Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 505, № 1, стр. 277-280

Почти 40% разрабатываемых лекарственных веществ получают в нерастворимом в воде виде, когда наиболее эффективным является способ доставки вещества через желудочно-кишечный тракт. В данном случае неорганические пористые материалы используют в качестве наноядра для транспортировки физиологически активных веществ [1–3]. С этой целью в ряду перспективных материалов рассматривают цеолит, нанокристалы которого синтезируют в лабораторных условиях [4–7]. Альтернативой синтетическому продукту может быть природный минерал. Из семейства природных цеолитов в биомедицинских целях наиболее востребованным остается клиноптилолит [8, 9].

При разработке дизайна платформы на основе твердого материала особое внимание уделяют оболочке, для чего используют фосфолипиды, например, фосфатидилхолин (ФХ) – основной ингредиент клеточной мембраны. Популярность ФХ обусловлена наличием полезных качеств: отсутствие токсичности, биодеградабильность, биосовместимость, самоорганизация структуры, амфифильность, стабилизация дисперсной системы. Предложен способ нанесения оболочки посредством взаимодействия неорганических наночастиц с водной эмульсией ФХ или его производных [1, 10]. Учитывая полезные свойства ФХ и клиноптилолита, комбинацию этих материалов можно рассматривать в качестве перспективной наноплатформы. Обзор доступной литературы показывает отсутствие работ, направленных на создание такой композиции. Поэтому цель данной работы состояла в том, чтобы оценить эффективность адсорбции ФХ ядром природного клиноптилолита и изучить свойства полученной конструкции.

Процедура формирования комплекса наночастицы клиноптилолита и ФХ описана ранее [11]. Кратко, на конечном этапе получения наноядра критичными условиями являются растирание пудры при низких температурах и последующий нагрев готового продукта до комнатной температуры в условиях высокого вакуума. Экстракт пищевой добавки Е322 (Cargill Lecigran 1000P, Германия) в этиловом спирте (0.64 мг/мл) использовали в качестве источника ФХ. Слой фосфолипида на ядра наносили посредством инкубации наночастиц клиноптилолита в спиртовом экстракте ФХ. После центрифугирования полученной суспензии отбирали супернатант, а к осадку добавляли дистиллированную воду с тем, чтобы отмыть этанол и не связанный ФХ, а также стабилизировать наноконструкцию. Для изучения свойств полученного нанопродукта использовали сканирующую электронную микроскопию (SEM), метод динамического рассеяния света, времяпролетную масс-спектрометрию вторичных ионов (ToF-SIMS), UV – спектрометрию раствора ФХ в этаноле.

Качественный анализ адсорбции ФХ

Используемый фосфолипид представляет собой нейтральный диэлектролит, поэтому формирование оболочки наноядра возможно за счет взаимодействия ФХ и фиксированных зарядов на поверхности частиц клиноптилолита. Размер исходного ядра составляет десятки нанометров (рис. 1а), а его гидродинамический диаметр варьирует в диапазоне 200–410 нм (рис. 1б). Различие в указанных величинах может означать то, что свойства поверхности частиц клиноптилолита не соответствуют модели гладкой сферической частицы, которую применяют для оценки результатов метода динамического рассеяния света.

Наличие оболочки на поверхности ядра анализировали посредством метода ToF-SIMS [12], который используют для анализа органической пленки, толщиной нескольких молекулярных слоев [13]. Сравнивали препараты экстракта ФХ, наночастиц клиноптилолита без оболочки или наночастиц, обработанных экстрактом ФХ. Значимость различий между масс-спектрами оценивали в программе NB Toolbox посредством метода РСА (principal component analysis) [14]. Видно (рис. 1в), что области данных ToF-SIMS не перекрываются, что свидетельствует о значимом различии в молекулярном составе сравниваемых образцов. Результаты масс-спектрометрии однородных по составу образцов фосфолипида и наночастиц клиноптилолита находятся в разных полуплоскостях горизонтальной оси. При этом область данных полученной наноконструкции занимает промежуточное положение, что свидетельствует о модификации поверхности наноядра в результате адсорбции на его поверхность ФХ. Различие между масс-спектрами фосфолипида и конструкции отражает то, что толщина оболочки меньше глубины проникновения пучка первичных ионов. В этом случае одновременно ионизируются ядро и материал покрытия. С учетом поперечного разрешения метода ToF-SIMS этот результат позволяет оценить толщину оболочки величиной, не превышающей нескольких нанометров.

