией транспозона Tigger2. В результате мы обнаружили, что в процессе эволюции в копию Tigger2 встраивались другие мобильные генетические элементы, преимущественно типа SINE. В ходе эволюции изменялось как место расположения, так и численность мобильных элементов SINE в пределах исследуемого участка. Указанные изменения происходили в исследуемых генах POU2F1 низших приматов вплоть до макак. Расположение мобильных генетических элементов SINE, установившееся в исследуемом участке гена POU2F1 макак, сохраняется в неизменном виде у остальных приматов – обезьян Старого Света и человека, что может свидетельствовать о его функциональной значимости.

Можно предположить, что именно на данном этапе эволюции произошло попадание участка 2150–2461 п.н. Tigger2 в кодирующую последовательность гена POU2F1, что повлекло за собой положительные эволюционные изменения и, в итоге, привело к образованию экзона Z.

Наши результаты показывают, что инсерция мобильного элемента стала частью функционального гена POU2F1 приматов благодаря пошаговому процессу, который включал в себя транспозицию, утрату способности к дальнейшим перемещениям за счет встраивания внутрь Tigger2 других мобильных элементов, и последующее транскрипционное и трансляционное слияние с геном-мишенью. В нашем исследовании было показано, что новая химерная примат-специфичная изоформа POU2F1Z получилась в результате слияния гена фактора транскрипции POU2F1 и фрагмента гена транспозазы мобильного элемента Tigger 2, давшего начало новому экзону гена POU2F1 приматов.

Появление новых генов и функций имеет первостепенное значение в формировании новых видов животных. В настоящее время достаточно хорошо изучены различные типы дупликаций в образовании новых генов [15]. Гораздо менее понятным является создание новых генов за счет использования материала из “эгоистичных” мобильных генетических элементов. Анализ подобных эволюционных событий – сложная задача, потому что зачастую это результат небольших замен или структурных перестроек, функциональное значение которых трудно определить.

В случае гена POU2F1 человека и приматов такое преобразование привело к возникновению новой изоформы POU2F1Z, которая защищает клетки от повреждающего действия клеточного стресса, но при этом создает трудности для лечения злокачественных новообразований.