Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 507, № 1, стр. 483-487

Циклопролилглицин (ЦПГ), эндогенный циклодипептид, теоретически предполагался в качестве топологического пептидного аналога классического ноотропа пирацетама (N-карбамидометилпирролидона-2) [1], а в дальнейшем был идентифицирован в головном мозге грызунов [2], в плазме крови, цереброспинальной жидкости и головном мозге человека [3]. Установлено, что ЦПГ подобен по структуре пирацетаму, и обладает сходным спектром фармакологических эффектов, включая ноотропную, антигипоксическую, нейропротекторную и анксиолитическую активности [4, 5].

В электрофизиологических экспериментах на изолированных клетках Пуркинье мозжечка крыс выявлена способность ЦПГ положительно модулировать токи AMPA-рецепторов [6]. Подобно другим ампакинам [7, 8], ЦПГ повышает содержание мозгового нейротрофического фактора (brain derived neurotrophic factor, BDNF) в нейрональных культурах [9]. При этом важно, что спектр фармакологической активности ЦПГ, включая нейропротекторную, прокогнитивную, антидепрессивную, анальгетическую [10], близок к имеющемуся у BDNF [11, 12]. На основе этих данных нами сформулирована гипотеза, что фармакологические эффекты ЦПГ обусловлены стимуляцией BDNF/TrkB сигналинга вследствие активации AMPA-рецепторов, что было подтверждено введением блокатора Trk-рецепторов K252A или конкурентного антагониста AMPA-рецепторов, соединения DNQX, которые препятствовали проявлению анксиолитического [13] и антигипоксического [5] эффектов ЦПГ.

Логично предположить, что и другие фармакологические эффекты ЦПГ также обусловлены стимуляцией АМРА/BDNF/TrkB каскада. Поэтому в настоящей работе мы изучили влияние конкурентного и неконкурентного антагонистов AMPA-рецепторов, DNQX [14] и GYKI 52466 [15] соответственно, и блокатора Trk-рецепторов K252a [16] на нейропротекторную активность ЦПГ на клеточной модели окислительного стресса.

Модель окислительного стресса на культуре гиппокампальных нейронов линии НТ-22 воспроизводили согласно [17]. Концентрация ЦПГ 10^–6 М была выбрана как наиболее активная в электрофизиологических экспериментах на клетках Пуркинье [6], она также соответствует содержанию эндогенного ЦПГ в мозге у грызунов [2]. Окислительный стресс моделировали путем внесения перекиси водорода в конечной концентрации 1.5 мM в течение 30 мин, затем среду заменяли на обычную. Через 4 ч выполняли измерение жизнеспособности клеток методом MTT-теста с использованием 0.5% водного раствора бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолия [18], измеряя оптическую плотность при 600 нм. Статистическую обработку данных проводили с использованием критерия Краскела–Уоллиса с последующим тестом по Данну (ANOVA) или U-критерия Манна–Уитни. Данные представлены в виде m ± s.d.

ЦПГ, растворенный в стерильной деионизованной воде в конечной концентрации 10^–6 М, вносили в культуру клеток за 24 ч до окислительного стресса. Все блокаторы вносили за 30 мин до ЦПГ через 24 ч после пассажа. При этом K252a в 0.2% ДМСО вносили в конечной концентрации 0.2 мкМ [19], DNQX, также растворенный в 0.2% ДМСО, вносили в конечной концентрации 20 мкМ [20], блокатор GYKI 52466, растворенный в воде, вносили в конечной концентрации 100 мкМ [21]. Схема эксперимента по группам представлена на рис. 1.

Рис. 1.

Схема эксперимента. Группы: 1 – контроль, 2 – блокатор, 3 – ЦПГ, 4 – блокатор+ЦПГ, 5 – H₂O₂, 6 – блокатор + + H₂O₂, 7 – ЦПГ + H₂O₂, 8 – блокатор + ЦПГ + H₂O₂.

Внесение конкурентного антагониста AMPA-рецепторов DNQX, или ЦПГ, или обоих соединений в культуру гиппокампальных клеток НТ-22 при отсутствии повреждающего агента не оказывало статистически значимого влияния на жизнеспособность нейронов (рис. 2). Внесение H₂O₂ снижало жизнеспособность клеток достоверно по сравнению с контролем. Внесение DNQX не влияло на повреждающий эффект перекиси водорода. ЦПГ достоверно восстанавливал жизнеспособность клеток, а его нейропротекторный эффект предотвращался внесением антагониста DNQX.

Рис. 2.

Конкурентный антагонист AMPA-рецепторов DNQX снимает нейропротекторное действие ЦПГ на модели окислительного стресса. *– p < 0.05 по сравнению с группой “Контроль”, ^– p < 0.05 по сравнению с группой “H₂O₂”, ^#– p < 0.05 по сравнению с группой “ЦПГ+H₂O₂” (с использованием критерия Краскела–Уоллиса с последующим тестом по Данну (ANOVA)). Данные представлены в виде m ± s.d.

Аналогично, внесение неконкурентного антагониста AMPA-рецепторов GYKI 52466, ЦПГ или обоих соединений в культуру клеток HT-22 без повреждения не приводило к изменению жизнеспособности нейронов (рис. 3). Внесение GYKI 52466 не влияло на повреждающий эффект перекиси водорода. ЦПГ достоверно повышал жизнеспособность клеток в присутствии перекиси водорода, чего не наблюдалось в случае предварительного внесения неконкурентного антагониста GYKI 52466.

Рис. 3.

Неконкурентный антагонист AMPA-рецепторов GYKI 52466 снимает нейропротекторное действие ЦПГ на модели окислительного стресса. *– p < 0.05 по сравнению с группой “Контроль”, ^– p < 0.05 по сравнению с группой “H₂O₂”, ^#– p < 0.05 по сравнению с группой “ЦПГ+H₂O₂” (с использованием критерия Краскела–Уоллиса с последующим тестом по Данну (ANOVA)). Данные представлены в виде m ± s.d.

Таким образом, можно полагать, что АМРА-рецепторы включены в механизмы нейропротекторной активности ЦПГ.

Блокатор Trk-рецепторов K-K252a и ЦПГ по отдельности или вместе не приводили к изменениям жизнеспособности в культуре клеток HT-22 (рис. 4). Соединение K252a не изменяло характера действия перекиси водорода. ЦПГ достоверно восстанавливал жизнеспособность клеток, что полностью снималось предварительным внесением K252a.

Рис. 4.

Блокатор Trk-рецепторов K252a снимает нейропротекторное действие ЦПГ на модели окислительного стресса.

*– p < 0.05 по сравнению с группой “Контроль”, ^– p < 0.05 по сравнению с группой “H₂O₂”, ^#– p < 0.05 по сравнению с группой “ЦПГ+H₂O₂” (с использованием критерия Манна–Уитни).

Данные представлены в виде m ± s.d.

Полученные данные свидетельствуют в пользу участия BDNF/TrkB сигналинга в нейропротекторной активности ЦПГ.

Совокупность полученных результатов позволяет сделать заключение об участии опосредованного AMPA-рецепторами TrkB-зависимого сигналинга в нейропротекторном действии ЦПГ, который, вероятно, является эндогенным модулятором АМРА-рецепторов.