Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2023, T. 508, № 1, стр. 41-44

В настоящее время использование генетически модифицированных NK-клеток является перспективной стратегией противоопухолевой иммунотерапии [1]. Однако на пути реализации этой стратегии необходимо преодолеть ряд проблем [2], в частности, получить возможность наработки требуемого количества трансдуцированных NK-клеток. Существует множество субпопуляций NK-клеток, которые могут различаться по пролиферативному потенциалу и восприимчивости к генетической вирусной трансдукции [3]. Поиск сочетания субпопуляционных NK-клеточных маркеров, способных предсказать получение большего количества трансдуцированных NK-клеток, является актуальной биологической задачей. Использование в иммунотерапии адаптивных NK-клеток, способных атаковать клетки-мишени при повторной встрече с антигенами цитомегаловируса человека (HCMV), представляется перспективным подходом к решению указанной задачи, поскольку такие клетки, наряду с противоопухолевым действием, могут помочь в сдерживании реактивации персистирующего у большинства пациентов вируса HCMV [4]. Типичные адаптивные NK-клетки являются высокодифференцированными, CD57-позитивными, NKG2A-негативными и несут на поверхности рецепторы семейства KIR [5]. Известно, что в процессе дифференцировки NK-клетки, начинающие экспрессировать ингибирующие рецепторы KIR, приобретают “лицензию” на выполнение цитотоксических функций путем распознавания главного комплекса гистосовместимости класса I [6]. Использование субпопуляции адаптивных NK-клеток, прошедших стадию “лицензирования”, может повысить иммунотерапевтическую эффективность NK-клеток. Целью данной работы являлось изучение субпопуляционной гетерогенности NK-клеток при проведении генетической модификации.

Образцы венозной крови были забраны у здоровых доноров, давших устное информированное согласие на участие в исследовании. Популяцию NK-клеток выделяли с помощью магнитной сепарации из фракции мононуклеаров. Для стимуляции NK-клеток использовали методику культивирования in vitro с IL-2 и предварительно облученными модифицированными фидерными клетками К562-mbIL21 [7]. Для модификации использовали ретровирусные частицы, несущие на поверхности белок RD114. Эффективность трансдукции измеряли по уровню экспрессии репортерного белка GFP методом проточной цитофлуориметрии. В работе были проанализированы NK-клетки 16 здоровых добровольцев.

После стимуляции in vitro в течение 7 дней большинство NK-клеток экспрессировали маркер активации HLA-DR. Полученные культуры имели низкое содержание клеток CD57⁺ и повышенное NKG2A⁺, что характерно для слабодифференцированных NK-клеток. Большая часть NK-клеток экспрессировала также активирующие рецепторы CD16 и NKp30. Вместе с низким уровнем CD57 у части стимулированных клеток наблюдалась значительная экспрессия активирующего рецептора NKG2C, маркера специализированной субпопуляции NK-клеток – адаптивных NK-клеток. Предположительно NK-клетки CD57^–NKG2C⁺ избирательно пролиферировали в ответ на использованные стимулы. Однако мы не исключаем возможность частичной потери экспрессии CD57 NK-клетками с исходным фенотипом NKG2C⁺CD57⁺, так как на клональном уровне было показано, что высокодифференцированные NK-клетки CD57^bright могут утрачивать экспрессию CD57 [8].

Данные по эффективности трансдукции NK-клеток были получены через 7 дней после их заражения вирусными частицами с использованием проточной цитометрии и последующего гейтирования. Так как после трансдукции большинство NK-клеток экспрессировало активирующие рецепторы CD2, CD16, NKG2D и маркер активации HLA-DR, сравнение уровня трансдукции в субпопуляциях, различающихся по экспрессии указанных маркеров, не проводилось.

Поскольку миграционный потенциал NK-клеток в опухоль в значительной степени регулируется хемокинами [9], нами была проведена оценка эффективности трансдукции NK-клеток, экспрессирующих различные хемокиновые рецепторы. Повышенный уровень трансдукции был выявлен у NK-клеток, экспрессирующих хемокиновые рецепторы CXCR3, CXCR4 и CCR7 (рис. 1а).

Рис. 1.

Сравнение эффективности заражения вирусными частицами различных субпопуляций NK-клеток, измеренное по уровню флуоресценции репортерного белка GFP через 7 дней после процедуры трансдукции. Статистический анализ был проведен с использованием парного Т-теста. (а, б) – Данные нормализованы на уровень экспрессии GFP в соответствующей негативной субпопуляции (у.е. – условные единицы), (а) – данные получены методом гейтирования клеток, n = 16. (б, в) – данные по экспрессии GFP получены на клетках, выделенных методом сортировки, (б) – n = 8, (в) – n = 4.

Ранее нами была продемонстрирована низкая эффективность трансдукции отсортированных NK-клеток с фенотипом CD57⁺ [10]. Однако при модификации общей популяции NK-клеток большее процентное содержание GFP-позитивных клеток было зарегистрировано в субпопуляции CD57⁺ (рис. 1а) по сравнению с CD57-негативной субпопуляцией. По-видимому, это связано с увеличением экспрессии CD57 NK-клетками после процедуры трансдукции. В то же время увеличенная эффективность ретровирусной модификации была выявлена во фракции NK-клеток с фенотипом NKG2C⁺ (рис. 1а).

Большее процентное содержание GFP⁺ клеток наблюдалось в субпопуляции KIR2DL2/DL3⁺ (KIR⁺) по сравнению с KIR-негативной (рис. 1А). Причиной выявленного различия может быть как более высокая скорость пролиферации KIR⁺NK-клеток после процедуры трансдукции, так и лучшая восприимчивость KIR⁺NK-клеток к ретровирусной модификации. Для выяснения причины указанных различий свежевыделенные NK-клетки были поделены на фракции KIR⁺ и KIR^– с помощью клеточной сортировки, простимулированы и подвергнуты ретровирусной трансдукции по вышеописанной методике. Анализ данных показал значительное увеличение эффективности заражения отсортированных NK-клеток субпопуляции KIR⁺, по сравнению с отсортированными NK-клетками из субпопуляции KIR^– (рис. 1б). Так как после 7-дневного культивирования трансдуцированных клеток не наблюдалось увеличения доли GFP⁺ в субпопуляции KIR⁺, гипотеза о более высокой скорости пролиферации модифицированных NK-клеток с фенотипом KIR⁺ была исключена. Это позволило сделать вывод о существовании связи между эффективностью трансдукции NK-клеток и уровнем поверхностной экспрессии рецепторов KIR.

Часть NK-клеток с фенотипом CD57^–NKG2A^–NKG2C⁺ обладает чертами адаптивных NK-клеток и может являться их предшественниками [11]. В данной работе CD57-негативные NK-клетки были отсортированы с учетом наличия на их поверхности рецепторов NKG2A, NKG2C и KIR2DL2/3. Показано, что через 7 дней культивирования в субпопуляции CD57^–KIR⁺NKG2C⁺ значительно большая доля клеток экспрессировала маркер CD57 de novo [12]. По-видимому, часть этих NK-клеток является адаптивными клетками, также характеризующимися наличием CD57. Было проведено сравнение эффективности трансдукции отсортированных субпопуляций KIR^–NKG2C⁺, KIR⁺NKG2C^– и KIR⁺NKG2C⁺ (рис. 1В). Наибольшая восприимчивость к модификации зарегистрирована в клетках, полученных из субпопуляции KIR⁺NKG2C⁺.

Полученные данные послужат обоснованием к более четкому выбору субпопуляций NK-клеток для генетической модификации с целью их потенциального использования в таргетной противоопухолевой терапии.