Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 504, № 1, стр. 219-222

Твердотельные наноматериалы обладают уникальными физическими свойствами [1–3], которые могут быть эффективно использованы в биомедицинской диагностике и терапии [4–6]. В частности, одним из перспективных методов лечения онкологических заболеваний является магнитная гипертермия, основанная на разогреве пораженного органа до температуры выше 42°C [7, 8]. Хорошо установлено, что поддержание такой температуры в течение 20–30 мин приводит к некрозу раковых клеток, более подверженных влиянию повышенной температуры, чем нормальные ткани. Преимущества использования магнитных наночастиц (МНЧ) в магнитной гипертермии связаны с тем, что ансамбли суперпарамагнитных наночастиц способны обеспечить чрезвычайно большие значения удельного поглощения энергии, порядка 1 кВт на грамм вещества, а также с тем, что в силу малых размеров наночастицы могут глубоко проникать в биологические клетки, ткани и органы. С помощью магнитных полей с большим градиентом функционализированные наночастицы могут быть собраны в нужной области тела (магнитофекция) для направленного терапевтического воздействия, либо отфильтрованы из среды для последующего химического анализа захваченных на их поверхностях молекул [9].

Вместе с тем многие вопросы, связанные с применением магнитных наночастиц в биомедицине, все еще ждут своего решения. Например, необходимо обеспечить достаточно однородное биораспределение наночастиц в пораженном органе. На практике, пока весьма трудно оценить полученное в результате инъекций стационарное распределение наночастиц внутри опухоли и оценить их общую стационарную концентрацию, так как распределение наночастиц заметно варьируется в зависимости от органа и типа биологического материала и существенно зависит от архитектуры кровеносных сосудов в области воздействия. Аналогичные задачи возникают и при изучении локализации биосенсоров на основе МНЧ в анализируемых клетках и тканях с наноразмерным разрешением [10].

Для всестороннего изучения взаимодействия МНЧ с клетками и тканями in vivo необходимы разработка и внедрение новых технологических подходов для анализа микро- и наноструктурных распределений МНЧ в их составе, а также количественной оценки параметров взаимодействия клеток с МНЧ на микро- и наноуровне.

Используемые для подобных исследований в настоящий момент различные варианты микроскопии, такие как электронная микроскопия, атомно-силовая микроскопия и оптическая микроспектроскопия высокого разрешения, не позволяют одновременно определять положение частиц в объеме ткани с требуемой точностью и оценивать их магнитные свойства.

Нами разработана уникальная технология сканирующей оптическо-зондовой нанотомографии (СОЗНТ), комбинирующая ультрамикротом и сканирующий зондовый микроскоп (СЗМ) [11]. Использование методики СОЗНТ позволяет изучать трехмерную микро- и наноструктуру биополимерных материалов, в корреляции с исследованием локализации МНЧ в объеме изучаемых образцов и идентификации их магнитных свойств при помощи метода магнитной силовой микроскопии (МСМ) [12]. Однако исследования трехмерных распределений МНЧ в биологических клетках и тканях ранее не проводились.

Ниже представлены исследования распределений магнитных НЧ, введенных внутривенно и интратуморально в образцы опухолевых тканей меланомы мыши B16/F1.

Суспензии композитных наночастиц на основе кремния и оксида железа были получены методом фемтосекундной лазерной абляции в ацетоне и воде. Для получения наночастиц мишень из силицида железа FeSi₂ (соотношение материалов в мишени Si:Fe 60%:40%) облучалась лазерным излучением (длина волны 1030 нм, длительность импульсов 270 фс, энергия импульсов 30 Дж, частота повторения импульсов 100 кГц, диаметр пучка 3 мм, модель лазера ТЕТА 10, Авеста, Россия). В ходе эксперимента были получены три фракции МНЧ различного размера, средние диаметры частиц в которых составляли 125, 55 и 32 нм.

Измерения магнитных свойств полученных МНЧ свидетельствуют о значительном росте магнитной восприимчивости и появлении слабого магнитного гистерезиса в полученных образцах фракции МНЧ со средним диаметром 55 нм. Все это указывает на наличие суперпарамагнитных свойств полученных МНЧ. Одновременно в экспериментах in vitro была замечена возможность управления накоплением таких МНЧ в водных средах за счет приложения градиента относительно слабого внешнего магнитного поля (~0.1 Тл).