Анализ эффективности адсорбции ФХ

Перенос готовой конструкции обратно в этиловый спирт приводит со временем к растворению оболочки, что сопровождается увеличением оптической плотности на длине волны 235 нм (OD 235) характерного спектра поглощения раствора ФХ в этаноле (рис. 2а).

Используя результаты UV спектрометрии (рис. 2а), можно определить эффективность адсорбции ФХ частицами клиноптилолита (параметр “η”), т.е. количество адсорбированного фосфолипида на единицу веса клиноптилолита, что определяют из выражения (1)

где K – эмпирический коэффициент пропорциональности для калибровочной прямой зависимости между концентрацией растворенного ФХ и оптической плотностью раствора; OD_fin235 – оптическая плотность спиртового раствора после растворения в нем оболочки ФХ; V – объем этилового спирта, в котором происходит десорбция оболочки; M_core – вес исходной порции частиц клиноптилолита, которую брали для формирования наноконструкции.

При заданных величинах (K = 0.8 мг/мл, OD_fin235 = 0.4, V = 4 мл, M_core = 20 мг) в выражении (1) параметр η принимает значение 0.062. Если принять допущение о сферической форме ядра и о равномерном распределении адсорбированного материала на поверхности ядра, то толщину слоя ФХ можно оценить из выражения (2)

где: ∆ – толщина оболочки конструкции, r – эффективный радиус ядра, ρ_core и ρ_shell – плотность материала ядра и оболочки соответственно.

Подставляя в выражение (2) известные значения параметров (η = 0.062, r = 70 нм, ρ_core = 2 г/см³, ρ_shell = 1.16 г/см³), рассчитываем толщину оболочки, которая оценивается величиной ~2.5 нм, что соответствует толщине одного слоя фосфолипида. Такой расчет согласуется с прогнозом, полученным на основе данных метода ToF-SIMS.

Гидродинамические свойства наноконструкции

Гидродинамический диаметр полученной наноконструкции варьирует в диапазоне 150–240 нм с максимумом в области 190 нм (рис. 2б). Отметим, гидродинамический диаметр всей конструкции заметно меньше аналогичной характеристики для ядра с максимумом в области 280 нм (рис. 1б). Другими словами, наличие оболочки ФХ вызвало уменьшение гидродинамического размера конструкции, что можно ошибочно интерпретировать как уменьшение реального размера частицы. Данный эффект, по-видимому, обусловлен снижением сопротивления водной среды для готовой конструкции с фосфолипидным покрытием по сравнению с исходным клиноптилолитовым ядром, обладающим шероховатой поверхностью. Теоретические аспекты влияние оболочки на подвижность наночастицы рассматривают в обзоре [15].

Таким образом, в данном исследовании посредством нескольких аналитических методов подтверждено формирование оболочки фосфатидилхолина на поверхности наночастицы клиноптилолита. Наноразмер полученной конструкции, ядро натурального клиноптилолита и фосфолипидная оболочка представляют привлекательное сочетание полезных качеств, которые могут быть востребованы при создании многофункциональной платформы, например, для доставки биологически активных веществ, биоимиджинга или в качестве основы биосенсора.

В завершение можно сделать следующие выводы. Получен новый вид наноконструкции на основе ядра натурального клиноптилолита с оболочкой из фосфатидилхолина. Используя результаты UV-спектрометрии, оценена толщина (~2.5 нм) оболочки, которая не превышает одного слоя фосфолипида. После нанесения оболочки фосфатидилхолина гидродинамический диаметр (190 нм) наноконструкции становится меньше гидродинамического диаметра (280 нм) исходного ядра. Полученные данные позволяют предположить то, что адсорбции фосфолипида модифицируют поверхность наночастицы клиноптилолита, уменьшая силу сопротивления окружающей водной среды.