Клетки B16/F1 выращивали в среде RPMI-1640 с добавлением 7% фетальной телячьей сыворотки (HyClone, США), пенициллин-стрептомицина и L-глютамина. Все клетки пассировали путем трипсинизации с помощью раствора трипсин/ЭДТА (ПанЭко, Москва). Для анализа распределения наночастиц в ткани опухоли мышам линии C57BL/6 перевивали опухолевые клетки меланомы мыши B16/F1 и в количестве 1 млн клеток на мышь. При достижении размера опухоли 200–400 мм³ одной группе мышей вводили внутривенно наночастицы размером 55 нм в количестве 300 мкг/мышь, а другой группе – интратуморально (непосредственно в опухоль) в той же дозе. Мышей выводили из эксперимента через сутки, забирали опухоль и фиксировали ее в 4% параформальдегида.

В ходе получения образцов для исследований методом сканирующей магнитно-силовой нанотомографии (СМСНТ) производили дегидратацию образцов опухолевых тканей проводкой по спиртам с увеличивающейся концентрацией и заливку образцов в эпоксидную среду [13].

Далее проводили ультрамикротомирование образцов с помощью ультрамикротома Reichert-Jung Ultracut с алмазным ножом Diatome AFM 2.0 mm, входящим в состав установки СОЗНТ. Данная уникальная научная установка – система зондово-оптической 3D-корреляционной микроскопии (http://ckp-rf.ru/usu/486825/), созданная с участием авторов настоящей работы, – позволяет выполнять серийные СЗМ-измерения наноструктуры поверхности объектов непосредственно после последовательных сверхтонких срезов образца ультрамикротомом [13]. Для каждого образца было выполнено 20 срезов с шагом 230 нм. Измерения с использованием СЗМ-зондов с магнитным покрытием проводились на поверхности образца после каждого среза. Каждое измерение выполнено двухпроходной методикой: в первом проходе измеряется топография поверхности, во втором – магнитные характеристики. Для более детального изображения клеточной структуры использовали режим отображения фазы. После получения серии коррелятивных 2D МСМ и фазовых изображений восстанавливали 3D структуру фрагмента образца при помощи программного пакета Image Pro Plus 6.0 3DConstructor (MediaCybernetics Inc.). Предварительно каждое фазовое изображение объединяли с МСМ изображением для локализации МНЧ.

На рис. 1 приведены изображения фрагментов образцов опухолевых тканей В16/F1 с SiFe МНЧ, введенными внутривенно и интратуморально. Совокупность данных, полученных в результате трехмерной реконструкции методом СМСНТ, дает возможность вычислить ряд количественных параметров изучаемых распределений МНЧ, таких как общий объем восстановленной структуры V_tot, число кластеров в восстановленном объеме N, доля объема кластеров от общего объема r, средний размер кластеров d.

Рис. 1.

Совмещенные трехмерные реконструкции методами СЗНТ (в режиме отображения фазы) и СМСНТ фрагментов опухолевых тканей В16/F1 с SiFe МНЧ, введенными (а) внутривенно и (б) интратуморально. Красные участки соответствуют МНЧ. 30 × 30 × 4.6 мкм, толщина среза 230 нм, масштабный отрезок 5 мкм.

Параметры, полученные в результате анализа трехмерных реконструкций представлены в табл. 1.

Из полученных данных следует, что число N и доля объема кластеров от общего объема r кластеров МНЧ заметно (практически в 2 раза) ниже для случая интратуморального введения МНЧ. Стоит отметить, что, помимо кластеров МНЧ, в клетках имеются и отдельные МНЧ, причем локализуются они преимущественно в области ядер клеток, в отличие от кластеров, которые находятся в объеме клеток.

Разработанная технология исследования трехмерных характеристик наномасштабных распределений МНЧ с использованием принципов сканирующей магнитно-силовой нанотомографии применима для задач исследования особенностей взаимодействия МНЧ с клетками и тканями различных типов.